Abstract
उपन्यास बायोमार्कर की खोज और अधिक संवेदनशील और विशिष्ट रोग का पता लगाने प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. जैविक तरल पदार्थ में मौजूद है कि दुर्भाग्य से बहुत कम बहुतायत बायोमार्कर आसानी मास स्पेक्ट्रोमेट्री या वे, बहुत कम एकाग्रता में मौजूद हैं अस्थिर कर रहे हैं, और अक्सर इस तरह के एल्बुमिन या इम्युनोग्लोबुलिन के रूप में उच्च बहुतायत प्रोटीन द्वारा नकाबपोश कर रहे हैं क्योंकि immunoassays के साथ नहीं पाया जा सकता. चारा युक्त पाली (एन isopropylacrylamide) (NIPAm) आधारित नैनोकणों इन शारीरिक बाधाओं को दूर करने में सक्षम हैं. एक कदम में वे कब्जा ध्यान केंद्रित करने और शरीर के तरल पदार्थ से बायोमार्कर की रक्षा करने में सक्षम हैं. कम आणविक वजन analytes nanoparticle की कोर भर में उच्च आत्मीयता प्रोटीन फँसाना कार्य जो विभिन्न जैविक रासायनिक रंगों ने कब्जा कर रहे हैं. नैनोकणों परिमाण के कई आदेशों द्वारा ब्याज की प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने में सक्षम हैं. यह एकाग्रता कारक प्रोटीन के भीतर कर रहे हैं कि इस तरह के प्रोटीन के स्तर को बढ़ाने के लिए पर्याप्त हैवर्तमान मास स्पेक्ट्रोमीटर, पश्चिमी सोख्ता, और immunoassays की सीमा का पता लगाने. नैनोकणों जैविक तरल पदार्थ की अधिकता के साथ incubated किया जा सकता है और वे एल्बुमिन और अन्य उच्च आणविक वजन प्रोटीन को छोड़कर, जबकि बहुत कम आणविक वजन प्रोटीन और पेप्टाइड्स की एकाग्रता को समृद्ध करने में सक्षम हैं. हमारे डेटा एक विशेष analyte की एकाग्रता में एक 10,000 गुना प्रवर्धन पहले से undetectable बायोमार्कर का पता लगाने के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री और immunoassays सक्षम करने से प्राप्त किया जा सकता है.
Introduction
मानव जीनोम अनुक्रमण के पूरा होने के बावजूद महत्वपूर्ण प्रगति प्रारंभिक चरण रोग के भविष्य कहनेवाला पहचान बायोमार्कर में नहीं किया गया है, या कि चिकित्सीय परिणाम, या रोग का निदान 1 के साथ सहसंबंधी. प्रगति की इस कमी का एक कारण कई संभावित महत्वपूर्ण बायोमार्कर पारंपरिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और अन्य बायोमार्कर की खोज प्लेटफार्मों की सीमा का पता लगाने के नीचे एक एकाग्रता में मौजूद है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) और एकाधिक रिएक्शन मॉनिटरिंग (एम आर एम) आम तौर पर एक का पता लगाने संवेदनशीलता से अधिक 50 / मिलीलीटर एनजी जबकि 50 स्नातकोत्तर / एमएल और 10 एनजी / एमएल के बीच सीमा में एक नैदानिक प्रयोगशाला गिरावट में immunoassays द्वारा मापा analytes की बहुमत . यह विशेष रूप से एक रोग के प्रारंभिक चरण में कई बायोमार्कर, पारंपरिक एमएस और MRM 2 से नहीं पाया जा सकता है. इसके अलावा इस तरह के जटिल जैविक तरल पदार्थ में एल्बुमिन और इम्युनोग्लोबुलिन के रूप में उच्च बहुतायत प्रोटीन की उपस्थिति अक्सर अरब गुना exc से नकाबईएसएस कम बहुतायत, कम आणविक वजन प्रोटीन और पेप्टाइड 3, 4. इस कारण कई नमूना प्रारंभिक चरणों मास स्पेक्ट्रोमेट्री अनुक्रमण और पहचान करने से पहले आवश्यक हैं. ऐसा ही एक प्रारंभिक कदम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिक्तीकरण कॉलम 5-8 के साथ उच्च बहुतायत प्रोटीन की कमी को रोजगार. वे अक्सर गैर covalently हटाया जा रहा है कि वाहक प्रोटीन के साथ जुड़े रहे हैं, क्योंकि दुर्भाग्य से इस कदम उम्मीदवार बायोमार्कर की पैदावार में कमी की ओर जाता है. नमूने एकत्र कर रहे हैं एक बार एक और चुनौती उम्मीदवार बायोमार्कर पूर्व vivo की स्थिरता का प्रतिनिधित्व करती है. प्रोटीन अंतर्जात या exogenous प्रोटीस 9 से गिरावट के अधीन हैं. गिरावट 10-13 से प्रोटीन की रक्षा करते हुए हाइड्रोजेल नैनोकणों, परख की सीमा के भीतर एक स्तर पर ख्यात biomarker एकाग्रता amplifying द्वारा इन महत्वपूर्ण चुनौतियों से पार कर सकते हैं.
यह वें नोट करना महत्वपूर्ण हैLMW पर रक्त में प्रोटीन छोटे बरकरार प्रोटीन के साथ ही बड़े प्रोटीन के टुकड़े का मिश्रण हैं. 60 केडीए से बड़ा ऊतक व्युत्पन्न प्रोटीन निष्क्रिय संवहनी तहखाने झिल्ली के माध्यम से रक्त प्रवाह में प्रवेश करने के लिए बहुत बड़ी हैं, लेकिन वे पेप्टाइड या प्रोटीन टुकड़े के रूप में 14 रक्त में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है. हमारा लक्ष्य बीमारी का जल्दी पता लगाने, चिकित्सा के लिए रोगी स्तरीकरण, और उपचार के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए उम्मीदवार हो सकता है कि उपन्यास घूम बायोमार्कर उपाय है. हमारे नैनोकणों एक साथ छोटे प्रोटीन और पेप्टाइड पर कब्जा करने और प्रारंभिक मात्रा के आधार पर 100 गुना करने के लिए उन्हें अपना ध्यान केंद्रित करते हुए चुनिंदा, उच्च बहुतायत इम्युनोग्लोबुलिन और एल्बुमिन बाहर करने के लिए बनाई गई हैं.
