Summary
거미 진드기, 실험 식물의 침입, 그리고 식물의 손상 평가의 균일 한 시료의 효율적인 준비를위한 프로토콜, 식물 해충의 상호 작용의 연구에 필요한이 개발되었다.
Abstract
두 점박이 응애, 점박이 응애는 경제적 가치의 150 개 이상의와 종의 매우 광범위한, 피드 유비쿼터스 광식 절지 동물 초식 동물입니다. 그것은, 특히 가지과와 박과 같은 옥수수, 면화와 같은 (예를 들면, 토마토, 가지, 고추, 오이, 호박) 및 온실 장식물 (예를 들면, 장미, 국화, 카네이션), 연간 필드 작물 (에, 온실 작물의 주요 해충이다 대두, 사탕무), 및 다년생 문화 (알팔파, 딸기, 포도, 감귤,, 자두), 2에서. 그것은 중요한 농업 해충, T. 만드는 극단적 인 polyphagy에 추가 응애는 제어 3-7에 사용되는 살충제 및 살비제의 다양한 저항을 개발하는 경향이있다.
T. 응애는 (27 ° C에서 7 일 간) 빠른 수명주기를 가지고, 훌륭한 실험 유기체쉽게 실험실에서 고밀도로 유지 될 수있다. (현장 하이브리드 항체 염색법에 포함) 유전자 발현을 분석 실험하고 RNA 간섭을 이용하여 거미 진드기 내인성 유전자의 발현을 불 활성화하는 방법은 8-10 개발되었다. 최근, T.의 전체 게놈 서열 응애는 이미 기주 식물 (애기 장대와 토마토 까 lycopersicum) (11)의 일부에 존재하는 상응하는 게놈 자원 모델 생물로이 해충 초식 동물을 개발할 수있는 기회를 만들어보고되고있다. 함께,이 모델 생물은 식물 해충의 상호 작용의 분자 기초에 대한 통찰력을 제공 할 수있다.
여기에 빠르고 쉽게 성인 여성 진드기의 큰 숫자의 컬렉션, 실험 공장 호스트에서 자신의 응용 프로그램 및 때문에 거미 진드기의 먹이 식물 손상의 평가를위한 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. EN 제시 프로토콜이후 실험적인 응용 프로그램에 사용할 수있는 모든 발달 단계 (계란, 애벌레, 애벌레, 성인 남성 및 여성)에 개인의 수백의 신속하고 효율적인 수집을 에이블 스.
Introduction
식물 해충의 상호 작용이 큰 과학 및 경제적 중요성의 주제입니다. 그것은 역사적으로 (예, 토마토 등) 모두 작물과 모델 식물, A.를 사용하여 조사 하였다 장대. 두 경우 모두, 초식 동물에 식물의 감수성은 초식 동물의 공격 또는 간접적으로 해충의 성능 평가를 통해 직접 식물의 표현형의 평가를 통해 하나를 측정 할 수있다.
식물 감수성의 직접적인 측정은 다양한 방법을 사용하여 해충 종의 개수에 대해 이전에 사용되었다. 예를 들어, 나비목 유충의 초식 동물은 격자 (12)의 도움으로 육안으로 배추 xylostella (나방) 또는 Trichoplusia NI (양배추 자벌레) 중 하나에 의해 소비 식물 조직의 일부의 추정으로 측정된다. 또한, 이후의 정량 이미지 분석과 잎 손상의 디지털 이미징을 활용 방법이 있습니다. 이러한 방법이 사용되었다A. 연구 Frankliniella occidentalis (서양 꽃 총채 벌레) 13 Scaptomyza의 Flava의 (잎 마이닝 초파리) (14), 및 T.와 장대의 상호 작용 NI 15.
