Summary
मकड़ी के कण, प्रयोगात्मक पौधों का प्रकोप और संयंत्र क्षति के आकलन के समरूप नमूने के कुशल तैयारी के लिए प्रोटोकॉल, संयंत्र कीट बातचीत की पढ़ाई के लिए आवश्यक के रूप में विकसित किया गया.
Abstract
दो देखा मकड़ी घुन, Tetranychus urticae, आर्थिक मूल्य के 150 से अधिक प्रजातियों की एक उल्लेखनीय व्यापक सरणी, पर खिलाती है कि एक सर्वव्यापी स्वर - संगति संबंधी Arthropod शाकाहारी है. यह विशेष रूप से सोलानेसी और Cucurbitaceae ऐसे मक्का, कपास के रूप में (उदाहरण के लिए, टमाटर, बैंगन, मिर्च, खीरे, तोरी) और ग्रीन हाउस टूम (जैसे, गुलाब, गुलदाउदी, कारनेशन), वार्षिक फसलों (में, ग्रीनहाउस फसलों का एक प्रमुख कीट है सोयाबीन, और चुकंदर), और बारहमासी संस्कृतियों (अल्फला, स्ट्रॉबेरी, अंगूर, citruses, और प्लम) 1,2 में. यह एक महत्वपूर्ण कृषि कीट, टी. बनाता है कि चरम polyphagy के अलावा urticae अपने नियंत्रण 3-7 के लिए उपयोग किया जाता है कि कीटनाशकों और acaricides की एक विस्तृत सरणी के लिए प्रतिरोध विकसित करने की प्रवृत्ति है.
टी. urticae यह (27 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिन) एक तेजी से जीवन चक्र के रूप में, एक उत्कृष्ट प्रायोगिक जीव हैऔर आसानी से प्रयोगशाला में उच्च घनत्व पर बनाए रखा जा सकता है. (सीटू संकरण और एंटीबॉडी धुंधला में सहित) जीन अभिव्यक्ति परख करने और शाही सेना के हस्तक्षेप का उपयोग मकड़ी घुन अंतर्जात जीनों की अभिव्यक्ति को निष्क्रिय करने के तरीकों 8-10 विकसित किया गया है. हाल ही में, टी. के पूरे जीनोम अनुक्रम urticae पहले से ही अपने मेजबान पौधों (Arabidopsis thaliana और टमाटर टमाटर) 11 में से कुछ में मौजूद बराबर जीनोमिक संसाधनों के साथ एक मॉडल जीव के रूप में इस कीट शाकाहारी विकसित करने के लिए एक अवसर पैदा करने, सूचित किया गया है. साथ में, इन मॉडल जीवों संयंत्र कीट बातचीत के आणविक आधार में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.
इधर, त्वरित और आसान वयस्क महिला के कण की एक बड़ी संख्या के संग्रह, एक प्रायोगिक संयंत्र मेजबान पर अपने आवेदन पत्र, और कारण मकड़ी घुन खिलाने के लिए संयंत्र क्षति के आकलन के लिए एक कारगर तरीका वर्णित हैं. एन प्रस्तुत प्रोटोकॉलबाद में प्रयोगात्मक आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि किसी भी विकास मंच (अंडे, लार्वा, nymphs, वयस्क पुरुषों, और महिलाओं) पर व्यक्तियों के सैकड़ों की तेज और कुशल संग्रह ables.
Introduction
संयंत्र कीट बातचीत महान वैज्ञानिक और आर्थिक महत्व का विषय है. यह ऐतिहासिक (जैसे टमाटर के रूप में) दोनों प्रकार की फसलों के पौधों और मॉडल संयंत्र, ए अध्ययन कर रहा था thaliana. दोनों ही मामलों में, शाकाहारी करने के लिए संयंत्र की संवेदनशीलता herbivore हमले के बाद या परोक्ष रूप से कीट प्रदर्शन के मूल्यांकन के माध्यम से सीधे संयंत्र phenotype के मूल्यांकन के माध्यम से या तो मापा जा सकता है.
