Introduction
Dopaminerga (DA) nervceller kan hittas i flera delar av hjärnan, inklusive mellanhjärnan, hypotalamus, näthinnan, och luktsinnet glödlampor. De A9 DA nervceller i substantia nigra pars compacta (SNPC) kontrollbeteende och rörelse genom att projicera till striatum i framhjärnan och bildar det extrapyramidala motoriska systemet. Degeneration av A9 DA nervceller leder till Parkinsons sjukdom (PD), som är den näst vanligaste mänskliga neurodegenerativa sjukdomar och idag obotliga. Cell substitutionsbehandling är en av de mest lovande strategier för behandling av PD 1, därför har det funnits ett stort intresse för att härleda A9 DA nervceller från humana pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive både mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och senaste mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs).
Mycket forskning har försökt att härleda A9 DA nervceller från hPSCs med olika metoder. De tidigaste rapporterna alla genererade DA nervceller genom ett neuraltrosett progenitor skede. Genom samodling med MS5 2 eller PA6 3-5 stromaceller med eller utan externa tillväxtfaktorer för 2-4 veckor, L. Studer och kollegor och tre andra grupper framgångsrikt inducerade hESCs att producera neurala rosetter. De berikade då dessa rosetter genom mekanisk dissektion eller enzymatisk nedbrytning för ytterligare differentiering. I andra rapporter, forskare genererade neurala rosetter genom embryoid kropp (EB) flytande kultur differentiering 6-9. Senare etablerade forskare ett monolager baserad differentiering metod 10,11, där de pläterade hESCs och hiPSCs på extracellulär matrix, tillade olika tillväxtfaktorer i kulturen att inducera differentiering av hPSCs till DA-neuroner, som härmar in vivo embryonala DA neuron utveckling . Även om alla dessa studier erhölls tyrosinhydroxylas (TH) -uttryckande celler med vissa egenskaper DA nervceller, är hela differentieringsprocessen tid och arbetskraft krävande,allmänhet ineffektiva, och ännu viktigare, var A9 vilka dessa nervceller inte visat i de flesta studier utom en med Lmx1a ektopisk uttryck 12. Nyligen har en ny golvplatta (FP) baserad protokoll som utvecklats 13-16, där FP prekursorer med DA neuron potential först genereras genom aktivering av Sonic Hedgehog och kanoniska Wnt signaleringsvägar under det tidiga stadiet av differentiering, och sedan Dessa FP celler specificeras ytterligare till DA nervceller. Även om detta protokoll är mer effektiva, finns det fortfarande vissa problem; till exempel, tar hela differentieringsprocessen lång tid (minst 35 dagar) och är matarcellsberoende 15, eller är EB beroende 16 eller A9 identiteten inte visat 14.
Här, på grundval av kunskap från in vivo embryonal DA neuron utveckling och andra forskares publicerade resultat har vi optimerat odlingsbetingelsema för efficient generation av DA-neuroner från både hESCs och hiPSCs. Vi genererade först FP prekursorceller genom aktivering av den kanoniska Wnt signaler med småmolekylära CHIR99021 och Sonic Hedgehog-signalering med små molekyler SAG och purmorphamine. Dessa FP celler uttrycker FOXA2, Lmx1a, CORIN, OTX2 och nestin. Vi sedan specificerat dessa FP celler till DA neuron med tillväxtfaktorer inklusive BDNF, GDNF, osv. De genererade DA nervceller är av A9 celltyp som de är positiva för GIRK2 medan negativ för Calbindin 17. Detta protokoll är matarcell eller EB oberoende, effektiv och reproducerbar. Med hjälp av detta protokoll, kan man härleda DA nervceller i mindre än 4 veckor från hESCs eller hiPSCs normala personer för celltransplantation studie eller från hiPSCs av PD-patienter för in vitro-modellering av PD eller testa potentiella terapeutiska medel för PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av Kultur Media
- Förbered mus embryonala fibroblaster (MEF) medium genom att kombinera följande: 445 ml DMEM, 50 ml fetalt bovint serum (FBS) och 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamlösning. Håll filtersteriliserat temperatur på 4 ° C i högst 14 dagar.