हमारे समूह सफलतापूर्वक प्रोटीन और पेप्टाइड्स के लिए के रूप में उच्च आत्मीयता आणविक फँसाना कार्य कर सकते हैं जो छोटे कार्बनिक रंगों का एक सेट की पहचान की. बंधनकारी प्रोटीन डाई कारण हाइड्रोफोबिक और electrostatic बातचीत का एक संयोजन के लिए माना जाता हैएस. डाई पर सुरभित छल्ले प्रोटीन सतह 11 पर हाइड्रोफोबिक जेब के माध्यम से प्रोटीन के साथ बिछा.
फँसाना चाहे, उनके रसायन शास्त्र के आधार पर, analytes की चयनित वर्गों के लिए एक विशेष आकर्षण दिखा. फँसाना चाहे प्रोटीन या पेप्टाइड्स के लिए, इस तरह के एल्बुमिन के रूप में, वाहक प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं. कम वजन आणविक प्रोटीन / पेप्टाइड कण में फंस बन जाते हैं. इस तरह के एल्बुमिन और इम्युनोग्लोबुलिन के रूप में उच्च आणविक वजन प्रोटीन के कारण हाइड्रोजेल 11 (चित्रा 1) के प्रतिबंधक ताकना क्योंकि sieving क्षमता के कण प्रवेश करने से रोका जाता है.
हाइड्रोजेल नैनोकणों अमोनियम persulfate 11 से शुरू की तेज़ी polymerization द्वारा संश्लेषित कर रहे हैं. एन isopropylacrylamide (NIPAm), एक्रिलिक एसिड (एएसी) और allylamine (एए) और पार linker एन, N'-Methylenebisacrylamide (बीआईएस) के सह monomers पतला शर्तों 1 में 6 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दी जाती है1, 13. पाली की उच्च प्रोटीन बंधन आत्मीयता (एन isopropylacrylamide सह एक्रिलिक एसिड) covalently (अमीनो युक्त रंगों को शामिल अर्थात्., Sulfonatedanthraquinonetriazine रंजक) नैनोकणों में के माध्यम से प्राप्त किया (पाली (NIPAm सह एएसी) nanoparticlesis रंगों की हाइड्रोफिलिक / हाइड्रोफोबिक विशेषताओं के आधार पर जलीय या कार्बनिक सॉल्वैंट्स में प्रदर्शन एक amidation प्रतिक्रिया 11, एक anthraquinonetriazine डाई की क्लोराइड परमाणु के साथ nanoparticle में amine समूहों की 13. न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन डाई युक्त पाली (NIPAm बनाने के लिए उपयोग किया जाता है -सह Allylamine) (एए), 11 नैनोकणों 12. एक दो कदम polymerization प्रक्रिया vinylsulfonic एसिड (VSA) 11, 13 के एक बाहरी कवच युक्त हाइड्रोजेल नैनोकणों बनाने के लिए उपयोग किया जाता है.
हाइड्रोजेल नैनोकणों पूरे रक्त, प्लाज्मा, सीरम, मस्तिष्कमेरु द्रव, पसीना, और मूत्र सहित विभिन्न जैविक तरल पदार्थ, के लिए लागू किया जा सकता है. एक कदम में, समाधान में, एनanoparticles (मिनट के भीतर) एक तेजी ज़ब्ती और कम आणविक वजन की एकाग्रता 10, 11, 13, 15-18 analytes प्रदर्शन करते हैं. प्रोटीन बाद में उपयोग कर नैनोकणों से eluted और पता चला रहे हैं पश्चिमी स्पेक्ट्रोमेट्री 10, 11, 13, 15, 18, 22 जन, 19-21 सोख्ता, 23, immunoassays / एलिसा 10, 11, 15, 18, या रिवर्स चरण प्रोटीन माइक्रोएरे 16, 24 assays. नैनोकणों रासायनिक चारे के साथ functionalized, और एक कोर या कोर खोल आर्किटेक्चर, कब्जा पेश करने और चारा / खोल भौतिक गुणों पर आधारित प्रोटीन ध्यान केंद्रित. नैनोकणों में शामिल विभिन्न रंगों इसलिए डाई आत्मीयता के आधार पर दक्षता, समाधान के पीएच, और उच्च प्रचुर मात्रा में प्रोटीन 13 प्रतिस्पर्धा की उपस्थिति / अनुपस्थिति बदलती के साथ प्रोटीन के विभिन्न सबसेट पर कब्जा करेगा. इसके अलावा, समाधान की मात्रा के संबंध में नैनोकणों की मात्रा नैनोकणों से प्रोटीन उपज को प्रभावित करेगा. के इन पहलुओंहाइड्रोजेल nanoparticle कटाई प्रोटीन की उच्च मात्रा में होते हैं जो प्लाज्मा नमूनों से कटाई प्रोटीन के लिए तीन अलग अलग nanoparticle फँसाना चाहे का उपयोग कर प्रदर्शन किया, और आम तौर पर प्रोटीन की बड़ी मात्रा में शामिल नहीं है, जो मूत्र के नमूने से कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में हम कटाई और पाली (NIPAm सह एएसी), पाली (NIPAm / डाई), और core- खोल नैनोकणों का उपयोग प्लाज्मा नमूनों से ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) ध्यान केंद्रित का प्रदर्शन (पाली (NIPAm सह VSA)) . पाली (NIPAm / डाई) नैनोकणों माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरक्लोसिस संक्रमित व्यक्तियों की नकल करने के लिए मानव मूत्र नमूनों में जोड़ा गया था कि माइकोबैक्टीरियम प्रजातियों प्रतिजन, ध्यान केंद्रित करने के लिए दिखाए जाते हैं.
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Protocol
मानव प्लाज्मा और मूत्र जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी है, निम्नलिखित लिखित सूचित सहमति से, स्वस्थ स्वयंसेवक दाताओं से एकत्र किया गया था. दाताओं समान रूप से व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया गया 25 और 42 नमूने की उम्र के बीच कोकेशियान पुरुषों और महिलाओं के बीच वितरित किए गए और जमा नहीं किए गए थे.