संयंत्र संवेदनशीलता के प्रत्यक्ष माप तरीकों की एक सीमा का उपयोग कीट कीट प्रजातियों में से एक नंबर के लिए पहले से उपयोग किया गया. उदाहरण के लिए, lepidopteran लार्वा की herbivory एक ग्रिड 12 की मदद से नग्न आंखों से Plutella xylostella (Diamondback कीट) या Trichoplusia नी (गोभी looper) या तो द्वारा खपत संयंत्र ऊतक के भाग के एक अनुमान के रूप में मापा जाता है. इसके अलावा, बाद में मात्रात्मक छवि विश्लेषण के साथ पत्ती नुकसान की डिजिटल इमेजिंग का उपयोग उस तरीके हैं. इस तरह के तरीकों में इस्तेमाल किया गयाए की पढ़ाई Frankliniella ऑक्सीडेंटलिस (पश्चिमी फूल एक प्रकार का कीड़ा) 13, Scaptomyza flava (पत्ती खनन ड्रोसोफिला) 14, और टी. के साथ thaliana बातचीत नी 15.
संयंत्र संवेदनशीलता का अप्रत्यक्ष माप व्यापक रूप से संयंत्र कीट बातचीत की पढ़ाई में उपयोग किया जाता है. ए के उदाहरण के लिए, संवेदनशीलता herbivory persicae एफिड Myzus आड़ू को thaliana आमतौर पर कीट उपजाऊपन और बातचीत 16,17 के बाद एक संयंत्र के सकल आकारिकी के विवरण का विश्लेषण के माध्यम से मूल्यांकन किया है. ए के एक अन्य विशिष्ट अप्रत्यक्ष सूचक एक कीट को thaliana संवेदनशीलता शाकाहारी की एक सूखा या गीला वजन आकलन है. यह पैरामीटर आमतौर पर ऐसी Pieris rapae (छोटे सफेद), पी. के रूप में lepidoterans की herbivory, चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है xylostella, या टी. उनके लार्वा या पोटा संबंधी पर नी 15,17 चरणों.
मकड़ी के कण सेल सामग्री फ़े रहे हैंeders. घुन प्रेरित नुकसान हरे रंग पीला करने के लिए सफेद रंग से रंग में लेकर क्लोरोटिक स्थलों में से एक संग्रह के रूप में मान्यता प्राप्त है. मकड़ी घुन herbivory के लिए एक संयंत्र मेजबान की संवेदनशीलता पहले से मकड़ी घुन प्रदर्शन दिनों के विश्लेषण के माध्यम से या तो परोक्ष रूप से मूल्यांकन किया गया था के बाद infestation 18,19, या सीधे पौधों सप्ताह के बाद infestation 18 के सकल आकारिकी का उपयोग कर या उजागर पत्तियों का एक डिजिटल इमेजिंग का उपयोग बाद में स्वचालित छवि विश्लेषण 19 दिनों के लिए कण को. इन विधियों का विकास और टमाटर के पौधों और टी. के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा था urticae, और आम तौर पर मिश्रित घुन आबादी से एकत्र किए गए थे और एक नरम बाल खड़े ब्रश का उपयोग पत्ती की सतह पर रखा गया था कि मकड़ी के कण की कम संख्या (उपचार प्रति 5-15) का इस्तेमाल किया. हालांकि, इन तरीकों के कण से अधिक से अधिक संख्या लागू करने की आवश्यकता है, जहां पढ़ाई के लिए उपयुक्त नहीं हैं. इसके अलावा, जबकि पत्ती छवियों के प्रत्यक्ष प्रसंस्करण छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर मेंAdobe Photoshop (सैन जोस, सीए) या ImageJ 20 टमाटर क्षति के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे इन प्रोटोकॉल सतह के अधिक से अधिक परावर्तन है या हल्के रंग के होते हैं और उच्च दिखाई ट्राईकोम्स (है कि पत्तियों को लागू करने के लिए आदेश में संशोधन की जरूरत संयंत्र क्षति है कि निशान क्लोरोटिक स्पॉट के स्वचालित चयन के मामले में हस्तक्षेप कि जैसे, ए thaliana). इसके अलावा, आसानी से पिछले विधियों के साथ उपयोग किया जा सकता है कि मकड़ी के कण की विकास मंच के सबसे प्रचलित और आसानी से पहचाना वयस्क महिलाओं तक ही सीमित है और अन्य विकास के चरणों का उपयोग precludes है.