- Förbered seruminnehållande HPSC odlingsmedium genom att kombinera följande: 385 ml DMEM / F12, 100 ml knockout serumersättning (KSR), 5 ml 100x icke-essentiell aminosyrastamlösning, 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamlösning, 5 ml 100x merkaptoetanol stamlösning, och 10 ng / ml bFGF. Håll filtersteriliserat temperatur på 4 ° C i högst 10 dagar.
- Förbered mTeSR1 serumfritt medium genom att kombinera följande: 400 ml mTeSR1 basalmedium, 100 ml 5x komplement, och 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamlösning. Håll temperatur på 4 ° C i högst 10 dagar.
- Förbered 10x kollagenas IV stamlösning: väg upp 0,5 g kollagenas IV makt, ochupplösa den med 50 ml DMEM / F12 och filtrera sterilisera. Gör alikvoter och lagra dem vid -20 ° C i flera månader.
- Bered 0,1% gelatinlösning: väg upp 0,5 g gelatin (från nötkreatur hud, typ B) effekt och lös den med avjoniserat vatten. Håll autoklav steriliserades lösningen vid rumstemperatur i flera veckor.
- Förbered KSR differentieringsmedium genom att kombinera följande: 410 ml DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x icke-essentiell aminosyrastamlösning, 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamlösning, 5 ml 100x merkaptoetanol förrådslösning. Håll filtersteriliserat temperatur på 4 ° C i högst 10 dagar.
OBS: KSR varierar från parti till parti, vilket kan påverka differentiering effektivitet. Därför är det bättre att testa flera partier av KSR för att hitta den bästa för differentiering. - Förbered N2 differentieringsmedium genom att kombinera följande: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 supplement och en ml 100x penicillin / ampicillin stamlösning. Håll filtersteriliserades medium vid 4° C i högst 10 dagar.
- Förbered B27 differentieringsmedium genom att kombinera följande: 480 ml Neurobasal-medium, 10 ml 50x B27 tillskott, 5 ml 100x Glutamax stamlösning, och 5 ml 100x penicillin / ampicillin stamlösning. Håll filtersteriliserat temperatur på 4 ° C i högst 10 dagar.
2 Kultur i hESCs och hiPSCs på MEF matarceller
De H9 hESCs erhölls från WiCell Research Institute och hiPSCs var etablerade i Reijo Pera laboratoriet genom retrovirus-medierad transduktion av Yamanaka faktorer OCT3 / 4, SOX2, Klf4, och c-MYC 18.
- Minst en dag före cellpassage, förbereda några gelatinplattor genom tillsats av 1 ml 0,1% gelatin till en brunn på 6-brunnars plattor och inkubera plattorna vid 37 ° C under minst 30 min.
- Efter inkubation aspirera gelatin från tallrikar och utsädes bestrålning inaktiv MEF celler på plattorna på täthet på 1,6 x 10 5 celler/ Brunn i MEF medium med användning av en hemocytometer för att räkna cellerna.
OBS: Du kan förbereda MEF matare så tidigt som 3 dagar innan cellpassage. - Passage celler en dag efter plätering MEF matare: aspirera medel från hPSCs, tillsätt 1 mg / ml kollagenas IV till celler vid 1 ml / brunn och inkubera cellerna vid 37 ° C under 1 timme.
- Under denna inkubation, tvätta MEF matare gång med PBS, och sedan lägga till varm (37 ° C) seruminnehållande HPSC odlingsmedium vid 1,5 ml / brunn.
- Efter 1 timme, knacka på odlingsplattan ett par gånger, så att de flesta av de odifferentierade kolonier lossnar från plattorna, medan de differentierade kolonier sitta kvar. Försiktigt samla flytande kolonierna, och överföra dem till 15 ml tub.
- Tvätta försiktigt plattan en gång med varmt (37 ° C) DMEM / F12 och överföra DMEM / F12 i samma 15 ml rör.
- Centrifugera rören vid 179 xg under 3 min.