식물 감수성의 간접 측정 널리 식물 해충의 상호 작용의 연구에 사용된다. A. 예를 들어, 민감도 초식 동물 persicae 진딧물 Myzus을 복숭아하는 장대는 일반적으로 해충의 번식력과의 상호 작용 (16, 17) 후 식물의 심한 형태의 설명의 분석을 통해 평가된다. A.의 또 다른 전형적인 간접 표시 해충에 장대 감수성은 초식 동물의 건조하거나 습 중량 평가입니다. 이 매개 변수는 일반적으로 같은 Pieris rapae (작은 흰색), P.로 lepidoterans의 초식 동물을 특성화하는 데 사용됩니다 xylostella, 또는 T. 자신의 유충이나 번데기에서 NI는 15, 17 스테이지.
거미 진드기는 셀 내용 FE 있습니다eders. 진드기에 의한 손상은 녹색 엷은 흰색의 색상 범위 백화 관광 명소의 컬렉션으로 인식되고 있습니다. 거미 진드기 초식 동물에 식물 호스트의 취약성은 이전에 거미 진드기 성능 일의 분석을 통해 하나를 간접적으로 평가 된 후 감염 18, 19, 또는 직접 식물 주 후 감염 (18)의 심한 형태를 사용하거나 노출 된 잎의 디지털 이미징을 사용하여 이후 자동 이미지 분석 (19) 일 동안 진드기. 이러한 방법은 개발 및 토마토 식물과 T. 사이의 상호 작용의 연구에 사용 된 응애, 전형적 혼합 진드기 모집단으로부터 수거하고 부드러운 강모 솔을 사용하여 잎 표면에 넣었다 거미 응애의 수가 적은 경우 (처리 당 5-15)을 사용 하였다. 그러나, 이들 방법은 더 많은 수의 진드기가 적용될 필요 연구에는 적합하지 않다. 또, 잎 동안 이미지를 직접 처리 이미지 분석 소프트웨어어도비 포토샵 (산호세, CA) 또는 ImageJ에 20 토마토 손상의 분석에 이용 될 수있는 바와 같이, 이들 프로토콜은 표면의 큰 반사율이 있거나 가볍게 착색되어 시인성 상체 (trichome)를 (이 잎에 적용하기 위해 수정이 필요 식물의 손상을 표시 백화 반점의 자동 선택을 방해 예를 들면, A. 장대). 또한, 쉽게 이전의 방법으로 이용 될 수있는 거미 진드기의 발달 단계는 가장 널리 쉽게 식별 성인 여성에 한정하고 다른 발달 단계의 사용을 배제하고 있습니다.
식물 거미 진드기의 상호 작용의 높은 처리량 분석하는 첫 번째 중요한 단계는 거미 진드기와 식물에 도전하고 안정적으로 상호 작용의 결과를 평가하기 위해 재생 가능한 간단하고 강력한 프로토콜을 설정하는 것입니다.
이 비디오, 큰 숫자를 빠르고 쉽게 수집을위한 효율적인 방법은BER 성인 여성 진드기, 실험 공장 호스트 인해 거미 진드기의 먹이 식물 손상의 평가에 자신의 응용 프로그램이 설명되어 있습니다. 제시된 프로토콜은 후속 실험 응용 프로그램에 사용될 수있는 모든 발달 단계 (알, 유충, 약충, 성인 남성 및 여성)에 개인의 수백 빠르고 효율적으로 수집 할 수 있습니다. 또한, 이러한 프로토콜은 진드기 숙주 식물에 적용 할 수 있지만, 구체적 A.의 경우 입증된다 장대.
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Protocol
거미 진드기 인구의 1. 유지 보수
참고 : 거미 진드기는 (파세 러스 불가리스)가 캘리포니아 붉은 강 낭 콩에서 사육된다.
- 이전에 감염 2 ~ 3 주에 씨앗에서 콩 식물을 성장.
- 감염된 식물 인터는이 식물; 성인 진드기 빠르게 신선한 식물 재료에 정착합니다.
- 신선한 식물로 대체, 7 ~ 10 일마다 이전 만연 된 콩 식물을 제거합니다.
2. 성인 여성 진드기를 수집
- 세척 방법을 사용하여 컬렉션 진드기
- 진드기를 수집하려면 1 ~ 2 일 전에 실험에 감염 식물과 접촉 신선한 콩 식물을 배치.
