Introduction
Dopaminérgico (DA), las neuronas se pueden encontrar en varias regiones del cerebro, incluyendo el cerebro medio, el hipotálamo, la retina y bulbos olfativos. Las neuronas A9 de DA en la substantia nigra pars compacta (SNpc) controlar el comportamiento y el movimiento mediante la proyección en el cuerpo estriado en el cerebro anterior y formando el sistema motor extrapiramidal. La degeneración de las neuronas DA A9 conduce a la enfermedad de Parkinson (PD), que es el segundo trastorno neurodegenerativo más común humano y actualmente incurable. Terapia de reemplazo celular es una de las estrategias más prometedoras para el tratamiento de la EP 1, por lo tanto, ha habido un gran interés en la obtención de las neuronas DA A9 a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y el células recientes de origen humano madre pluripotentes (hiPSCs).
Muchas investigaciones han tratado de derivar neuronas DA A9 de hPSCs utilizando diversos métodos. Los primeros informes de todas las neuronas DA generados a través de una neuraletapa progenitor roseta. Por co-cultivo con MS5 2 o PA6 3-5 células estromales con o sin factores de crecimiento externo para 2-4 semanas, L. Studer y colegas y otros tres grupos inducidos con éxito hESCs para producir rosetas neuronales. A continuación, enriquecidos estas rosetas por la disección mecánica o digestión enzimática para su posterior diferenciación. En otros informes, los investigadores generaron rosetas neuronales a través del cuerpo embrioide (EB) la diferenciación de la cultura 6.9 flotantes. Más tarde, los investigadores establecieron un método de diferenciación monocapa basada 10,11, donde se sembraron hESCs y hiPSCs en matriz extracelular, añadieron diferentes factores de crecimiento en el cultivo para inducir la diferenciación de hPSCs a las neuronas DA, que imita el desarrollo in vivo de las neuronas DA en embrionario . Aunque todos estos estudios obtuvieron tirosina hidroxilasa (TH) células que expresaban con algunas características de las neuronas DA, todo el proceso de diferenciación es que consume tiempo y trabajo,generalmente ineficientes, y más importante, la identidad A9 de estas neuronas no se demostró en la mayoría de los estudios, excepto el uno con LMX1A expresión ectópica 12. Recientemente, una nueva placa de piso (FP) basada en protocolo se desarrolló 13-16, en el que los precursores de PF con potencial de neuronas DA se generaron por primera vez por la activación de la erizo sónico y las vías canónicas de señalización Wnt durante la etapa temprana de la diferenciación, y luego estas células de PF se especificaron aún más a las neuronas DA. Aunque este protocolo es más eficiente, todavía hay algunos problemas; por ejemplo, todo el proceso de diferenciación toma mucho tiempo (al menos 35 días) y es alimentador celular dependiente 15, o es dependiente de EB 16 o la identidad A9 no se demostró 14.
Aquí, a partir del conocimiento de in vivo el desarrollo de las neuronas DA embrionario y resultados publicados de otros investigadores, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la efciente generación de neuronas DA de ambos hESCs y hiPSCs. Se generó por primera vez las células precursoras FP por la activación de la señalización de Wnt canónica con la pequeña molécula de CHIR99021 y sonic hedgehog de señalización con moléculas pequeñas SAG y purmorphamine. Estas células expresan FP FOXA2, LMX1A, CORIN, OTX2 y Nestin. A continuación, especificamos estas células FP a las neuronas DA con factores de crecimiento incluyendo BDNF, GDNF, etc. Las neuronas DA generados son del tipo de células A9 ya que son positivos para GIRK2 mientras negativo para Calbindin 17. Este protocolo es de células de alimentación o EB independiente, altamente eficiente y reproducible. El uso de este protocolo, se puede derivar neuronas DA en menos de 4 semanas a partir de hESCs o hiPSCs de las personas normales para el estudio de trasplante de células, o de hiPSCs de los pacientes con EP para el modelado in vitro de la EP o probar agentes terapéuticos potenciales para la EP.