- Sug medium från rören, som är noga med att inte störa pelleten. Lägg krigm HPSC odlingsmedium, pipett cellerna upp och ner flera gånger för att bryta dem i små kluster och blanda dem väl.
- Överför cellerna på nya MEF matare vid 1: 3-1: 6-förhållande.
- Ändra mediet varje dag och passage cellerna var 5-6 dagar.
3 Beredning av celler för differentiering
- Minst en dag före beredning av celler, förbereda några Matrigel plattor (typiskt 3 brunnar i en 6-brunnar). Späd Matrigel med kall (4 ° C) DMEM / F12 på 1:40 och tillsätt 1 ml Matrigel per brunn i 6-brunnars plattor. Inkubera Matrigel plattorna vid 4 ° C över natten. ANMÄRKNING: Man kan försegla Matrigel plattor med Parafilm och lagra dem vid 4 ° C under så länge som en vecka.
- Använd celler (se steg 2) 4 dagar efter passage. Ta bort alla de differentierade kolonier från plattorna. Aspirera medium från odlingsplattan, tillsätt 1 ml Accutase per brunn och inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 min.
- Under inkubation, förbereda några gelAtin plattorna genom att lägga till 1 ml gelatin till en brunn på 6-brunnars plattor. Placera dessa plåtar och Matrigel plåtarna beredda en dag före i kuvös.
- Efter 5-minuters inkubation eller när cellerna har blivit halvflytande, för att pipettera celler upp och ner flera gånger göra dem till enskilda celler.
- Samla enstaka celler i 15 ml rör och centrifugera vid 258 xg under 3 min.
- Återsuspendera cellerna med lämplig mängd serum innehållande HPSC odlingsmedium, och lägga Thiazovivin till slutlig koncentration av 2 | iM.
- Överför celler på gelatinbelagda plattor vid 1: 1-förhållande, och inkubera cellerna vid 37 ° C under 30 min för att avlägsna MEF matare.
- Överför cellerna till en 15 ml koniskt rör, tillsätt lämplig serum innehållande HPSC medium och räkna cellerna med hemocytometer.
- Centrifugera cellerna vid 258 xg under 3 min.
- Under centrifug, lägg Thiazovivin till lämpliga mTeSR1 medium för att göra en koncentration av 2 M.
- Efter centrifugering, enspirate mediet och tillsätt lämplig mTeSR1 medium med Thiazovivin så att det finns 1,8 x 10 5 celler / ml medium.
- Ta ut Matrigel plattorna från inkubatorn, aspirera Matrigel och tillsätt 2 ml av de blandade celler på 1 brunn på 6-brunnar.
OBSERVERA: Celldensiteten bör vara 3,6 x 10 4 celler / cm 2 ytarea. - Återgå plattorna tillbaka till inkubatorn, och låta cellerna fästa under 24 tim.
- 24 h efter plätering av cellerna, aspirera gamla medium och tillsätt 2 ml ny mTeSR1 medium per brunn och låt celler växer i ytterligare 24 timmar innan differentiering.
Cell Differentiation
- Börja differentiering 48 tim efter omstryka cellerna på Matrigel plattor.
- Sug odlingsmedium från plattan, tvätta cellerna en gång med PBS och tillsätt 2 ml av följande differentieringsmedium per brunn: KSR differentiering medium kompletterat med 10 ^ M SB431542 och 100 nM LDN-193189. Markera denna dag som D0 differentiering.
- Ändra medel varje dag från D0 till D20.
ANMÄRKNING: Man kan framställa medium för användning inte mer än 2 dagar i taget. - Använd följande medium för D1 och D2: KSR differentiering medium kompletterat med 10 | iM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 pM SAG, 2 pM purmorphamine, och 50 ng / ml FGF8b.
- Använd följande medium för D3 och D4: KSR differentiering medium kompletterat med 10 | iM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 pM SAG, 2 pM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b och 3 pM CHIR99021.
- Använd följande medium för D5 och D6: 75% KSR differentiering medium plus 25% N2 differentiering medium kompletterat med 100 nM LDN-193.189, 0,25 pM SAG, 2 pM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b och 3 pM CHIR99021.
