Abstract
El descubrimiento de biomarcadores Novela juega un papel crucial en la prestación de detección de la enfermedad más sensible y específica. Desafortunadamente muchos biomarcadores de baja abundancia que hay en fluidos biológicos no pueden ser fácilmente detectados con espectrometría de masas o inmunoensayos, ya que están presentes en muy baja concentración, son lábiles, y son a menudo enmascarados por proteínas de alta abundancia tales como albúmina o inmunoglobulina. Bait contiene poli (N-isopropilacrilamida) (Nipam) nanopartículas a base son capaces de superar estas barreras fisiológicas. En un paso que son capaces de captar, concentrar y preservar biomarcadores de fluidos corporales. -Analitos de bajo peso molecular entran en el núcleo de la nanopartícula y son capturados por diferentes tintes químicos orgánicos, que actúan como cebos de proteína de alta afinidad. Las nanopartículas son capaces de concentrar las proteínas de interés en varios órdenes de magnitud. Este factor de concentración es suficiente para aumentar el nivel de proteína de tal manera que las proteínas están dentro de lalímite de detección de los espectrómetros de masas actuales, el Western Blot, e inmunoensayos. Las nanopartículas se pueden incubar con una plétora de fluidos biológicos y que son capaces de enriquecer en gran medida la concentración de proteínas y péptidos de bajo peso molecular mientras que excluye la albúmina y otras proteínas de alto peso molecular. Nuestros datos muestran que una amplificación de 10.000 veces en la concentración de un analito particular se puede lograr, lo que permite espectrometría de masas y los inmunoensayos para detectar biomarcadores previamente indetectables.
Introduction
A pesar de la finalización de la secuenciación del genoma humano, no se ha logrado avances significativos en la identificación de biomarcadores predictivos de la enfermedad en etapa temprana, o que se correlacionan con el resultado terapéutico o pronóstico 1. Una razón para esta falta de progreso es que existen muchas biomarcadores potencialmente significativos a una concentración por debajo del límite de detección de espectrometría de masas convencional y otras plataformas de descubrimiento de biomarcadores. Espectrometría de masas (MS) y Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM) tienen una sensibilidad de detección típicamente mayor que 50 ng / ml, mientras que la mayoría de los analitos medidos por inmunoensayos en una caída de laboratorio clínico en el intervalo entre 50 pg / ml y 10 ng / ml . Esto significa que muchos biomarcadores, en particular en la etapa temprana de una enfermedad no pueden ser detectados por MS convencional y MRM 2. Además, la presencia de proteínas de alta abundancia tales como la albúmina y la inmunoglobulina en fluidos biológicos complejos, con frecuencia máscara por exc mil millones de vecesess de baja abundancia, proteínas de bajo peso molecular y péptidos 3, 4. Por esta razón se requieren varias etapas preparatorias de la muestra antes de la secuenciación de espectrometría de masas y la identificación. Uno de tales paso preparatorio emplea el agotamiento de proteínas de alta abundancia con columnas de agotamiento disponibles comercialmente 5-8. Desafortunadamente este paso conduce a la reducción del rendimiento de biomarcadores candidatos porque son a menudo asociadas no covalentemente con proteínas portadoras que están siendo eliminados. Otro desafío está representado por la estabilidad de biomarcadores candidatos ex vivo una vez que se recogieron las muestras. Las proteínas están sujetos a la degradación por proteasas endógenas o exógenas 9. Nanopartículas hidrogel puede superar estos retos críticos mediante la amplificación de la concentración de biomarcador putativo a un nivel dentro del rango del ensayo, mientras que la protección de la proteína de la degradación 10-13.
Es importante señalar ªLMW en proteínas en la sangre son una mezcla de proteínas intactas pequeñas, así como fragmentos de proteínas grandes. Proteínas del tejido derivado de más de 60 kDa son demasiado grandes para entrar pasivamente el flujo de sangre a través de la membrana basal vascular, pero pueden ser representados en la sangre como péptidos o fragmentos de proteínas 14. Nuestro objetivo es medir los biomarcadores novedosos de circulación que pueden ser candidatos para la detección temprana de la enfermedad, estratificación de los pacientes para la terapia y el seguimiento de la respuesta al tratamiento. Nuestros nanopartículas se crean para excluir selectivamente inmunoglobulinas alta abundancia y albúmina, mientras que la captura simultáneamente proteínas y péptidos más pequeños y concentrándolos hasta 100 veces, dependiendo del volumen de partida.