सीरम या प्लाज्मा नमूनों की 1 Nanoparticle प्रसंस्करण
प्लाज्मा में संभावित कम प्रचुर मात्रा में बायोमार्कर हाइड्रोजेल नैनोकणों के साथ, समाधान में, कब्जा कर रहे हैं. कणों धोया, centrifugation द्वारा अलग incubated प्लाज्मा,, करने के लिए जोड़ रहे हैं, और कब्जा कर लिया प्रोटीन eluted हैं. eluted प्रोटीन बहाव मास स्पेक्ट्रोमेट्री अनुक्रमण और पहचान के लिए नाइट्रोजन प्रवाह के तहत सूख रहे हैं.
- एक microcentrifuge ट्यूब में 50 मिमी TrisHCl पीएच 7 (500 μl सीरम + 500 μl TrisHCl) के साथ 2: सीरम 1 के 500 μl पतला.
- 500 μL पाली (NIPAm / एएसी) कोर nanop जोड़ेंलेख. आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- एक निश्चित कोण रोटर से लैस एक अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए, 16,100 XG पर 25 डिग्री सेल्सियस नमूना स्पिन. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- गोली के लिए 500 μl सोडियम thiocyanate (25 मिमी) जोड़ें. सख्ती से ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे नैनोकणों Resuspend.
- एक निश्चित कोण रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए, 16,100 XG पर 25 डिग्री सेल्सियस नमूना स्पिन. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- Nanoparticle गोली MilliQ पानी के 500 μl जोड़ें. सख्ती से ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे नैनोकणों Resuspend.
- एक निश्चित कोण रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए, 16,100 XG पर 25 डिग्री सेल्सियस नमूना स्पिन. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- ताजा क्षालन बफर तैयार: एक स्वच्छ ट्यूब में 300 μl अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के लिए μl acetonitrile 700 जोड़ें. सावधानी: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड संक्षारक है. उचित वेंटीलेशन के साथ प्रयोग करें. नोट: क्षालन बफर तैयार करने का होना चाहिएared तुरंत उपयोग करने से पहले. क्षालन बफर दुकान नहीं है.
- Nanoparticle गोली क्षालन बफर के 300 μl जोड़ें. सख्ती से ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे नैनोकणों Resuspend. आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- एक निश्चित कोण रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए, 16,100 XG पर 25 डिग्री सेल्सियस नमूना स्पिन. निकालें और एक साफ, लेबल microcentrifuge ट्यूब में eluate बचा.
- 1.10 - दोहराएँ 1.9 कदम. एक microcentrifuge ट्यूब में दो eluates का मिश्रण.
- 8 (चित्रा 2 एफ) के लिए सेट हवा के प्रवाह के साथ, 42.1 डिग्री सेल्सियस पर एक नाइट्रोजन बाष्पीकरण कई गुना में नाइट्रोजन प्रवाह के तहत eluates सूखी.
- ओ / एन भंडारण के लिए आरटी पर सूखे eluate दुकान, या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, पर मास स्पेक्ट्रोमेट्री, पश्चिमी सोख्ता, या एलिसा assays (वैकल्पिक) के लिए पहले.
मूत्र के नमूने की 2 Nanoparticle प्रसंस्करण
सामान्य मूत्र कम से कम 30 मिलीग्राम / डीएल और प्रोटीन होता है1 + रक्त से भी कम. हालांकि, कई बीमारियों / स्थितियां मूत्र प्रोटीन और रक्त के सामान्य स्तर को बदल सकता है. मूत्र नमूना में जोड़ने के लिए नैनोकणों के इष्टतम मात्रा का निर्धारण करने में सहायता करने के लिए, एक urinalysis nanoparticle कटाई करने से पहले किया जाता है. मूत्र बायोमार्कर मूत्र की मात्रा को नैनोकणों के अनुपात के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, जो बेहद कम मात्रा में मौजूद हो सकता है. इस प्रक्रिया को नीचे की ओर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए मूत्र के नमूने की nanoparticle कटाई का वर्णन है.
- एक साफ, सूखे प्लास्टिक के कप में मूत्र के नमूने ले लीजिए. एक 22 मिलीलीटर न्यूनतम मात्रा की आवश्यकता होती है. विश्लेषण करने के लिए तैयार है जब तक स्टोर मूत्र -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों.
- आरटी पर या 4 डिग्री कंपनी / एन पर जमी मूत्र पिघलना. एक भंवर मिक्सर पर संक्षेप में मिलाएं. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे polypropylene ट्यूब में मूत्र के कम से कम 22 मिलीलीटर डालो.
- 15 मिनट के लिए 3700 XG पर एक स्विंग बाहर रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र में मूत्र स्पिन. एक साफ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे Polypr में, गोली परेशान बिना, मूत्र छाननाopylene ट्यूब. गोली त्यागें.
- एक बहु analyte "मूत्र डिपस्टिक" अभिकर्मक पट्टी का उपयोग urinalysis प्रदर्शन करना. नोट: सीधे धूप और नमी 17, 18 से दूर एक कसकर बंद कंटेनर में अभिकर्मक स्ट्रिप्स दुकान.
- एक साफ, सूखे कागज तौलिया पर अभिकर्मक पट्टी, चेहरे अप, निर्धारित करना.
- 2.3 कदम में तैयार मूत्र के 1 मिलीलीटर महाप्राण को एक डिस्पोजेबल विंदुक का प्रयोग करें.
- 2 मिनट के लिए एक टाइमर सेट, लेकिन यह शुरू नहीं है. अभिकर्मक पट्टी के प्रत्येक परीक्षण पैड पर मूत्र के 2 बूँदें - जल्दी 1 बांटना. तुरंत टाइमर शुरू. नोट: मूत्र कंटेनर में सीधे अभिकर्मक पट्टी डूब न करें. अभिकर्मक पट्टी में डाई / रासायनिक संकेतक संभावित मूत्र कंटेनर में अभिकर्मक पट्टी के बाहर नमकीन पानी कर सकते हैं.