- Använd följande medium för D7 och D8: 50% KSR differentiering medium plus 50% N2 differentiering medium kompletterat med 100 nM LDN-193189 och 3 ^ M CHIR99021.
- Använd följande medium för D9 och D10: 25% KSR differentiering medium plus 75% N2 differentiering medium kompletterat med 100 nM LDN-193.189 och 3 pM CHIR99021.
- Använd följande medium för D11 och D12: B27 differentiering medium kompletterat med 3 | iM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM askorbinsyra och 0,1 mM cAMP.
- Använd följande medium för resten av differentiering: B27 differentiering medium kompletterat med 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM askorbinsyra och 0,1 mM cAMP.
- Vid ungefär D16 differentiering, förbereda några Poly-L-ornitin / laminin / fibronektin plattor. Späd Poly-L-ornitin-stamlösning med kall (4 ° C) PBS till 15 ^ g / ml, tillsätt 1 ml till en brunn i 6-brunnars plattor och inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- Aspirera Poly-L-ornitin-lösning, tvätta plattorna tre gånger med sterilt vatten och sedan lufttorka plattorna.
- Späd laminin lager solmepannor med kall (4 ° C) PBS till 1 | ig / ml, tillsätt 1 ml till en brunn i 6-brunnars plattor och inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- Aspirera laminin lösning, tvätta plattorna tre gånger med sterilt vatten och sedan lufttorka plattorna.
- Späd fibronektin stamlösningen med kall (4 ° C) PBS till 2 ^ g / ml, tillsätt 1 ml till en brunn i 6-brunnars plattor och inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- Seal plattorna med parafilm och placera dem vid 4 ° C under så lång tid som två veckor.
- Efter 20 dagar av differentiering, förnyad utbredning cellerna till poly-L-ornitin / laminin / fibronektin plattor. Aspirera differentieringsmedium, tillsätt 1 ml varm (37 ° C) Accutase till en brunn på 6-brunnars plattor och inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 min.
- Under inkubationen placera Poly-L-ornitin / laminin / fibronektin plattor i inkubatorn.
- Efter 5-minuters inkubation eller när cellerna har blivit halvflytande, försiktigt pipettera celler upp och ned flera gånger tillgöra dem till enskilda celler.
- Samla de enskilda cellerna i 15 ml koniska rör och tillsätt lämplig mängd Neuro medium för cellräkning, som kommer att variera beroende på expansionen (efter 11 dagar av differentiering kan celler expanderar 15-20 gånger). Räkna cellerna med användning av en hemocytometer.
- Centrifugera cellerna vid 258 xg under 3 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna med B27 differentieringsmedium så att cellkoncentrationen är 1 x 10 6 celler / ml medium.
- Aspirera fibronektin från plattorna, tvätta två gånger med PBS, och tillsätt 2 ml celler till en brunn i 6-brunnars plattor.
OBS: Celltätheten för omstryka bör vara 2 x 10 5 celler / cm 2 av ytan. - Ändra medel 24 timmar senare för att avlägsna eventuella obundna döda celler.
- Ändra medel varannan dag tills de önskade tidpunkter för ett givet experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt av differentieringsprotokollet visas i figur 1. Verkningsgraden hos differentieringsprotokoll presenteras här förlitar sig på status av utgångsceller. Därför är det viktigt att se till att, första tar bort alla de differentierade kolonier innan dissociera hPSCs i enstaka celler för differentiering, och andra, man utarmar de flesta, om inte alla, MEF matarceller genom inkubation av celler på gelatinbelagda plattor 30 minuter, och för det tredje en tallrikar de HPSC enskilda celler på lämplig täthet på Matrigel tallrik. Såsom illustreras i figur 2, återutströks HPSC enskilda celler kommer att expandera som kluster under 48 h före differentiering, bildar omkring 70% konfluens i plattorna. Sedan efter differentiering, dessa celler nå full sammanflödet på så kort som 3-4 dagar, och börjar från cirka D16-D17, dessa sammanflytande celler börjar göra vissa utrymmen i plattorna, och vissa axoner / neuriter kunde redanobserveras i dessa utrymmen och under cellskikt. Efter att återutströks på D20, de differentierade cellerna fästa och växte som små klumpar. Sedan under de kommande 5 dagarna, mycket mer intensiv och morfologiskt intakta axoner / neuriter komma ut ur klumpar, och axoner / neurites från olika klumpar bildas några anslutningar. Under långtidsodling, nervceller i en klump generera fler förlängningar, få mer mogen och har fler kontakter med nervceller i angränsande klumpar.