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Protocol
1 Preparación de Medios de Cultivo
- Preparar fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) medio combinando lo siguiente: 445 ml de DMEM, 50 ml de suero bovino fetal (FBS), y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución madre. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 14 días.
- Preparar medio de cultivo HPSC combinando lo siguiente que contiene suero: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de suero de reemplazo knockout (KSR), 5 ml 100x solución no esencial solución de aminoácidos de stock, 5 ml 100x penicilina / ampicilina de stock, 5 ml 100x mercaptoetanol solución madre, y 10 ng / ml de bFGF. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días.
- Preparar medio libre de suero mTeSR1 combinando lo siguiente: 400 ml mTeSR1 medio basal, 100 ml 5x suplemento, y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga medio a 4 ° C durante no más de 10 días.
- Preparar 10x colagenasa solución IV existencia: pésense 0,5 g potencia colagenasa IV, ydisolver con 50 ml de DMEM / F12 y esterilizar filtro. Hacer alícuotas y almacenarlos a -20 ° C durante meses.
- Prepare la solución de gelatina al 0,1%: Pesar 0,5 g de gelatina (de piel bovina, tipo B) de potencia y se disuelven con agua desionizada. Mantenga autoclave solución esterilizada a temperatura ambiente durante semanas.
- Preparar medio de diferenciación KSR combinando lo siguiente: 410 ml de DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x solución no esenciales de aminoácidos de stock, 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución madre, 5 ml 100x solución madre mercaptoetanol. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días.
NOTA: KSR varía de un lote a otro, lo que puede afectar a la eficiencia de la diferenciación. Por tanto, es mejor probar varios lotes de KSR para encontrar el mejor para la diferenciación. - Preparar medio de diferenciación N2 mediante la combinación de lo siguiente: 98 ml de DMEM, 1 ml suplemento N2 100x y 100x 1 ml de penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga el filtro de medio esterilizado en 4° C durante no más de 10 días.
- Preparar medio de diferenciación B27 mediante la combinación de lo siguiente: medio neurobasal 480 ml, 10 ml 50x suplemento B27, 5 ml 100x solución madre glutamax, y 5 ml 100x penicilina / ampicilina solución stock. Mantenga el filtro de medio esterilizado a 4 ° C durante no más de 10 días.
2. Cultura de hESCs y hiPSCs sobre células alimentadoras MEF
Los H9 hESCs se obtuvieron de Research Institute WiCell hiPSCs y se establecieron en el laboratorio Reijo Pera través de la transducción mediada por retrovirus de Yamanaka factores de OCT3 / 4, Sox2, Klf4 y c-MYC 18.
- Al menos un día antes de la aprobación de células, preparar algunos platos de gelatina mediante la adición de 1 ml de 0,1% de gelatina al 1 pocillo de placas de 6 pocillos, y las placas se incuban a 37 ° C durante al menos 30 min.
- Después de la incubación, aspirado de gelatina a partir de las placas, y las semillas de la irradiación inactivada MEF células en las placas a una densidad de 1,6 x 10 5 células/ Pocillo en medio MEF usando un hemocitómetro para contar las células.
NOTA: Opcionalmente preparar alimentadores MEF tan pronto como 3 días antes de la aprobación de la célula. - Células Passage un día después de enchapado alimentadores MEF: medianas aspirado desde hPSCs, añadir 1 mg / ml de colagenasa IV a las células en 1 ml / pocillo, y se incuban las células a 37 ° C durante 1 hora.
- Durante esta incubación, lavar alimentadores MEF una vez con PBS, y luego agregar agua tibia (37 ° C) medio de cultivo que contiene suero HPSC a 1,5 ml / pocillo.
- Después de 1 hora, toque en la placa de cultivo de un par de veces, así que la mayoría de las colonias indiferenciadas se desprenda de las placas, mientras que las colonias diferenciadas permanecen unidos. Recoger cuidadosamente las colonias flotantes, y transferirlos al tubo de 15 ml.
- Lave suavemente la placa una vez con agua caliente (37 ° C) DMEM / F12 y transferir DMEM / F12 en el mismo tubo de 15 ml.
- Centrifugar los tubos a 179 xg durante 3 min.