संयंत्र मकड़ी घुन बातचीत के उच्च throughput विश्लेषण की ओर पहला महत्वपूर्ण कदम मकड़ी के कण के साथ पौधों को चुनौती और मज़बूती से बातचीत के परिणामों का आकलन करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सरल और मजबूत प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए है.
इस वीडियो, एक बड़ी संख्या के जल्दी और आसानी से संग्रह के लिए एक कारगर तरीका मेंदिसंबर वयस्क महिला के कण की, एक प्रायोगिक संयंत्र मेजबान, और कारण मकड़ी घुन खिलाने के लिए संयंत्र के नुकसान के आकलन पर अपने आवेदन पत्र में वर्णित हैं. प्रस्तुत प्रोटोकॉल बाद में प्रयोगात्मक आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि किसी भी विकास मंच (अंडे, लार्वा, nymphs, वयस्क पुरुषों, और महिलाओं) पर व्यक्तियों के सैकड़ों की तेज और कुशल संग्रह में सक्षम बनाता है. इसके अलावा, इन प्रोटोकॉल किसी भी घुन मेजबान संयंत्र के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन विशेष रूप से ए के मामले में प्रदर्शन कर रहे हैं thaliana.
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Protocol
मकड़ी घुन जनसंख्या के 1. रखरखाव
नोट: मकड़ी के कण (बाकला) कैलिफोर्निया लाल गुर्दे सेम पर पाला जाता है.
- पूर्व infestation के लिए 2-3 सप्ताह के लिए बीज से सेम पौधों को विकसित.
- पीड़ित पौधों के साथ मिश्रित इन पौधों; वयस्क के कण तेजी से ताजा संयंत्र सामग्री उपनिवेश स्थापित करेगा.
- ताजा पौधों के साथ उन की जगह, हर 7-10 दिन पुरानी पीड़ित सेम पौधों निकालें.
2. प्रौढ़ महिला के कण एकत्रित
- वॉशिंग विधि का उपयोग कर संग्रह घुन
- कण इकट्ठा करने के लिए, 1 से 2 दिन पहले प्रयोग करने के लिए पीड़ित पौधों के साथ संपर्क में एक ताजा सेम संयंत्र जगह है.
- 1,000 से 2,000 वयस्क महिला के कण इकट्ठा करने के लिए 20 से 30 ताजा सेम पौधों का प्रयोग करें.
- आरटी पर नल के पानी का उपयोग 0.001% पर बीच 20 का एक समाधान तैयार करें.
- एक बार में 2 से 3 पौधों का उपयोग कर, बीच 20 समाधान में पीड़ित सेम पौधों धो लें.
- दूसरा चरण पूरा घुन मृत्यु दर से बचने के लिए 10 मिनट के भीतर 2.1.4.
- परिभाषित मेष आकार के Sieves के माध्यम से घुन सस्पेंशन का निस्पंदन द्वारा प्रौढ़ महिला के कण का अलगाव
- निम्नलिखित जाल आकार की चलनी तैयार: 500 माइक्रोन (मलबा हटाने के लिए) और 300 मीटर (महिला वयस्क कण इकट्ठा करने के लिए) (चित्रा 1 ए).