Efter 11 dagar av differentiering kunde hPSCs effektivt omvandlas till FP-prekursorer, och såsom illustreras i fig 3, nästan alla celler uttrycker FP prekursor cellmarkörer nestin och FOXA2, och över 90% av cellerna uttrycker ytterligare tre markörer CORIN, OTX2 och Lmx1a. Sedan efter flera dagar av differentiering, är FP prekursorceller anges till DA neuron som de uttrycker TUJ1 och TH (Figur 4A). Dessa DA nervceller är av A9 identitet som de Express GIRK2 samtidigt är negativa för Calbindin (Figur 4B). Immunfärgning experiment visar också att det inte finns några GFAP + astrocyter och mycket få GABAerga neuron (Figur 4C), vilket tyder på att differentieringen uteslutande specificeras mot DA neuron härstamning.
Figur 1 Översikt över differentieringsprotokoll, med tillväxtfaktorer / små molekyler och odlingsmedium som används för varje dag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Morfologiskal förändras under differentiering. H9 hESCs ströks som enskilda celler i lämplig celltäthet som beskrivs, och 48 timmar efter det, dessa celler når ca 70% sammanflödet i plattan som kolonier (D0). Under de första ett par dagar av differentiering, cellerna expandera snabbt och nådde över 90% sammanflödet efter 24 timmar av differentiering (D1), och sedan blir sammanflödet efter 48 mer hr (D3). Men de flesta av dessa celler fortfarande uppvisar typisk hESC morfologi med hög kärna till cytoplasma förhållande (D3). Som differentiering pågår, cellerna expanderar mer och gradvis förlorar hESC morfologi. Vid slutet av D11 av differentiering, det finns fler än en cellskikt i många delar av plattan, såsom framgår av mörkare färg av celler i vissa områden än de andra (D11). Från och ca D17 till D20, dog vissa celler och lämnar vissa utrymmen i plattan, och vissa neuron prognoser kan redan skönjas i dessa utrymmen ennd ibland under cellskiktet (D20). Efter cell omstryka i slutet av D20 att göra fler utrymmen för celler att växa och differentiering, celler aggregera som små kluster, många fler axoner / neuriter fram ur dessa kluster, och axoner / neurites från olika kluster bildar några anslutningar i så kort som 4-5 dagar (D25). Skala bar, 200 pm.
Figur 3 Immunfärgning för FP markörer i tidigt stadium av differentiering. H9 hESCs differentierades i 11 dagar med hjälp av protokoll som beskrivs här. Cellerna fixerades sedan med 4% paraformaldehyd, permeabiliseras med Triton X-100, blockerades med åsna serum och färgades sedan för FP prekursor cellmarkörer. Såsom visas här, nästan alla celler uttrycker FOXA2 och nestin, och över 90% av cellerna uttrycker Lmx1a, CORIN, ochOTX2, vilket tyder på en konverterings mycket hög verkningsgrad från hESCs till FP-celler. Skala bar, 200 pm.