- Aspirar medio de los tubos, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Añadir guerramedio de cultivo m HPSC, pipetear las células arriba y abajo varias veces para romper en pequeños grupos y mezclar bien.
- Transferir las células sobre nuevos alimentadores MEF en 1: 3-1: 6 relación.
- Cambie el medio todos los días y el paso de las células cada 5-6 días.
3. Preparación de las células para la diferenciación
- Al menos un día antes de la preparación de las células, preparar algunos platos de Matrigel (típicamente 3 pocillos de una placa de 6 pocillos). Diluir el Matrigel con frío (4 ° C) DMEM / F12 a las 1:40 y se añade 1 ml de Matrigel por pocillo de placas de 6 pocillos. Incubar las placas Matrigel a 4 ° C durante la noche. NOTA: Se puede sellar placas Matrigel con Parafilm y almacenarlos a 4 ° C durante todo el tiempo de una semana.
- Usar células (ver paso 2) 4 días después del pasaje. Retire todas las colonias diferenciadas de las placas. Aspirar medio de la placa de cultivo, añadir 1 ml accutase por pocillo, y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min.
- Durante la incubación, preparar algunos gelmérica placas mediante la adición de 1 ml de gelatina al 1 pocillo de placas de 6 pocillos. Coloque estos platos y los Matrigel placas preparadas un día antes en la incubadora.
- Después de la incubación de 5 min o cuando las células se han convertido en semi-flotante, las células de la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para hacerlos en células individuales.
- Recoger las células individuales en tubos de 15 ml y centrifugar a 258 xg durante 3 min.
- Resuspender las células con cantidad apropiada de suero que contiene medio de cultivo HPSC, y añadir Thiazovivin a la concentración final de 2 mM.
- Células de transferencia sobre placas recubiertas con gelatina en 1: 1, e incubar las células a 37 ° C durante 30 min para eliminar los alimentadores del MEF.
- Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml, añadir el suero que contiene medio apropiado HPSC y contar las células con un hemocitómetro.
- Centrifugar las células a 258 xg durante 3 min.
- Durante centrífuga, añadir Thiazovivin apropiarse medio mTeSR1 para hacer una concentración de 2 mM.
- Después de centrifugación, unaespirar el medio y añadir medio mTeSR1 apropiado con Thiazovivin modo que hay 1,8 x 10 5 células / ml de medio.
- Saque las placas Matrigel de la incubadora, aspirar el Matrigel y añadir 2 ml de las células mixtas en 1 pocillo de las placas de 6 pocillos.
NOTA: La densidad celular debe ser de 3,6 x 10 4 células / cm 2 de superficie. - Vuelva a poner las placas de nuevo a la incubadora, y dejar que las células se adhieren durante 24 horas.
- 24 horas después de la siembra de las células, aspirar medio de edad y añadir 2 ml nuevo medio mTeSR1 por pozo y dejar que las células crezcan durante otras 24 horas antes de iniciar la diferenciación.
Diferenciación Celular
- Iniciar diferenciación 48 horas después de resiembra las células en placas Matrigel.
- Aspirar el medio de cultivo de la placa, lavar las células una vez con PBS, y añadir 2 ml del siguiente medio de diferenciación por pozo: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 mM SB431542 y 100 nM LDN-193189. Marcar este día como D0 de diferenciación.
- Cambie medio todos los días de D0 a D20.
NOTA: Se puede preparar el medio para el uso no más de 2 días a la vez. - Utilice el siguiente medio para D1 y D2: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, 2 M purmorphamine, y 50 ng / ml FGF8b.
- Utilice el siguiente medio para D3 y D4: medio de diferenciación KSR suplementado con 10 M SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, 2 M purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, y 3 M CHIR99021.
- Utilice el siguiente medio de D5 y D6: 75% medio de diferenciación KSR más el 25% medio de diferenciación N2 suplementado con 100 nM LDN-193189, 0,25 M SAG, purmorphamine 2 M, 50 ng / ml FGF8b, y 3 M CHIR99021.
- Utilice el siguiente medio de D7 y D8: 50% medio de diferenciación KSR más el 50% medio de diferenciación N2 complementado con 100 nM LDN-193189 y 3 M CHIR99021.