- 1,000 ~ 2,000 성인 여성 진드기를 수집하기 위해 20 ~ 30 신선한 콩 식물을 사용합니다.
- RT 수돗물을 사용하여 0.001 %에서 트윈 20 용액을 준비합니다.
- 한 번에 2 ~ 3 식물을 사용하여, 트윈 20 용액에 오염 된 콩 식물을 씻으십시오.
- 단계를 완료 진드기 사망을 피하기 위해 10 분 이내 2.1.4.
- 정의 메쉬 크기의 체를 통해 진드기 현탁액의 여과 성인 여성 진드기의 분리
- 다음 메쉬 크기의 체를 준비 : 500 μm의 (파편을 제거하기 위해) 및 300 μM (여성 성인 진드기를 수집하기 위해) (그림 1A).
- 500 μm의 체를 통해 현탁액을 필터링합니다.
- 300 μm의 체를 통해 서스펜션 대해 필터링. 성인 여성의 진드기가 유지됩니다.
- 트윈 20을 제거하기 위해 깨끗한 수돗물의 성인 여성 진드기와 300 μm의 체를 찍어.
- 체의 바닥에 단일 층으로 진드기를 전파.
- 체의 메쉬 측면에서 과잉의 물을 제거하기 위해 종이 타월을 사용합니다. 참고 : 진드기 복구하기 위해 신속하게 건조해야하기 때문에이 작업이 완료됩니다.
- 도 1에 도시 된 바와 같이 조립체를 준비B; 이 진드기가 자유롭게 이동 할 수 있지만이 빠져 나가는 것을 방지 할 수 있습니다.
- 지원으로 사용되는 체의 상단에 진드기 체를 놓습니다.
- 분산에서 진드기를 방지하기 위해 물과 바닥 체를 둘러싸고 있습니다. 참고 : 진드기 후 약 5 분을 복구하기 시작합니다. 약 30 분 후, 이동하는 진드기의 수는 컬렉션 (도 1D)을 시작하기에 충분하다. 가 컬렉션을 방해 실크를 생산으로 진드기, 1 시간 이내에 수집해야한다.
진드기 3. 공장 침입
참고 : 성인 여성 진드기가 회복되면, 그들은 식물의 침입에 사용할 수 있습니다. ) 좋은 브러쉬 (프로토콜 3.1)를 사용하고 B) 펌프 또는 진공 라인 (프로토콜 3.2)를 사용하여 : 성인 여성 진드기 실험 식물을 만연하는 데 2 가지 방법이 있습니다.
- 브러시를 사용하여 진드기 침입
참고 : 거미 진드기의 침입브러시는 공장 당 최대 30 진드기의 응용 프로그램에 사용됩니다에.- 크기 00 또는 미세한의 부드러운 머리카락 라운드 아트 브러쉬를 사용합니다.
- RT 수돗물과 브러쉬를 적시고.
- 부드럽게 브러쉬를 사용하여 체에서 진드기를 들고 식물로 전송.
- 펌프를 사용하여 침입 진드기
주 : 30 개 이상의 진드기가 적용되면 펌프 / 진공 라인에 의해 수집 된 진드기와 공장 감염이 사용됩니다. 이 방법을 위해, 마이크로 전자 부품이 픽업 또는 진공 라인을위한 진공 펌프가 사용될 수있다. 그것은 공기 일정하고 충분한 강도 (2-4 PSI)을 유지하는 것이 중요합니다.- 펌프 / 진공 튜브와 팁 사이의 어댑터로 바닥에 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브 컷을 사용하여 펌프 또는 진공 라인에 연결하는 튜브에 1 ㎖ 피펫 팁을 부착합니다.
- 피펫 팁 및 어댑터 (1.5 ML의 원심 분리기 튜브) 사이에 종이 타월의 조각을 놓습니다. 참고 : 이것의 목적은 t 내부 트랩 진드기이다그는 흡입 과정에서 끝을 피펫 또한 공기 흐름 (그림 1C)을 줄일 수 있습니다.
- 피펫 팁을 사용하여 체에서 직접 진드기를 수집합니다.
- 또한, 입체경을 사용하여 오염 된 잎에서 진드기 하나 하나를 수집합니다.