- 500 माइक्रोन चलनी के माध्यम से निलंबन तक.
- 300 माइक्रोन चलनी के माध्यम से निलंबन Refilter. वयस्क महिला के कण बनाए रखा जाएगा.
- बीच 20 को निकालने के लिए स्वच्छ पानी के नल में वयस्क महिला के कण के साथ एक 300 माइक्रोन चलनी डुबकी.
- चलनी के तल पर एक परत में कण बिखरा हुआ है.
- चलनी के जाल और पक्षों से अतिरिक्त पानी को निकालने के लिए कागज तौलिया का उपयोग करें. नोट: कण उबरने के लिए जल्दी से सूखे की जरूरत है क्योंकि हो गया है.
- चित्र 1 में दिखाया के रूप में एक विधानसभा की तैयारीबी; इस कण आसानी से ले जाने की अनुमति होगी, लेकिन उन्हें भागने से रोकने के लिए होगा.
- एक सहायता के रूप में प्रयोग किया जाता है कि चलनी के शीर्ष पर कण से चलनी रखें.
- Dispersing से कण को रोकने के लिए पानी के साथ नीचे चलनी चारों ओर. नोट: कण के बाद लगभग 5 मिनट उबरने शुरू कर देंगे. लगभग 30 मिनट के बाद, आगे बढ़ कण की संख्या संग्रह (चित्रा -1) शुरू करने के लिए पर्याप्त है. वे संग्रह के साथ हस्तक्षेप करेगा कि रेशम उत्पादन के रूप में कण, 1 घंटा के भीतर एकत्र किया जाना चाहिए.
कण से 3. प्लांट Infestation
नोट: वयस्क महिला के कण बरामद किए जाने के बाद, वे संयंत्र infestation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक) एक ठीक ब्रश (प्रोटोकॉल खंड 3.1) का उपयोग कर और ख) एक पंप या वैक्यूम रेखा (प्रोटोकॉल खंड 3.2) का उपयोग: वयस्क महिला के कण के साथ प्रयोगात्मक संयंत्रों पर हमला करने के लिए इस्तेमाल किया 2 तरीके हैं.
- एक ब्रश का उपयोग घुन Infestation
नोट: मकड़ी घुन infestationएक ब्रश संयंत्र प्रति करने के लिए 30 के कण के आवेदन के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ.- आकार 00 या बेहतर की एक नरम बाल दौर कला ब्रश का प्रयोग करें.
- आर टी नल के पानी के साथ ब्रश गीले.
- धीरे ब्रश टिप का उपयोग कर चलनी से कण लेने और संयंत्र को हस्तांतरण.
- एक पंप का उपयोग कर Infestation घुन
नोट: 30 से अधिक के कण लागू कर रहे हैं जब एक पंप / वैक्यूम लाइन द्वारा एकत्रित कण से प्लांट प्रकोप प्रयोग किया जाता है. इस विधि के लिए, microelectronic घटक पिक या एक निर्वात लाइन के लिए एक वैक्यूम पंप का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह airflow लगातार और पर्याप्त ताकत का (2-4 साई) रखने के लिए महत्वपूर्ण है.- पंप / वैक्यूम ट्यूब और टिप के बीच एक एडाप्टर के रूप में नीचे एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब कटौती का उपयोग करके पंप या वैक्यूम लाइन को जोड़ता है कि ट्यूब के लिए एक 1 एमएल पिपेट टिप देते हैं.
- पिपेट टिप और अनुकूलक (1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब) के बीच एक कागज तौलिया का एक टुकड़ा रखें. नोट: इस का उद्देश्य टी के अंदर जाल कण हैवह आकांक्षा प्रक्रिया के दौरान टिप पिपेट और भी airflow (चित्रा 1C) को कम करने के लिए.
- पिपेट टिप का उपयोग कर चलनी से सीधे कण ले लीजिए.