- Utilice el siguiente medio de D9 y D10: 25% medio de diferenciación KSR más el 75% medio de diferenciación N2 complementado con 100 nM LDN-193189 y 3 M CHIR99021.
- Utilice el siguiente medio para D11 y D12: B27 diferenciación medio suplementado con 3 mM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml de GDNF, 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM y 0,1 mM cAMP.
- Utilice el siguiente medio para el resto de la diferenciación: medio de diferenciación B27 suplementado con 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml de GDNF, 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM y 0,1 mM cAMP.
- A eso de D16 de la diferenciación, preparar algunos platos / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Diluir poli-L-ornitina solución madre con el frío (4 ° C) PBS a 15 mg / ml, añadir 1 ml a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche.
- Aspirar la solución de poli-L-ornitina, lavar las placas 3 veces con agua estéril y luego secar al aire las placas.
- Diluir la laminina de stock sollución de frío (4 ° C) PBS a 1 mg / ml, añadir 1 ml a un pocillo de placas de 6 pocillos, e incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
- Aspirar la solución de laminina, lavar las placas 3 veces con agua estéril y luego secar al aire las placas.
- Diluir la solución de fibronectina de stock de frío (4 ° C) PBS a 2 mg / ml, añadir 1 ml a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las placas a 37 ° C durante la noche.
- Placas sello con Parafilm y colocarlos a 4 ° C durante hasta dos semanas.
- Después de 20 días de diferenciación, replate las células a las placas / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Medio de diferenciación Aspirar, añadir 1 ml caliente (37 ° C) Accutase a 1 pocillo de placas de 6 pocillos y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min.
- Durante la incubación, colocar las placas / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina en la incubadora.
- Después de la incubación de 5 min o cuando las células se han convertido en semi-flotantes, suavemente las células de pipeta hacia arriba y abajo varias veces aconvertirlas en células individuales.
- Recoger las células individuales en tubos de 15 ml cónicos, y añadir la cantidad apropiada de medio neurobasal para el recuento celular, que variará dependiendo de expansión (después de 11 días de diferenciación, las células pueden expandirse 15-20 veces). Contar las células utilizando un hemocitómetro.
- Centrifugar las células a 258 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células con medio de diferenciación B27 de manera que la concentración de células es de 1 x 10 6 células / ml de medio.
- Aspirar fibronectina de las placas, lavar dos veces con PBS, y añadir 2 ml de células a 1 pocillo de placas de 6 pocillos.
NOTA: La densidad celular para replating debe ser de 2 x 10 5 células / cm 2 de superficie. - Cambie medio 24 horas más tarde para eliminar las células muertas sin ataduras.
- Cambio de medio cada dos días hasta los puntos de tiempo deseados para un experimento dado.
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Representative Results
Una visión general del protocolo de diferenciación se muestra en la Figura 1. La eficiencia del protocolo de diferenciación que aquí se presenta se basa en el estado de las células de partida. Por lo tanto, es crítico para asegurarse de que, primero uno elimina todas las colonias diferenciadas antes de disociarse hPSCs en células individuales para la diferenciación, y segundo, uno agota la mayoría, si no todas, las células alimentadoras MEF mediante la incubación de las células en placas recubiertas con gelatina durante 30 min, y tercero, uno placas de las células individuales HPSC a la densidad apropiada sobre la placa de Matrigel. Como se ilustra en la Figura 2, replated células individuales HPSC se expandirán como racimos durante la 48 horas antes de la diferenciación, la formación de alrededor de 70% de confluencia en las placas. Luego, después de la diferenciación, estas células alcanzar la plena confluencia en tan corto como 3-4 días, ya partir de alrededor de D16-D17, estas células confluentes empezar a hacer algunos espacios en los platos, y algunos axones / neuritas ya podíase observa en estos espacios y en las capas de células. Después de ser replated en D20, las células diferenciadas unidas y crecieron como pequeños grumos. Luego, durante los próximos 5 días, los axones mucho más intensivos y morfológicamente intactas / neuritas salen de las matas, y axones / neuritas de diferentes macizos forman algunas conexiones. Durante el cultivo a largo plazo, las neuronas en un macizo generar más extensiones, obtener más maduro y tiene más conexiones con las neuronas en macizos vecinos.