Figur 4 Immunfärgning för DA neuron markörer vid sena stadier av differentiering. (A) H9 hESCs differentierades i 25 dagar, och cellerna var föremål för immunfärgning för pan-neuron markör TUJ1 och vanligt förekommande DA neuron markör TH. Som visas här, även om det finns mer TUJ1 positiva celler än TH-positiva celler, alla TH-uttryckande celler rest i TUJ1-uttryckande celler, och TH-uttryckande celler utgör minst hälften av alla celler. (B). De H9 hESCs ades ytterligare differentieras i ytterligare 25 dagar (totalt 50 dagar) och sedan cellerna var föremål för immunfärgning. Resultaten visade att det finns högre andel TH-uttryckande celler then att vid d25. Nästan alla dessa TH-uttryckande celler uttrycker också GIRK2 medan de flesta av dem är negativa för Calbindin, indikerar A9 subtyp identiteten för de genererade DA nervceller, vilket är den celltyp som går förlorad i PD. (C) Immunfärgning för celler vid D25 differentierings visade att det inte finns några celler som uttrycker GFAP, och mycket få celler uttrycker GABA. Skala bar, 200 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Humant pluripotenta stamceller (inklusive både hESCs och hiPSCs) kan differentieras in vitro för att generera de flesta, om inte alla, celltyper av vår kropp inklusive DA-neuroner, vilket har visats i tidigare studier 19. Här, baserade på kunskap från embryonala dopaminerga neuron utveckling 20 och publicerade protokoll från andra laboratorier 14,15, vi optimerat odlingsbetingelsema för generering av DA nervceller från hESCs och hiPSCs. Detta protokoll är effektiv, reproducerbar och vi kan på så protokoll som beskrivs här för att H1 och H9 hESC linjer och till hiPSC linjer från både PD-patienterna och opåverkade kontroller.
I våra protokoll, det finns tre viktiga steg för att få den höga differentiering verkningsgrad: För det första bör det inte finnas några differentierade HPSC kolonier i cellerna innan riktad differentiering. Som spontan differentiering till alla tre germinallager ses ofta i hPSC kultur, är det viktigt att ta bort dessa differentierade kolonier innan det skiljer dessa hPSCs in i enskilda celler. För det andra bör MEF matare vara uttömda från dissocierade hPSCs, som tidigare rapporter har visat att MEF celler kan hemliga faktorer som främjar självförnyelse och hämmar differentiering 21. För detta ändamål bör inkubation av HPSC och MEF cellblandningar på gelatinbelagda plattor för 30 minuter vara tillräckligt för att ta bort nästan alla MEF celler. För det tredje bör de enskilda hPSCs beläggas på lämplig celltäthet för differentiering. Ökning av celltätheten kommer att leda till döden för de flesta celler på runt D11 differentiering, samtidigt sänka celltätheten kommer att leda till avskiljandet och död av celler i mitten av plattan i så kort som mindre än 7 dagar, även om celler på kanten kommer att skilja bra (data visas ej). Om man tar hänsyn till samtliga dessa tre kriterier, är det lätt att effektivt få DA nervceller från hPSCs med vår stegprotokoll.
Protokollet presenteras här bygger i huvudsak på en tidigare rapport av L. Studer och kollegor 14 med vissa modifikationer. Först var differentieringen här började 48 timmar efter en enda cell plätering när cellerna når endast ca 70% sammanflödet, medan den i sin rapport, var differentiering började när cellerna nå full sammanflödet (3 eller fler dagars odling efter enstaka cell plätering). Enligt vår erfarenhet, med början differentiering från konfluenta celler utan en cellpassage tills dag 20 leder till svår celldöd under differentieringsprocessen. För det andra, vi byter dyra SHH protein i sin studie med SAG, en klorbensotiofen innehållande liten molekyl agonist för HH-vägen 22. Därför, jämfört med tidigare publicerade protokoll, detta är beskrivet här matarcell och neural rosett oberoende, och baseras huvudsakligen på små molekyler för FP specifikation; Det är alltså billigare och mindre tidskrävande och arbetskrävande. Naturligtvis limitation av detta protokoll är användningen av KSR under de första dagarna av differentiering. KSR varierar från parti till parti, vilket kan påverka differentiering effektivitet. Därför bör man testa olika partier av KSR för att få den som fungerar bäst i att inducera FP prekursorer efter 11 dagar av differentiering.
Sammanfattningsvis bör differentierprotokoll descried här lätta: (1) generering av DA-neuroner från hESCs eller hiPSCs normala personer för cellersättningsterapi för PD; (2) generering av DA-neuroner från PD tålmodiga iPSCs för in vitro-modellering och testa potentiella terapeutiska läkemedel för PD; (3) studiet av gener / signalvägar som reglerar människans DA neuron utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