- अभिकर्मक पट्टी कंटेनर पर संकेत दिया समय, इसी रंग कोडित इंडिका को व्यक्तिगत अभिकर्मक स्ट्रिप्स के रंग की तुलना द्वारा अभिकर्मक पट्टी पर विभिन्न analytes के लिए गुणात्मक परिणाम रिकॉर्डअभिकर्मक कंटेनर पर tors. ठेठ सामान्य मूत्र परिणाम हैं: (सामान्य या नकारात्मक) खून, प्रोटीन, leukocytes, नाइट्राइट, ग्लूकोज, कीटोन, बिलीरुबिन, और urobilinogen के लिए; मूत्र पीएच (5.5-7.0); विशिष्ट गुरुत्व (1.001-1.020). नोट: एक मूत्र नमूना में उच्च प्रोटीन के स्तर नैनोकणों पर बाध्यकारी साइटों के लिए ब्याज की प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं. नैनोकणों के साथ प्रोटीन की कटाई को अधिकतम करने के लिए, nanoparticle मात्रा / मूत्र की मात्रा अनुपात उच्च बहुतायत प्रोटीन से या तो सीमा प्रतिस्पर्धा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, या बहुत कम मात्रा में मौजूद प्रोटीन है कि फसल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. मूत्र प्रोटीन मूल्य 1 + या अधिक है, तो नीचे 2.5 कदम में नैनोकणों के 2x मात्रा में जोड़ें. ब्याज की analyte एक बहुत कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन होता है, तो यह 2 मिलीलीटर (चित्रा 3) के लिए नैनोकणों की मात्रा को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- स्थानांतरण एक स्वच्छ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे polypropylene ट्यूब में 2.3 कदम से स्पष्ट मूत्र के 20 मिलीलीटर. ऐसा नहींमूत्र ट्यूब के तल में हो सकता है कि किसी भी मलबे / गोली परेशान. 20 मिलीलीटर मूत्र नमूने के नैनोकणों के 200 μl जोड़ें. एक भंवर मिक्सर पर संक्षेप में मिलाएं. मूत्र प्रोटीन मूल्य 1 + या अधिक है, तो 20 मिलीलीटर मूत्र को नैनोकणों के 400 μl जोड़ें: ध्यान दें.
- कमाल / मिश्रण के बिना, आरटी पर 30 मिनट के लिए मूत्र / nanoparticle मिश्रण सेते हैं.
- 10 मिनट के लिए 3700 XG पर एक स्विंग बाहर रोटर से लैस एक अपकेंद्रित्र में मूत्र / nanoparticle निलंबन स्पिन. नोट: एक गोली दिखाई निम्नलिखित centrifugation नहीं है, तो एक अतिरिक्त 2 के लिए नमूने स्पिन - 7 मिनट.
- निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. Nanoparticle गोली 500 μl MilliQ पानी जोड़ें.
- सख्ती से ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे नैनोकणों Resuspend. एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब nanoparticle समाधान स्थानांतरण.
- 10 मिनट के लिए 16,100 XG पर एक निश्चित कोण रोटर से लैस एक अपकेंद्रित्र में नैनोकणों स्पिन. नोट: एक गोली दिखाई fol नहीं है7 मिनट - centrifugation lowing, एक अतिरिक्त 2 के लिए नमूने स्पिन.
- निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- दोहराएँ नैनोकणों धोने के लिए 200 μl 18 MilliQ पानी के साथ (दो बार) 2.8 और 2.11 दोहराएँ.
- ताजा क्षालन बफर तैयार: एक स्वच्छ ट्यूब में 30 μl अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के लिए μl acetonitrile 970 जोड़ें. सावधानी: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड संक्षारक है. उचित वेंटीलेशन के साथ प्रयोग करें. नोट: क्षालन बफर तुरंत उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए. क्षालन बफर दुकान नहीं है.
- Nanoparticle गोली को 20 μl क्षालन बफर जोड़ें. सख्ती से ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे नैनोकणों Resuspend. आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- 10 मिनट के लिए 16,100 XG पर nanoparticle नमूने स्पिन. निकालें और एक साफ, 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए. Nanoparticle गोली को बाधित न करें. Biohazard कचरे में गोली त्यागें.
- एक रासायनिक धूआं हुड में एक रैक में नमूने रखें. टोपियां खोलें और कांग्रेस30 मिनट के लिए आरटी पर ubate. (- 2 घंटा 1) वैकल्पिक रूप से, शुष्क जब तक 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन प्रवाह के तहत नमूने जगह है.
- नमूने के 15 μl Tris-ग्लाइसिन एसडीएस नमूना बफर (2x) जोड़ें. 100 पर गर्मी खुले या ट्यूब में छोड़ मात्रा तक टोपी के साथ 5 मिनट के लिए एक सूखी गर्मी ब्लॉक में डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं 20 μl है. नोट: एक उबलते पानी में नहाने का प्रयोग नहीं करते. नहाने के पानी से नमी बफर के वाष्पीकरण को रोकने जाएगा.
- ट्यूब पर टोपी रखें. गर्मी ब्लॉक से ट्यूब निकालें. नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या नीचे की ओर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Representative Results
हाइड्रोजेल Nanoparticle आकार और एकरूपता
पाली (NIPAm-एएसी) कणों के बीच और बैचों के भीतर अत्यंत उच्च उपज और reproducibility के साथ उत्पादन किया गया है. कणों पर कब्जा, भंडारण, और प्रोटीन की क्षालन (कम से कम 48 घंटे) के लिए आवश्यक समय के दौरान आरटी पर बहुत अच्छा कोलाइडयन स्थिरता है, और nanoparticle वर्षा (चित्रा 1) 11 नहीं देखा गया है. कोलाइडयन स्थिरता नैनोकणों द्वारा तेजी से प्रोटीन / पेप्टाइड तेज के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है.
प्लाज्मा से काटा क्षमता कम बहुतायत Biomarkers
डाई चारा का समावेश समाधान में अणुओं के तेज ड्राइव और कब्जा कर लिया अणुओं गिरावट 13, 15, 18, 25 से संरक्षित कर रहे हैं कि आश्वासन दिया. इस कारण से, प्रोटीज इनहिबिटर्स नमूना पूर्व प्रसंस्करण के दौरान की जरूरत नहीं कर रहे हैं. नैनोकणों की इस विशेषता उन्हें है बनाता हैक्षेत्र में नमूना संग्रह के लिए और आरटी पर जैविक तरल पदार्थ के लदान के लिए एक संरक्षण प्रौद्योगिकी के रूप में uitable.