Después de 11 días de diferenciación, hPSCs se podrían convertir de manera eficiente a los precursores de PF, y como se ilustra en la Figura 3, casi todas las células expresan el precursor FP marcadores de células nestina y FOXA2, y más del 90% de las células expresan otros tres marcadores CORIN, OTX2 , y LMX1A. Luego, después de más días de diferenciación, las células precursoras de PF se especifican para las neuronas DA ya que expresan Tuj1 y TH (Figura 4A). Estas neuronas DA y de la identidad A9 ya que EXPRESs GIRK2 mientras que son negativos para Calbindin (Figura 4B). Inmunoticción experimentos también demuestran que no hay GFAP + astrocitos y muy pocas neuronas GABAérgicas (Figura 4C), lo que indica que la diferenciación se especifica exclusivamente hacia la neurona linaje DA.
Figura 1 Descripción general del protocolo de diferenciación, con factores de crecimiento / pequeñas moléculas y medio de cultivo utilizado para cada día. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. morfológicaal cambia durante la diferenciación. hESCs H9 se sembraron como células individuales en la densidad celular apropiada tal como se describe, y 48 horas después de eso, estas células alcanzan aproximadamente el 70% de confluencia en la placa como colonias (D0). Durante los primeros pocos días de diferenciación, las células se expanden rápidamente, alcanzando más de 90% de confluencia después de 24 horas de diferenciación (D1), y luego se convierten en confluencia después de 48 horas más (D3). Sin embargo, la mayoría de estas células todavía exhiben morfología hESC típico con alta núcleo al citoplasma (D3). Como la diferenciación continúa, las células se expanden más y pierden gradualmente hESC morfología. Al final de D11 de diferenciación, hay más de una capa de células en muchas partes de la placa, como se evidencia por el color más oscuro de células en algunas áreas que en los otros (D11). A partir de D17 a D20, algunas células murieron, dejando algunos espacios en la placa, y algunas proyecciones de las neuronas ya se podían observar en estos espacios unand veces bajo la capa de células (D20). Después replating celular al final del D20 para hacer más espacios para que las células crezcan y diferenciación, las células se agregan como pequeños grupos, mucho más axones / neuritas emergen de estos grupos, y los axones / neuritas de diferentes grupos forman algunas conexiones en tan corto como sea 4-5 días (D25). Barra de escala, 200 m.
Figura 3. inmunotinción para marcadores de PF en la etapa temprana de la diferenciación de hESCs. H9 se diferenciaron durante 11 días utilizando el protocolo descrito aquí. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100, se bloquearon con suero de burro y después se tiñeron para los marcadores de células precursoras de PF. Como se muestra aquí, casi todas las células expresan nestina y FOXA2, y más del 90% de las células expresan LMX1A, CORIN, yOTX2, lo que indica una muy alta eficiencia de conversión de hESCs a células de PF. Barra de escala, 200 m.
Figura 4. inmunotinción para marcadores de neuronas DA en las últimas etapas de la diferenciación. (A) hESCs H9 se diferenciaron durante 25 días, y las células fueron objeto de inmunotinción para la Tuj1 marcador pan-neurona y la DA marcador de neuronas TH comúnmente utilizado. Como se muestra aquí, aunque hay más células positivas Tuj1 que las células positivas TH, todas las células que expresan TH-residuo en las células que expresan Tuj1, y las células que expresan TH-representan al menos la mitad de todas las células. (B). Los hESCs H9 se diferenciaron aún más durante otros 25 días (en total 50 días) y luego las células fueron sometidas a inmunotinción. Los resultados mostraron que existe un mayor porcentaje de TH-que expresan las células Thuna que al d25. Casi la totalidad de estas células TH-expresando también expresar GIRK2 mientras que la mayoría de ellos son negativos para Calbindin, indicando la identidad de subtipo A9 de las neuronas DA generados, que es el tipo de célula que se pierde en la EP. (C) La inmunotinción para células a D25 de la diferenciación mostró que no hay células que expresan GFAP, y muy pocas células expresan GABA. Barra de escala, 200 m.