Nuestro grupo identificó un conjunto de pequeñas colorantes orgánicos que pueden actuar con éxito como de alta afinidad cebos moleculares para proteínas y péptidos. Colorante de unión a proteínas se cree que es debido a una combinación de interacción hidrófoba y electrostáticas. Los anillos aromáticos en el tinte se intercalan con las proteínas a través de bolsillos hidrófobos sobre la superficie de la proteína 11.
Los cebos, dependiendo de su química, muestran una afinidad particular para las clases de analitos seleccionados. Los cebos compiten con las proteínas portadoras, como la albúmina, para las proteínas o péptidos. El peso de proteínas / péptidos de bajo peso molecular se quedan atrapados en la partícula. Proteínas de alto peso molecular tales como la albúmina y la inmunoglobulina se impide la entrada de la partícula debido a la capacidad de tamizado debido a la restrictiva de poro del hidrogel 11 (Figura 1).
Nanopartículas de hidrogel son sintetizados por polimerización por precipitación iniciada por persulfato de amonio 11. N-isopropilacrilamida (Nipam), co-monómeros de ácido acrílico (AAC) y alilamina (AA) y el agente de reticulación N, N '-Methylenebisacrylamide (BIS) se dejó reaccionar a 70 ° C durante 6 horas en condiciones diluidas 11, 13. La afinidad de unión de alta proteína de poli (N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico) (poli (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis logrado mediante la incorporación de covalentemente colorantes que contienen grupos amino (es decir., Colorantes sulfonatedanthraquinonetriazine) en las nanopartículas a través una reacción de amidación se realiza en disolventes acuosos u orgánicos dependiendo de las características hidrófilas / hidrófobas de los colorantes 11, se utiliza 13. sustitución nucleofílica de los grupos amina en la nanopartícula con el átomo de cloruro de un colorante anthraquinonetriazine para crear poli contiene el colorante (Nipam -CO-alilamina) (AA) nanopartículas 11, 12. Un procedimiento de polimerización de dos etapas se utiliza para crear nanopartículas de hidrogel que contiene una capa exterior de ácido vinilsulfónico (VSA) 11, 13.
Nanopartículas de hidrogel se pueden aplicar a diversos fluidos biológicos, incluyendo sangre entera, plasma, suero, fluido cerebroespinal, sudor, y orina. En un solo paso, en solución, la nanoparticles realizan una rápida (en minutos) el secuestro y la concentración de analitos de bajo peso molecular 10, 11, 13, 15-18. Las proteínas se eluyeron posteriormente de las nanopartículas y se detectaron usando Western Blot 19-21, espectrometría de masas 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, inmunoensayos / ELISA 10, 11, 15, 18, o microarrays de proteínas de fase inversa 16, 24 ensayos. Las nanopartículas funcionalizadas con el cebo químico, y la presentación de un núcleo o núcleo de la arquitectura cáscara, captura y se concentran las proteínas sobre la base de las propiedades fisicoquímicas de cebo / corteza. Diferentes colorantes incorporados en las nanopartículas, por lo tanto capturar diferentes subconjuntos de proteínas con eficiencia basado en la afinidad de tinte, el pH de la solución, y la presencia / ausencia de competir proteínas de alto abundante 13 variable. Además, la cantidad de nanopartículas en relación con el volumen de la solución afectará a la producción de proteína a partir de las nanopartículas. Estos aspectos dehidrogel nanopartícula cosecha se demostró utilizando tres cebos nanopartículas diferentes para las proteínas de recolección de muestras de plasma que contienen altas cantidades de proteínas, y de las muestras de orina que normalmente no contienen grandes cantidades de proteína. En este protocolo se demuestra la recolección y la concentración de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) a partir de muestras de plasma utilizando poli (NIPAM-co-AAC), poli (NIPAM / tinte), y las nanopartículas core-shell (poli (NIPAM-co-VSA)) . Poli (NIPAM / colorante) nanopartículas se muestran para concentrar el antígeno especies Mycobacterium que se añadió a las muestras de orina humanos, para imitar los individuos infectados por el Mycobacterium tuberculosis.