चारा अणु nanoparticle में वर्तमान कार्य समूहों के लिए बाध्य copolymerization या सहसंयोजक द्वारा हाइड्रोजेल कण में शामिल किया जा सकता है. Vinylsulfonic एसिड (VSA) copolymer युक्त एक बाहरी कवच के साथ नैनोकणों एक दूसरे polymerization प्रतिक्रिया 10-13 से बनाया गया है, जबकि एक उदाहरण के रूप में, पाली (NIPAm सह एएसी) नैनोकणों, शून्य लंबाई crosslinking amidation प्रतिक्रियाओं के माध्यम से अमीनो युक्त रंगों के साथ निर्माण किया गया. नैनोकणों के विभिन्न प्रकार के प्रोटीन के विशिष्ट वर्गों की कटाई में वृद्धि इस प्रकार nanoparticle के भीतर एक अलग रासायनिक डाई को शामिल करने और द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. हमारी प्रौद्योगिकी का एक महत्वपूर्ण अवधारणा डाई प्रोटीन बातचीत, 3 डी बातचीत हाइड्रोफोबिक बातचीत का एक संयोजन पर मुख्य रूप से निर्भर है, क्योंकि विभिन्न फँसाना चाहे अलग प्रोटीन के लिए एक तरजीही आत्मीयता दिखा सकता हैमाहौल, और electrostatic बलों. हम कुछ analytes क्योंकि बंधन बलों की जटिलता का रासायनिक विभिन्न रंगों से एक उच्च आत्मीयता के साथ कब्जा कर लिया जा सकता है कि देखा है. Tamburro एट अल देखें. इस सिद्धांत 13 के एक व्यापक व्याख्या और उदाहरण के लिए. उदाहरण के लिए, कब्जा चारा (नैनोकणों) के चार अलग अलग प्रकार के कणों की 200 μl और nanoparticle के प्रत्येक प्रकार के लिए 200 μl प्लाज्मा का उपयोग प्लाज्मा से TNFα फसल के लिए इस्तेमाल किया गया. TNFα nanoparticle eluate (चित्रा 1C) में detectable था जबकि नैनोकणों के साथ उपचार के बाद सभी मामलों में, TNFα, चांदी धुंधला के साथ एसडीएस पृष्ठ से सतह पर तैरनेवाला में पता लगाने योग्य नहीं था. (लेन 1 = संयोजक TNFα (मेगावाट 17,000 दा), गलियों 2 और 3, 4 और 5, 6 और 7 और 8 और 9 क्रमशः nanoparticle फँसाना के चार अलग अलग प्रकार के लिए परिणाम प्रतिनिधित्व करते हैं, सी = नियंत्रण, एस = सतह पर तैरनेवाला, पी = nanoparticle eluate).
Diffe के लिए खुराक प्रतिक्रियाएन anoparticles का किराया प्रकार
उपज और सटीक एक अंशांकन वक्र प्रदर्शन, और इस प्रकार का आकलन करने के लिए, प्रयोगों में जाना एकाग्रता का नुकीला-में प्रोटीन के साथ प्रदर्शन करने की जरूरत है. शरीर के तरल पदार्थ और analytes की एक किस्म के लिए प्रकाशित परिणाम nanoparticle पूर्व प्रसंस्करण परख के linearity रखता है और पता लगाने के 10, 16, 26 की प्रभावी सीमा बढ़ाने, जबकि एक अंशांकन वक्र स्थापित कैसे प्रदर्शित करता है. हम भी बीच प्रयोगशाला परिशुद्धता का अध्ययन प्रकाशित किया है नैनोकणों का उपयोग बढ़ाया संवेदनशीलता 27 के साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री की निगरानी बहु प्रतिक्रिया का संचालन करने के लिए.
Nanoparticle के विभिन्न प्रकार के द्वारा आईएल -17 कटाई दक्षता की तुलना करने के लिए, पुनः संयोजक आईएल -17 (17.5 केडीए) प्लाज्मा नमूने जो या तो पाली (NIPAm सह एएसी) या पाली के लिए (NIPAm सह VSA) नैनोकणों बाद में जोड़ा गया था करने के लिए जोड़ा गया था . पुनः संयोजक आईएल -17 की 100 एनजी के चार धारावाहिक dilutions के दो सेट 100 में तैयार किए गए81; एल प्लाज्मा (100 एनजी / 100 μl, 50 एनजी / 100 μl, 25 एनजी / 100 μl और 12.5 एनजी / 100 μl). 1 (वी / वी) कण: प्लाज्मा अनुपात पाली (NIPAm सह एएसी) या पाली (NIPAm सह VSA) कण एक 1 में संबंधित प्लाज्मा नमूने के लिए जोड़ा गया था. एक spectrophotometric कुल प्रोटीन परख सतह पर तैरनेवाला नमूने पर प्रदर्शन किया गया था. विरोधी खरगोश पॉलीक्लोनल आईएल -17 के साथ पश्चिमी सोख्ता nanoparticle कटाई और nanoparticle eluates (पी) (चित्रा 4) के बाद प्लाज्मा सतह पर तैरनेवाला (एस) के 20 माइक्रोग्राम पर प्रदर्शन किया गया था. दोनों nanoparticle प्रकार पर्याप्त रूप से काटा और प्रत्येक कमजोर पड़ने पर आईएल -17 ध्यान केंद्रित किया. वेस्टर्न ब्लॉट पर अतिरिक्त बैंड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पार प्रतिक्रिया है कि मानव सीरम albumin और immunoglobulin का प्रतिनिधित्व करते हैं. (एएसी कणों: लेन 1 व 2 = 1 एनजी / μl आईएल -17, लेन 3 व 4 = 0.50 एनजी / μl, गलियों 5 और 6 = 0.25 एनजी / μl, लेन 7 और 8 = 0.125 एनजी / μl, लेन 9 = आईएल -17, VSA कणों: 1 व 2 = 1 एनजी / आईएल -17, लेन 3 व 4 = 0.50 एनजी / μl μl लेन,लेन 5 एवं 6 = 0.25 एनजी / μl, लेन 7 और 8 = 0.125 एनजी / μl).