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Discussion
Células madre pluripotentes humanos (incluyendo tanto hESCs y hiPSCs) pueden diferenciarse in vitro para generar la mayoría, si no todos, los tipos de células de nuestro cuerpo incluyendo las neuronas DA, que se ha demostrado en estudios previos 19. Aquí, basado en el conocimiento del desarrollo de neuronas dopaminérgicas embrionarias 20 y protocolos publicados de otros laboratorios 14,15, hemos optimizado las condiciones de cultivo para la generación de neuronas DA de hESCs y hiPSCs. Este protocolo es eficiente, reproducible y hemos aplicado con éxito este protocolo descrito aquí para H1 y H9 hESC líneas y para las líneas hiPSC tanto de los pacientes con EP y controles no afectados.
En nuestro protocolo, hay tres pasos claves para obtener la máxima eficiencia de diferenciación: En primer lugar, no debe haber colonias HPSC diferenciadas en la diferenciación de las células antes de lo indicado. Como la diferenciación espontánea de las tres capas germinales se ve a menudo en hCultura PSC, es importante eliminar estas colonias diferenciadas antes de disociarse estos hPSCs en células individuales. En segundo lugar, los alimentadores del MEF deben ser agotados desde los hPSCs disociadas, como los informes anteriores han demostrado que las células MEF pueden los factores secretos que promueven la auto-renovación y diferenciación inhiben 21. Para este propósito, la incubación de las células MEF HPSC y mezclas en las placas recubiertas con gelatina durante 30 minutos debería ser suficiente para eliminar casi todas las células MEF. En tercer lugar, los hPSCs individuales deberán colocaron en placas a la densidad celular apropiada para la diferenciación. El aumento de la densidad de las células dará lugar a la muerte de la mayoría de las células en torno a D11 de la diferenciación, mientras que la reducción de la densidad de las células dará lugar a la separación y la muerte de las células en el centro de la placa en tan corto como menos de 7 días, aunque en las células el borde diferenciará también (datos no mostrados). Si se observa todos estos tres criterios, es fácil de obtener de manera eficiente las neuronas DA de hPSCs con nuestro protocolo paso a paso.
El protocolo que aquí se presenta se basa principalmente en un informe anterior por L. Studer y colegas 14 con algunas modificaciones. En primer lugar, la diferenciación de aquí se inició 48 horas después de una sola chapado celular cuando las células alcanzan sólo el 70% de confluencia, mientras que en su informe, la diferenciación se inició cuando las células alcanzan la confluencia completa (3 o más días de cultivo después de una sola célula chapado). En nuestra experiencia, a partir de la diferenciación de las células confluentes sin un pasaje celular hasta el día 20 conduce a la muerte celular severa durante el proceso de diferenciación. En segundo lugar, se sustituye la proteína SHH caro en su estudio con SAG, una pequeña molécula que contiene agonista clorobenzotiofeno-para HH vía 22. Por lo tanto, en comparación con los protocolos publicados anteriormente, éste se describe aquí es de células de alimentación y roseta neural independiente, y se basa principalmente en pequeñas moléculas para la especificación de FP; por lo que es menos costoso y menos tiempo y mano de obra que consume. Por supuesto, el limitation de este protocolo es el uso de KSR durante los primeros días de la diferenciación. KSR varía de un lote a otro, lo que puede afectar a la eficiencia de la diferenciación. Por lo tanto, uno debe probar diferentes lotes de KSR para obtener el que mejor funciona en la inducción de los precursores de PF después de 11 días de diferenciación.
En resumen, el protocolo de diferenciación descried aquí debe facilitar: (1) la generación de neuronas DA de hESCs o hiPSCs de las personas normales para la terapia de reemplazo celular para PD; (2) la generación de neuronas DA de PD iPSCs paciente para el modelado in vitro y pruebas de potenciales fármacos terapéuticos para la EP; (3) el estudio de los genes / las vías de señalización que regulan el desarrollo de las neuronas DA humano.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
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