- वैकल्पिक रूप से, एक त्रिविमेक्ष का उपयोग कर पीड़ित के पत्तों से कण एक एक करके इकट्ठा.
- कण की अपेक्षित संख्या एकत्र किया गया है, पिपेट टिप की पीठ पर कागज तौलिया का टुकड़ा undisturbed है, यकीन है कि ट्यूब से पिपेट टिप को हटा दें.
- पिपेट टिप दोहन और एक साथ कण clumping से कण ले लीजिए. फिर, पत्ती पर उन्हें जगह; सेकंड के भीतर, कण पत्ती पर फैलाने शुरू कर देंगे.
4. रिकॉर्डिंग और आकलन प्लांट नुकसान
- रिकॉर्डिंग प्लांट नुकसान
नोट: ए के लिए thaliana, संयंत्र क्षति घुन खिलाने के 4 दिनों के बाद मूल्यांकन किया है. नुकसान क्लोरोटिक धब्बे की कुल सतह क्षेत्र के रूप में दर्ज की गई है. नुकसान माप के लिए, पूरे थाली में कटौती और स्कैन किया जाता है.वर्णित पैरामीटर स्कैन एक Epson V30 स्कैनर के लिए कर रहे हैं, लेकिन किसी भी इसी तरह flatbed स्कैनर के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करेगा. अनुमति देने के सभी प्रयोगों के लिए निरंतर पैरामीटर स्कैन रखें व्यक्तिगत प्रयोग रनों के बीच तुलना.- संयंत्र सामग्री के साथ स्कैनर सतह contaminating को रोकने के लिए पारदर्शिता पत्र के साथ स्कैनर बेड कवर.
- तो पत्तियों की मध्यतल की ओर (ऊपरी) की ओर स्कैनर प्रकाश स्रोत और कब्जा तत्व का सामना कर रहे स्कैनर बिस्तर पर एक पूरी थाली और जगह कट. वैकल्पिक रूप से, rosettes स्कैनर बिस्तर पर रखने से पहले व्यक्ति के पत्ते या ठीक कैंची के साथ गैर अतिव्यापी पत्तियों के समूहों में थाली काटना, ओवरलैप के बिना व्यक्ति के पत्तों पर कब्जा करने के लिए बहुत घने हैं. एकाधिक धब्बे एक साथ स्कैन किया जा सकता.
- के पालन और स्कैनर कवर के प्रदूषण को रोकने के लिए सफेद कागज के एक टुकड़े के साथ rosettes या पत्तियों को कवर.
- बंद स्कैनर कवर और निम्नलिखित मानकों के साथ एक स्कैन प्रदर्शन: संकल्प: 1,200 डीपीआई; रंग मोड: एडोब आरजीबी; चमक: 25; फाइल प्रकार: अधिकतम गुणवत्ता जेपीईजी.
- बाद में क्षति के विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइलों को बचाने के लिए.
- संयंत्र के नुकसान की मात्रा
नोट: क्षति के क्षेत्र को मैन्युअल फ़ोटोशॉप का उपयोग कर की गणना की जाती है. कारण घुन खिलाने का एक परिणाम के रूप में पत्ता आकार और लक्षणों के रंग की तीव्रता में बड़े अंतर करने के लिए, स्वचालित विधियों अविश्वसनीय थे. इस प्रकार, एक ग्रिड विधि संयंत्र क्षति का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है:- फ़ोटोशॉप के साथ संयंत्र की छवि खुला.
- (- शो - ग्रिड, कीबोर्ड शॉर्टकट Ctrl + 'देखें या प्रदर्शन) एक नई परत बनाने, फिर 0.25 मिमी x 0.25 मिमी डिवीजनों की एक ग्रिड के साथ स्कैन छवि ओवरले.