मूत्र में संभावित निदान प्रोटीन की जांच
लिखित सूचित सहमति से स्वस्थ स्वयंसेवक दाताओं से प्राप्त मानव मूत्र के नमूने, माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरक्लोसिस संक्रमित व्यक्तियों की नकल करने के लिए प्रारंभिक स्रावी लक्ष्य माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरक्लोसिस प्रोटीन (ESAT-6) प्रतिजन एक पुनः संयोजक माइकोबैक्टीरियम प्रजातियों के साथ नुकीला गया. 1 ग्राम ESAT-6 (15 केडीए) और आईएल -2 (15.5 केडीए) के प्रत्येक स्वस्थ स्वयंसेवक दाताओं से एकत्र मानव मूत्र से 1 मिलीलीटर aliquots के लिए जोड़ा गया था. Urinalysis मूत्र प्रोटीन की उपस्थिति / अनुपस्थिति पर आधारित था, जो मूत्र को नैनोकणों के इष्टतम अनुपात निर्धारित करने के लिए एक मूत्र अभिकर्मक पट्टी के साथ नमूने पर प्रदर्शन किया गया था. पाली (NIPAm / डाई) नैनोकणों और इलाज मूत्र के नमूनों से प्रोटीन फसल के लिए इस्तेमाल किया गया. Nanoparticle eluates की एक आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन च प्रदर्शन किया थाचांदी धुंधला द्वारा ollowed. U4 और U6 गलियों में नमूने स्पष्ट रूप से 15 केडीए (चित्रा 5) में प्रमुख बैंड दिखा, ESAT-6 और आईएल -2 इलाज मूत्र के नमूने से nanoparticle eluates का प्रतिनिधित्व करते हैं. ESAT-6 (UniProt परिग्रहण POA567, 84.0 कवरेज, 9 पेप्टाइड) और आईएल -2 (UniProt परिग्रहण P60568, 38.56 कवरेज, 3 पेप्टाइड) पहचान eluates मास स्पेक्ट्रोमेट्री. Nanoparticle कटाई के बिना मूत्र "रॉ" लेबल लेन में दिखाया गया है.
चित्रा 1 नैनोकणों फसल और जटिल जैविक तरल पदार्थ से कम बहुतायत प्रोटीन ध्यान केंद्रित. कटाई प्रोटीन के लिए (ए) कार्यप्रवाह. कुल प्रसंस्करण समय लगभग 1.5 घंटे है. समाधान में प्रोटीन रक्त, सीरम, प्लाज्मा, मूत्र, पसीना, लार, या शरीर के अन्य तरल पदार्थ (1,000 गुना एकाग्रता दर्शाया) से केंद्रित कर रहे हैं. (बी)नैनोकणों के समान आकार दिखा बैच तुलना करने के लिए बैच. मीका पर परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी नैनोकणों के दो बैचों में आकार (0.7 माइक्रोन व्यास) और clumping के अभाव की एकरूपता से पता चलता है. (सी) 1 डी जेल वैद्युतकणसंचलन, ट्यूमर परिगलन फैक्टर अल्फा के बाद चांदी धुंधला, साथ (TNFα) प्लाज्मा से तनहा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
नीचे की ओर मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए प्लाज्मा / सीरम से चित्रा 2 Nanoparticle कटाई प्रक्रिया. (ए) नैनोकणों समाधान में निलंबित रहेगा (पाली (NIPAm / डाई) दिखाया गया है). (बी) नैनोकणों पतला प्लाज्मा नमूना करने के लिए जोड़ रहे हैं. (सी) nanoparticle प्लाज्मा निलंबन मैंसतह पर तैरनेवाला से नैनोकणों अलग करने के लिए एक अपकेंद्रित्र में घूमती है. (डी) पोस्ट centrifugation, नैनोकणों ट्यूब के तल में एक अलग गोली के रूप में. (ई) नैनोकणों धोने के बाद, काटा प्रोटीन युक्त eluate हटा दिया है और सहेजा जाता है eluate 42.1 डिग्री सेल्सियस, 1 के लिए हवा का प्रवाह 8, पर एक बाष्पीकरण में नाइट्रोजन प्रवाह के तहत सूख रहा बहाव के विश्लेषण के लिए (एफ) -.. पूर्व मास स्पेक्ट्रोमेट्री को 2 घंटा इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
नमूना गुणवत्ता नियंत्रण के लिए बहु analyte अभिकर्मक स्ट्रिप्स का उपयोग चित्रा 3 Urinalysis. (ए) अभिकर्मक पट्टी पर प्रत्येक पैड एक अलग के साथ प्रतिक्रिया जो रसायन, एंजाइम, और / या सूचक रंगों के साथ गर्भवती हैईएनटी मूत्र विश्लेष्य (जैसे., ग्लूकोज, बिलीरुबिन, कीटोन, विशिष्ट गुरुत्व, रक्त, पीएच, प्रोटीन, urobilinogen, नाइट्राइट, और / या ल्युकोसैट esterase). मूत्र centrifugation द्वारा स्पष्ट किया जाता है. मूत्र की एक बूंद अभिकर्मक पट्टी पर प्रत्येक पैड में जोड़ा जाता है. (ख) प्रत्येक पैड का रंग नेत्रहीन कंटेनर पर रंग ब्लॉकों की तुलना में है, निर्धारित समय पर. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4. फसल काटने वाले आईएल 17 कोर (एएसी) या कोर खोल (VSA) नैनोकणों का उपयोग प्लाज्मा से. विरोधी आईएल -17 के साथ सोख्ता 1 डी जेल वैद्युतकणसंचलन और पश्चिमी विभिन्न conce फसल के लिए एक्रिलिक एसिड (एएसी) और VSA कोर खोल नैनोकणों की क्षमता को दर्शाता हैप्लाज्मा से आईएल 17 की ntrations. Nanoparticle कटाई के बाद (एस = सतह पर तैरनेवाला, पी = nanoparticle eluate AAC कणों:. लेन 1 व 2 = 1 एनजी / आईएल -17, लेन 3 & = 0.50 4 एनजी / μl, गलियों 5 और 6 = 0.25ng / μl, गलियों μl 7 और = 0.125 8 एनजी / μl, लेन 9 = आईएल -17, VSA कणों: लेन 1 व 2 = 1 एनजी / आईएल -17, लेन 3 व 4 = 0.50 एनजी / μl, गलियों μl 5 एवं 6 = 0.25 एनजी / μl, लेन 7 और 8 = 0.125 एनजी / μl) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. रिकवरी माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरक्लोसिस प्रतिजन और साइटोकाइन आईएल -2 हाइड्रोजेल नैनोकणों का उपयोग मूत्र से की. 