- 진드기의 필요한 번호를 수집 한 경우, 피펫 팁의 뒷면에 종이 타월의 조각이 방해받지되어 있는지 확인하고, 관에서 피펫 팁을 제거합니다.
- 피펫 팁을 눌러과 함께 진드기를 응집하여 진드기를 수집합니다. 그런 다음 잎에 배치; 초 이내에, 진드기는 잎에 분산하기 시작합니다.
4. 기록하고 평가하는 공장 피해
- 녹화 식물의 손상
주 : A. 위해 장대, 식물 손상은 진드기의 먹이의 4 일 후 평가된다. 공격력이 백화 반점의 총 표면적으로서 기록된다. 피해 측정을 위해 전체 장미는 절단 및 스캔됩니다.설명한 스캐닝 파라미터 엡손 V30 스캐너이지만 유사한 평판 스캐너를위한 좋은 출발점으로 작동 할 것이다. 수 있도록 모든 실험에 대한 지속적인 검색 매개 변수를 유지 개별 실험을 실행 사이의 비교.- 식물 재료와 스캐너 표면을 오염시키는 것을 방지하기 위해 투명 시트를 스캐너 침대 커버.
- 그래서 잎의 향축 (위) 측이 스캐너의 광원 및 캡처 요소에 직면하고 스캐너 침대에 전체 장미와 장소를 잘라. 또한, 근엽 스캐너 침대에 배치하기 전에 각각의 나뭇잎이나 미세 가위와 겹치지 않는 잎의 그룹으로 장미를 해부, 중복없이 각각의 잎을 캡처 너무 조밀 한 경우. 여러 근엽을 동시에 스캔 할 수 있습니다.
- 준수와 스캐너 덮개의 오염을 방지하기 위해 흰색 종이와 근엽 또는 잎을 커버.
- 닫기 스캐너 덮개 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 검사를 수행 : 해상도 : 1,200 dpi로; 컬러 모드 : 어도비 RGB; 밝기 : +25; 파일 형식 : 최대 품질 JPEG.
- 이후 피해 분석을 위해 이미지 파일을 저장합니다.
- 식물 피해 정량화
NOTE : 손상의 면적 수동 포토샵을 사용하여 계산된다. 때문에 진드기의 먹이의 결과로 잎 모양과 증상의 색의 강도에 큰 차이로 자동 방법은 신뢰할 수 있었다. 따라서, 그리드 방법은 식물의 손상을 평가하기 위해 사용된다 :- 포토샵과 식물의 이미지를 엽니 다.
- (-보기 - 그리드, 단축키 Ctrl + '보기 또는 표시) 새 레이어를 만든 다음 0.25 mm X 0.25 mm 부문의 격자로 스캔 한 이미지를 오버레이.
- 오버레이 층에서 점 ( "연필 도구", 키보드 단축키 B를 사용)를 사용하여 손상된 잎 영역을 표시합니다. 그리드 유닛의 반 이상을 덮고 손상이있는 아래의 그리드의 각 정사각형에 대한 하나의 점을 사용합니다. 도트의 크기 (픽셀 단위로 정의된다, 즉,
- 레이어의 화소 수를 결정하기 위하여 - 그리드 유닛의 적어도 절반을 덮는 식물 손상이 그리드의 모든 사각형은 점으로 표시되는 경우, 히스토그램 도구 (히스토그램 윈도우)를 사용한다. 히스토그램 도구는 픽셀의 개수를 측정하는 일을 허용한다. 각 도트 픽셀의 일정한 알려진 번호로 표시되기 때문에, 히스토그램 도구, 연장에 의해, 도트의 총 수를 나타내는 총 픽셀 수를 측정 한 것이다 표시된 사각형의 총 수.
- 수식을 이용하여 표시된 "점"의 수를 계산한다 :
점의 수 = 도트 당 픽셀의 픽셀 / 수의 총 수입니다. - 한 점은 그리드의 한 광장에 대응으로, 그리드의 1 평방의 면적으로 이미지에 표시된 점의 수를 곱하여 손상의 전체 면적을 계산합니다.