- एक मढ़ा परत पर, एक बिंदु ("पेंसिल उपकरण", कीबोर्ड शॉर्टकट B उपयोग) का उपयोग कर क्षतिग्रस्त पत्ती क्षेत्रों निशान. ग्रिड इकाई के एक से अधिक आधा कवर क्षति है जो नीचे ग्रिड के प्रत्येक वर्ग के लिए एक एकल डॉट प्रयोग करें. डॉट के आकार (पिक्सेल में परिभाषित किया गया है यानी,
- परत पर पिक्सल की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए - ग्रिड इकाई के कम से कम आधे को कवर संयंत्र क्षति बताते हैं कि ग्रिड के सभी वर्गों एक बिंदु के साथ चिह्नित कर रहे हैं, हिस्टोग्राम उपकरण (हिस्टोग्राम विंडो) का उपयोग करें. हिस्टोग्राम उपकरण बॉलीवुड की संख्या को मापने के लिए एक परमिट. प्रत्येक डॉट पिक्सल के एक निरंतर और ज्ञात संख्या का प्रतिनिधित्व करती है के बाद से, हिस्टोग्राम उपकरण, विस्तार से, डॉट्स की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व पिक्सल की कुल संख्या मापने, और जाएगा चिह्नित चौकों की कुल संख्या.
- सूत्र का उपयोग कर के रूप में चिह्नित "डॉट्स" की संख्या की गणना:
डॉट्स की संख्या = डॉट प्रति पिक्सेल का पिक्सल / संख्या की कुल संख्या. - एक डॉट ग्रिड के एक वर्ग से मेल खाती है, के रूप में ग्रिड के 1 वर्ग के क्षेत्र द्वारा छवि पर चिह्नित डॉट्स की संख्या से गुणा करके क्षति के कुल क्षेत्रफल की गणना.
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Representative Results
20 से 30 पीड़ित सेम पौधों का उपयोग करना, एक चलनी का उपयोग लगभग 2,000 वयस्क महिला के कण जमा कर सकते हैं. कण स्थानांतरित करने के लिए एक ब्रश का उपयोग अगर संयंत्र प्रति 20 के कण से 10 संयंत्रों पर हमला करने के लिए आवश्यक समय लगभग 15 मिनट है. संग्रह और आवेदन विधियों के संयोजन चित्रा 2 में दिखाया गया.
इस प्रोटोकॉल एकत्र कण समान शारीरिक स्थिति और संयंत्र मकड़ी घुन बातचीत के अध्ययन के लिए उपयुक्त (चित्रा 3) के हैं, प्रदर्शन है कि संयंत्र के नुकसान की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करता है. प्रोटोकॉल reproducibility का आकलन करने के लिए, वयस्क महिला के कण 20 के कण 3 सप्ताह पुरानी ए की थाली पत्ते पर रखा गया था जहां धोने विधि का उपयोग कर एकत्र किए गए एक गीला ब्रश के साथ thaliana पौधों (परिग्रहण कर्नल -0). उपचार किये पौधों स्कैन किया गया 4 दिन postinfestation और क्षति के क्षेत्र में ऊपर वर्णित तकनीकों का उपयोग मात्रा था. दोहराया प्रयोग के परिणाम की तुलना एनोवा का उपयोग किया गया था.
प्रयोगात्मक आवेदन का एक उदाहरण के रूप में, हम 3 ए में मकड़ी घुन herbivory के लिए संवेदनशीलता में प्राकृतिक विभिन्नता का आकलन एक गीला ब्रश और रिकॉर्डिंग क्षति 4 दिनों के बाद प्रकोप का उपयोग संयंत्र प्रति 20 महिला मकड़ी के कण के आवेदन के द्वारा thaliana accessions. स्कैन छवियों में नुकसान की विशिष्ट उपस्थिति चित्रा 3 बी में दिखाया गया है. बाद में, क्षति डेटा की मात्रा का ठहराव एक बार ग्राफ या एक boxplot के रूप में प्रस्तुत किया है और चुनाव के सांख्यिकीय पद्धति (चित्रा -3 सी) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. इस उदाहरण में, एनोवा डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया Tukey एचएसडी परीक्षण द्वारा पीछा किया.