1 डी जी निम्न चांदी धुंधलामूत्र के नमूने की अल वैद्युतकणसंचलन. गलियों U4 और U6 में नमूने पुनः संयोजक ESAT-6 और आईएल -2, स्पष्ट रूप से 15 केडीए में प्रमुख बैंड दिखा युक्त मूत्र के नमूने से eluates का प्रतिनिधित्व करते हैं. ESAT-6 (UniProt परिग्रहण POA567, 84.0 कवरेज, 9 पेप्टाइड) और आईएल -2 (UniProt परिग्रहण P60568, 38.56 कवरेज, 3 पेप्टाइड) पहचान eluates मास स्पेक्ट्रोमेट्री. (रॉ = nanoparticle कटाई के बिना मूत्र, पुनः संयोजक ESAT-6 और आईएल -2 निम्नलिखित nanoparticle कटाई कमी U1, U2, U3, U5, यू 7, U8 = मूत्र). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| प्रोटीन के नाम | सैनिक प्रोटीन संख्या | सीरम में एकाग्रता / प्लाज्मा [एनजी / एमएल] | संदर्भ |
| एबीएल-interactor 1 isoform एक | 61743942 | अज्ञात | |
| एएमपी सक्रिय प्रोटीन kinase gamma2 सबयूनिट isoform एक | 33186925 | अज्ञात | |
| CAS-BR-M (murine) ecotropic रेट्रोवायरल बदलने अनुक्रम | 52426745 | अज्ञात | |
| केमोकाइन (सीसी आकृति) ligand 18 (फेफड़े और सक्रियण विनियमित) | 4506831 | 30 | 34 |
| केमोकाइन (सीसी आकृति) ligand 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | अज्ञात | |
| गुणसूत्र 16 खुला पढ़ने फ्रेम 80 | 8392875 | अज्ञात | |
| Consortin | 213021160 | अज्ञात | |
| defensin, अल्फा 4, corticostatin | 4503303 | अज्ञात | |
| 20149675 | अज्ञात | ||
| ग्लाइकोप्रोटीन आईबी (प्लेटलेट), बीटा पॉलीपेप्टाइड | 4504073 | अज्ञात | |
| गुआनिन न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी प्रोटीन (जी प्रोटीन), क्यू पॉलीपेप्टाइड | 40254462 | अज्ञात | |
| Heparanase | 148746204 | अज्ञात | |
| इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर 2 (somatomedin ए) | 189083846 | 115px "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | अज्ञात | |
| ल्युकोसैट सेल व्युत्पन्न chemotaxin 2 | 59806345 | 200,000 | 33 |
| lipocalin 2 (ओंकोजीन 24p3) | 38455402 | 0.05 | 28 |
| Monoglyceride lipase, isoform CRA_b | 6005786 | अज्ञात | |
| एन ethylmaleimide के प्रति संवेदनशील कारक लगाव प्रोटीन, alphएक | 47933379 | अज्ञात | |
| एक कटौती homeobox 2 | 119220564 | अज्ञात | |
| शुक्राणु की पूंछ 4 के बाहरी घने फाइबर | 171184433 | अज्ञात | |
| तालू, फेफड़ों और नाक उपकला जुड़े | 18765705 | अज्ञात | |
| पेप्टीडोग्लायकन मान्यता प्रोटीन 2 | 156616294 | अज्ञात | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| प्रोटीन CASC3 | 15721939 | अज्ञात | |
| RAB27B, रास परिवार ओंकोजीन | 5729997 | अज्ञात | |
| रास एसोसिएशन (RalGDS / वायुसेना 6) डोमेन परिवार 6 isoform एक | 29789443 | अज्ञात | |
| RAS संबंधी जीटीपी बाध्यकारी प्रोटीन RAB10 | 33695095 अज्ञात | ||
| अनामिका प्रोटीन 166 | 30520320 | अज्ञात | |
| सीरम अभाव प्रतिक्रिया (phosphatidylserine प्रोटीन बाध्यकारी) | 4759082 | अज्ञात | |
| घुला हुआ पदार्थ वाहक परिवार 33 (एसिटाइल कोए ट्रांसपोर्टर), सदस्य 1 | 4757708 | अज्ञात | |
| ST6 बीटा galactosamide अल्फा 2,6-sialyltranferase 1 isoform एक | 27765091 | 15 | 32 |
| thymosin की तरह 3 | 34013530 | अज्ञात | |
| विभाजन 3 के transducin की तरह बढ़ाने (ई (sp135) Homolog, ड्रोसोफिला) | 157384982 | अज्ञात | |
| transglutaminase 1 | 4507475 | अज्ञात | |
| WD दोहराने डोमेन 1 | 9257257 | अज्ञात | |
| WD दोहराने डोमेन 91 | 222080092 | px "> अज्ञात||
| Xin 2 युक्त दोहराने actin बाध्यकारी | 119372317 | अज्ञात |
सीरम / प्लाज्मा से नैनोकणों से काटा तालिका 1 उदाहरण कम बहुतायत प्रोटीन. (PeptideAtlas मास स्पेक्ट्रोमेट्री peptidome) 28-34 permissionfrom संदर्भ 13 (Tamburro, डी एट अल के साथ अनुकूलित बहुआयामी कोर खोल नैनोकणों:... पहले से अदृश्य बायोमार्कर की खोज जम्मू एम केम समाज, 133, 19178-19188, (2011 ).) कॉपीराइट 2011 अमेरिकन केमिकल सोसायटी.