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Representative Results
20 ~ 30 오염 된 콩 식물을 사용하여, 하나는 체를 사용하여 약 2,000 성인 여성 진드기를 수집 할 수 있습니다. 진드기를 전송하는 브러시를 사용하면 식물 당 20 진드기 10 식물 만연하는 데 필요한 시간은 약 15 분이다. 컬렉션 및 응용 방법의 조합은도 2에 나타낸다.
이 프로토콜은 수집 된 진드기 비슷한 생리 학적 상태와 식물 거미 진드기의 상호 작용 연구에 적합합니다 (그림 3)의 것을 보여주는, 식물 손상의 재현 가능한 결과를 생성합니다. 프로토콜의 재현성을 평가하기 위해, 성인 여성 진드기는 20 진드기가 삼주 이전 A.의 장미 잎에 배치 된 세척 방법을 사용하여 수집 된 젖은 브러시로 장대 식물 (기탁 골-0). 처리 된 식물이 스캐닝 하였다 사일의 postinfestation 손상의 면적은 전술 한 기술을 사용하여 정량 하였다. 반복 실험 결과의 비교는 ANOVA를 사용하여 수행 하였다.
실험적인 응용 프로그램의 예를 들어, 우리는 3 A. 통해 거미 진드기 초식 동물에 감수성 자연의 변화를 평가 젖은 브러시와 기록 손상 사일 포스트 감염을 사용하여 공장 당 20 여성 거미 진드기의 응용 프로그램에서 장대 accessions. 스캔 한 이미지에 손상의 일반적인 모양은 그림 (b)에 표시됩니다. 그 후, 손상 데이터의 정량화는 막대 그래프 또는 상자 그림으로 제시하고 선택의 통계 방법 (그림 3C)에 의해 분석 될 수있다. 이 예에서, ANOVA는 데이터 분석에 사용 하였다 Tukey에 HSD 시험 하였다.
그림 1. 실험은 성인 여성 진드기의 격리를 설정합니다. 다른 거미 진드기 개발의 분리를 허용하는 체 세트 (A)단계. (A. 0.5 mm 구멍 크기 - 진드기 서스펜션에서 파편을 제거 B 0.3 mm -.. 성인 여성 진드기를 수집 C 0.2 mm -.. 젊은 여성, 남성, 그리고 님프를 수집 D 0.16 mm가 -.. 애벌레와 애벌레를 수집 전자.. 0.1 mm가 -.. 펌프를 사용하여 진드기를 수집하는 데 사용 진드기 세탁 및 필터링 후 도주하지 않고 복구 할 수 있도록하는 데 사용되는 계란을 수집) (B) 설정 (C) 설정 (D) 체를 수집 할 준비가 성인 여성 진드기 움직이는..
실험 디자인은 성인 여성 거미 진드기의 높은 번호의 사용을 필요로하는 경우도 2. 적용 진드기의 수에 따른 성인 여성 진드기를 분리하는 것이 가능 전략., 가장 효율적인 방법은 직접 진공 펌프 수집 방법을 사용하는 것이다 콩 잎에서.실험은 성숙한 암컷 또는 개인 정중 어린 식물에 배치 될 필요가 소수 이외의 발달 단계의 사용을 필요로하는 경우, 그것은 다음에 분 자체를 이용한 세정 방식으로 응애 발달 단계의 수집 및 분류를 수행하는 추천 브러시로 침입.
그림 3. 대표 결과. 실험 결과 (A) 재현성. 삼주 이전 A. 측정 피해 지역 장대 식물, 가입시 골 - 0 4 일, 20 여성 거미 진드기의 적용 후. 반복 실험 결과의 비교는 ANOVA를 사용하여 수행 (N = 6, = 0.621 F, P = 0.735)이었다. 3에서 거미 진드기 초식 동물에 대한 감수성 (B 및 C) 자연의 변화A. 장대 accessions : 콜-0, 거미 진드기 초식 후 식물의 LER-0 및 WS2 (B) 외관.. 빨간색 화살표는 일반적인 손상 영역을 향해 가리 킵니다. 거미 진드기 초식 동물에 대한 감수성 (C)의 차이 손상의 영역에 의해 평가. 거미 진드기 초식 동물에 대한 감수성이 크게 accessions에 걸쳐 (ANOVA를, N = 10, F = 13.4, P = 0.0004)에 따라 다릅니다. 편지는 P <0.05 (Tukey에 HSD 시험)에서 유전자형 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다. 그래프 값은 평균의 평균 ± 표준 오차이다.