चित्रा 1. प्रायोगिक वयस्क महिला के कण के अलगाव के लिए निर्धारित किया है. विभिन्न मकड़ी घुन विकास के विभाजन के लिए अनुमति देने के लिए चलनी के सेट (ए)चरणों. (ए 0.5 मिमी उद्घाटन आकार - घुन निलंबन से मलबे को हटा बी 0.3 मिमी -.. वयस्क महिला के कण एकत्र करता है सी 0.2 मिमी -.. युवा महिलाओं, पुरुषों, और nymphs एकत्र करता डी 0.16 मिमी -.. लार्वा और nymphs एकत्र करता है ई.. 0.1 मिमी -.. पंप का उपयोग कर के कण इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल के कण धोने और छानने के बाद भागने के बिना ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया अंडे एकत्र करता है) (बी) सेटअप (सी) सेटअप (डी) चलनी एकत्र होने के लिए तैयार वयस्क महिला के कण हिल के साथ..
प्रयोगात्मक डिजाइन वयस्क महिला मकड़ी के कण की एक उच्च संख्या के उपयोग की आवश्यकता है चित्रा 2. लागू करने के कण की संख्या के अनुसार वयस्क महिला के कण अलग करना संभव रणनीतियों,., सबसे कुशल दृष्टिकोण सीधे वैक्यूम पंप संग्रह विधि का उपयोग करने के लिए है सेम के पत्तों से.एक प्रयोग वयस्क महिलाओं या व्यक्तियों को ध्यान से युवा पौधों पर रखा जाना चाहिए की एक छोटी संख्या के अलावा कोई विकास मंच के उपयोग की आवश्यकता है, यह द्वारा पीछा चलनी का उपयोग कर धोने दृष्टिकोण के साथ मकड़ी घुन विकास के चरणों के संग्रह और fractionation प्रदर्शन करने की सिफारिश की है एक ब्रश के साथ infestation.
चित्रा 3. प्रतिनिधि परिणाम है. प्रयोगात्मक परिणामों (ए) Reproducibility. 3 सप्ताह पुरानी ए पर मापा क्षति क्षेत्र thaliana पौधों, परिग्रहण कर्नल-0, 4 दिन 20 महिला मकड़ी के कण के आवेदन के बाद. दोहराया प्रयोग के परिणाम की तुलना एनोवा का उपयोग किया (एन = 6, = 0.621 एफ, पी = .735) था. 3 भर में मकड़ी घुन herbivory के लिए संवेदनशीलता में (बी और सी) प्राकृतिक विभिन्नताए thaliana accessions: कर्नल -0, मकड़ी घुन herbivory के बाद पौधों की ler-0, और WS2 (बी) के रूप.. लाल तीर ठेठ क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की ओर इशारा करते हैं. मकड़ी घुन herbivory के लिए संवेदनशीलता में (सी) अंतर क्षति के क्षेत्र द्वारा मूल्यांकन के रूप में. मकड़ी घुन herbivory के लिए संवेदनशीलता काफी accessions के पार (एनोवा, एन = 6, एफ = 13.4, पी = 0.0004) बदलता रहता है. पत्र पी <0.05 (Tukey एचएसडी परीक्षण) पर जीनोटाइप के बीच महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है. रेखांकन मूल्यों मतलब का मतलब ± मानक त्रुटि हैं.
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Discussion
इस वीडियो को अलग करने और वयस्क महिला के कण की बड़ी संख्या के साथ पौधों पर हमला करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल को दर्शाता है. हम ए का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल प्रस्तुत हालांकि thaliana, यह किसी भी संयंत्र मकड़ी घुन बातचीत प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और वर्तमान में सफलतापूर्वक टमाटर और चर्चा (द्राक्षा) पौधों पर भी लागू किया जा रहा है. एकत्र कण (चित्रा 3) के तुलनीय शारीरिक स्थिति की हैं यह दर्शाता है कि प्रोटोकॉल पैदावार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों,.