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Discussion
नैदानिक प्रासंगिकता
एक सीरम या प्लाज्मा नमूना एक पूरे के रूप में जीव की स्थिति के बारे में जानकारी का एक समृद्ध स्रोत प्रदान कर सकते हैं, जो प्रोटीन और पेप्टाइड घूम कम बहुतायत शामिल करने के बारे में सोचा है. सीरम प्रोटिओमिक्स के वादे के बावजूद, नैदानिक लाभ 10, 11, 16, 25 के लिए बायोमार्कर की खोज और अनुवाद नाकाम तीन मौलिक और गंभीर शारीरिक बाधाओं रहे हैं.
1 महत्वपूर्ण नैदानिक बायोमार्कर रक्त में बहुत कम बहुतायत (एकाग्रता) में मौजूद हो सकता है. ऐसे पूर्व मेटास्टेटिक कैंसर घावों के रूप में प्रारंभिक चरण रोगग्रस्त ऊतक, कुछ 3 मिमी से भी कम का गठन हो सकता है. इस तरह के एक छोटे ऊतक मात्रा से प्रचलन में बहाया बायोमार्कर अत्यधिक पूरे रक्त की मात्रा में पतला हो जाएगा. प्रासंगिक analytes मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पारंपरिक immunoassays की पहचान की सीमा से नीचे मौजूद हो सकता है.
2 कम बहुतायत बायोमार्कर /प्रोटीन प्लाज्मा proteome 14 से 90% तक का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो इस तरह के एल्बुमिन और इम्युनोग्लोबुलिन के रूप में उच्च प्रचुर मात्रा में प्रोटीन, की उपस्थिति के मुखौटे हैं.
3 प्रोटीन और पेप्टाइड venipuncture और नमूना परिवहन / भंडारण निम्नलिखित अंतर्जात और exogenous proteinases से गिरावट की संभावना है. प्रोटीन गिरावट झूठी सकारात्मक या नकारात्मक झूठी परिणाम 35 तक ले सकते हैं.
हाइड्रोजेल नैनोकणों. शरीर में प्रोटीन और पेप्टाइड कटाई और संरक्षण के लिए anthraquinonetriazine रंगों और / या vinylsulfonic एसिड गोले युक्त झरझरा, प्रसन्नचित्त, पॉलिमर 11, 13 तरल पदार्थ के रूप में विकसित हमारे समूह संश्लेषित और यानी जैविक रंगों के ढेर सारे (साथ functionalized हाइड्रोजेल नैनोकणों परीक्षण किया गया. , sulfonated और गैर sulfonatedanthraquinonetriazine रंजक) और कई प्रोटीन के लिए तरजीही समानताएं 11, 13 analytes दिखाया. हम यह भी है कि प्रयोग बायोमार्कर की खोज के लिए प्रोटोकॉल स्थापितलसीका, लार, मस्तिष्कमेरु द्रव, पसीना, मूत्र, प्लाज्मा, रक्त, या सीरम के साथ हाइड्रोजेल नैनोकणों 11, 13, 23, 24, 26 नमूनों.
कीमती नैदानिक / अनुसंधान नमूने से पूर्व कटाई प्रोटीन nanoparticle कटाई मानकों के अनुकूलन आदर्श परिणामों के लिए आवश्यक है. नमूनों में प्रोटीन की मात्रा नमूना मात्रा को नैनोकणों के इष्टतम अनुपात निर्धारित करने के लिए मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए. अज्ञात एकाग्रता की analytes के लिए, पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग कर एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र का पता लगाने की सीमा के बारे में जानकारी प्रदान करता है. पर्याप्त नमूना है, तो नैनोकणों के विभिन्न प्रकार के विश्लेष्य और नमूना के लिए आदर्श nanoparticle निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Nanoparticle कटाई से पहले urinalysis एक मूत्र का नमूना गुणवत्ता नियंत्रण चेक प्रदान करता है. nanoparticle डाई चारा की आत्मीयता ब्याज की प्रोटीन और आसपास के माध्यम की पीएच की समविद्युतविभव बात पर निर्भर करता है. मूत्र पीएच होबीच 5.5 और 7.0 पाली (NIPAm / डाई) नैनोकणों के साथ प्रोटीन की कटाई के लिए इष्टतम है. hemolyzed या बरकरार लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति (अभिकर्मक पट्टी पर 1 + रक्त) nanoparticle कटाई के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है.
इस प्रोटोकॉल में हम प्लाज्मा और मूत्र से प्रोटीन फसल हाइड्रोजेल नैनोकणों के आवेदन पर जोर दिया. भविष्य अनुप्रयोगों जैसे आँख के शीशे, या श्लेष तरल पदार्थ के रूप में शरीर के अन्य तरल पदार्थ शामिल कर सकता है. विवो अनुप्रयोगों में संभावित नैनोकणों biomolecules इकट्ठा करने के लिए रोगग्रस्त ऊतकों में इंजेक्ट कर रहे हैं, जिसमें भविष्य की कल्पना के लिए किया जा सकता है. भविष्य के काम भी इस तरह के त्वचा transudate proteome के विश्लेषण के लिए एक nanoparticle आधारित त्वचा पैच के रूप में पकड़ने और बायोमार्कर के संरक्षण के लिए नए उपकरणों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा.
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Acknowledgments
कृपया चित्रा 5 में दिखाया गया डेटा संग्रह और विश्लेषण के साथ सहायता माइकल हेनरी, डबलिन सिटी विश्वविद्यालय,. इस काम के द्वारा आंशिक रूप से समर्थन किया था (1) जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय, (2) इटली / यूएसए के ढांचे में इतालवी IstitutoSuperiore डि Sanita ' स्वास्थ्य विभाग के अमेरिका और मानव सेवा, जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय, और सार्वजनिक स्वास्थ्य के इतालवी मंत्रालय, (3) एनआईएच, IMAT कार्यक्रम अनुदान 1R21CA137706-01 और लाल को 1R33CA173359-01, और (4) सायरस नैनोसाईंसिस, इंक के बीच सहयोग समझौता .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
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