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Discussion
이 동영상은 분리하고 성인 여성 진드기 많은 수의 식물을 만연하는 데 사용되는 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 A.를 사용하여이 프로토콜을 제시하지만 장대, 어떤 식물 거미 진드기의 상호 작용 시스템에 사용할 수 있습니다 및 현재 성공적으로 토마토와 포도 (비 티스 VINIFERA) 식물에도 적용되고있다. 수집 된 진드기 (그림 3) 비교 생리 학적 상태에 있음을 나타내는 프로토콜 수익률 재현 가능한 결과.
이러한 프로토콜을 수행하는 간단하지만 그들은 진드기 회복에 영향을 미치기 때문에, 몇 가지 중요한 단계는 특별한주의가 필요합니다. 잎에서 세탁 진드기는 동시에 최대 세 콩 식물에서 수행하고, 실온에서 물을 사용하여 10 분 이내에 완료해야합니다. 또, 진드기 급속 건조 체에 확산되어야한다. 진드기 회복이 만족스럽지 않은 경우, 트윈 20 세제의 권장 금액은 우리 여부를 확인하는 것이 중요합니다ED와 세제가 완전히 헹굼 단계에서 제거 된 경우.
;) 펌프에 의해 진드기 컬렉션 30 개 이상의 진드기하지만 진드기의 작은 숫자의 컬렉션 브러쉬의 사용을 필요로하고 상대적으로 느린의 컬렉션을 위해 잘 작동되게 프로토콜에 대한 두 가지 제한 사항이 있습니다 그러나 수집하고 세탁 방법을 통해 성인 진드기 집중 크게 그들의 애플리케이션을 용이; b) 백화 반점의 표면을 처치 통해 손상 분석은 시간과 노력이 소요되는 단계 일 수있다; 미래의 노력은 진드기 먹이의 척도로서 사용될 수있다 마커 유전자를 식별 배치한다.
이전에 발행 된 방법에 비해, 거미 진드기 컬렉션의 제시 방법은 가능한 개인과 한 단계 발달 단계의 효율적인 분리의 큰 숫자를 수집하는 이점을 제공합니다. 또한, 시각적 inspecti을 통해 식물 해충의 상호 작용에 식물 손상 표현형의 평가또는 디지털 이미지 분석은 일반적으로 (예 : 유전자 발현 분석 또는 대사 산물의 프로파일과 같은) 분자 판독의 일부 형태를 포함하는 복잡한 분석의 첫 단계이다. 현재 프로토콜은 몇 진드기와 식물 해충의 장기적인 상호 작용을 분석하는 데 중요한 자료 일 후 감염의 컬렉션의 응용 프로그램에 적합하다; 그러나이 프로토콜은 효과적으로 짧은 시간 (시간) 동안과 급송 사이트에서 발생하는 식물 반응을 캡처하는 동시에 진드기 수백 적용을 가능하게한다.
요약하면, 기주 식물 및 식물 손상의 평가에 성인 여성 진드기를 적용하는 방법이 설명되어있다. 이러한 프로토콜은 식물 및 두 점박이 응애 간의 상호 작용의 유전 및 분자 기초를 이해 겨냥 실험을 위해 필수적이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. | |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance | ||
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | |||
| Set of scissors | |||
| 2 L beakers | |||
| Paper towels | |||
| Sets of sieves | Manufactured in house | Detailed instructions are available | |
| Thin brush | |||
| Pipettes | |||
| Pipette tips | 0.2 and 1 ml | ||
| 1.5 ml centrifuge tubes | |||
| Air pump | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi | ||
| Stereoscope | |||
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
References
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