इन प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए सरल कर रहे हैं जबकि वे घुन वसूली प्रभावित करेगा, के रूप में कई महत्वपूर्ण कदम विशेष ध्यान देने की जरूरत. पत्तियों से धोने के कण एक साथ तीन सेम पौधों पर किया और आरटी पर पानी का उपयोग करते हुए 10 मिनट के भीतर पूरा किया जाना है किया जाना चाहिए. इसके अलावा, कण तेजी से सुखाने के लिए एक चलनी पर फैल जाना है. घुन वसूली असंतोषजनक है, तो यह बीच 20 डिटर्जेंट की सिफारिश की राशि हमें था कि जांच करने के लिए महत्वपूर्ण हैएड और डिटर्जेंट पूरी तरह से rinsing चरण के दौरान हटा दिया गया था.
एक), पंप द्वारा घुन संग्रह में 30 से अधिक के कण लेकिन कण की एक छोटी संख्या का संग्रह एक ब्रश का उपयोग आवश्यक है और अपेक्षाकृत धीमी है के संग्रह के लिए अच्छी तरह से काम करता है: प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए दो प्रमुख सीमाएं हैं हालांकि, इकट्ठा करने और वाशिंग विधि के माध्यम से वयस्क के कण ध्यान केंद्रित कर बहुत अपने आवेदन की सुविधा; ख) क्लोरोटिक धब्बे की सतह स्कोरिंग के माध्यम से नुकसान विश्लेषण एक समय और प्रयास लेने वाली कदम हो सकता है; भविष्य प्रयास घुन खिलाने का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि मार्कर जीन की पहचान करने में रखना चाहिए.
पहले प्रकाशित तरीके की तुलना में, मकड़ी घुन संग्रह की प्रस्तुत विधि व्यवहार्य व्यक्तियों और एक कदम में विकास के चरणों के कुशल जुदाई की बड़ी संख्या को इकट्ठा करने का एक लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, दृश्य inspecti के माध्यम से संयंत्र कीट बातचीत में संयंत्र क्षति phenotype के मूल्यांकनपर या डिजिटल छवि विश्लेषण आम तौर पर (जैसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण या metabolite रूपरेखा के रूप में) आणविक पढ़ने के लिए बाहर के कुछ फार्म शामिल है एक जटिल विश्लेषण की दिशा में पहला कदम है. वर्तमान प्रोटोकॉल कुछ कण और संयंत्र और कीट के बीच लंबे समय तक बातचीत के विश्लेषण के लिए मूल्यवान हैं कि सामग्री दिनों के बाद संक्रमण के संग्रह के आवेदन के लिए उपयुक्त हैं; हालांकि, इस प्रोटोकॉल प्रभावी रूप से समय की एक छोटी अवधि के (मानव संसाधन) के दौरान और खिला साइट पर होती है कि संयंत्र प्रतिक्रियाओं पर कब्जा करने के लिए एक साथ कण के सैकड़ों लागू करने के लिए एक सक्षम बनाता है.
संक्षेप में, मेजबान पौधों और संयंत्र क्षति के आकलन पर वयस्क महिला के कण को लागू करने के लिए विधियों का वर्णन किया गया है. इन प्रोटोकॉल पौधों और दो देखा मकड़ी घुन के बीच बातचीत का आनुवंशिक और आणविक आधार को समझने के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. | |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance | ||
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | |||
| Set of scissors | |||
| 2 L beakers | |||
| Paper towels | |||
| Sets of sieves | Manufactured in house | Detailed instructions are available | |
| Thin brush | |||
| Pipettes | |||
| Pipette tips | 0.2 and 1 ml | ||
| 1.5 ml centrifuge tubes | |||
| Air pump | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi | ||
| Stereoscope | |||
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
References
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