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Protocol
El plasma humano y se recogió la orina de donantes voluntarios sanos, con el consentimiento informado por escrito, después de George Mason University Institutional Review Board aprobó protocolos. Los donantes se distribuyeron por igual entre hombres caucásicos y mujeres entre las edades de 25 y 42 muestras fueron analizadas de forma individual y no se agruparon.
1. Nanoparticle Procesamiento de suero o plasma Muestras
Biomarcadores abundantes bajas potenciales en plasma son capturados, en solución, con nanopartículas de hidrogel. Las partículas se añaden al plasma, se incubaron, separadas por centrifugación, se lavaron, y las proteínas capturadas se eluyen. Las proteínas eluidas se secan bajo flujo de nitrógeno durante aguas abajo secuenciación de espectrometría de masas y la identificación.
- Diluir 500 l de suero de 1: 2 con 50 mM Tris HCl pH 7 (500 l de suero + 500 l Tris HCl) en un tubo de microcentrífuga.
- Añadir 500 l de poli (Nipam / AAC) nanop núcleoartículos. Incubar durante 15 min a TA.
- Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante.
- Añadir 500 l tiocianato de sodio (25 mM) al sedimento. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces.
- Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante.
- Añadir 500 l de agua MilliQ al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces.
- Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y deseche el sobrenadante.
- Prepare el buffer de elución fresca: Añadir 700 l de acetonitrilo a 300 l de hidróxido de amonio en un tubo limpio. Precaución: El hidróxido de amonio es corrosivo. Utilizar con una ventilación adecuada. Nota: El tampón de elución debe ser prepared inmediatamente antes del uso. No guarde el tampón de elución.
- Añadir 300 l de tampón de elución al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Incubar durante 15 min a TA.
- Girar la muestra a 16.100 xg, 25 ° C durante 10 min en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo. Retire y guarde el eluido en un tubo de microcentrífuga limpio, etiquetado.
- Repita los pasos 1.9 a 1.10. Combinar los dos eluidos en un tubo de microcentrífuga.
- Secar los eluidos bajo flujo de nitrógeno en un colector del evaporador de nitrógeno a 42,1 ° C, con flujo de aire se establece en 8 (Figura 2F).
- Almacenar el producto eluido se secó a temperatura ambiente durante O / N de almacenamiento, o a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo, antes de la espectrometría de masas, el Western Blot, o ensayos ELISA (opcional).
2. Procesamiento de nanopartículas de Muestras de orina
La orina normal contiene menos de 30 mg / dl de proteína ymenos de 1+ sangre. Sin embargo, muchas enfermedades / condiciones pueden alterar los niveles normales de proteína en la orina y la sangre. Para ayudar en la determinación del volumen óptimo de nanopartículas para añadir a la muestra de orina, un análisis de orina se lleva a cabo antes de la recolección de nanopartículas. Pueden existir biomarcadores de orina en concentraciones extremadamente bajas, que pueden requerir la optimización de la relación de las nanopartículas con el volumen de orina. Este procedimiento describe nanopartículas recolección de muestras de orina para el análisis de transferencia de Western aguas abajo.
- Recoger muestras de orina en un vaso de plástico limpio y seco. Se requiere un volumen mínimo de 22 ml. Orina conserve las muestras a -80 ° C hasta el momento de analizar.
- Descongele la orina congelada a temperatura ambiente oa 4 ° CO / N. Mezclar brevemente en un vórtex. Vierta al menos 22 ml de orina en un tubo de polipropileno de fondo cónico de 50 ml.
- Gira la orina en una centrífuga con un rotor oscilante en 3700 xg durante 15 min. Decantar la orina, sin perturbar el sedimento, en un polypr fondo cónico de 50 ml limpiotubo opylene. Deseche el sedimento.
- Realice un análisis de orina usando un multi-analito "tira reactiva de orina" tira reactiva. Nota: almacene las tiras reactivas en un recipiente herméticamente cerrado, protegido de la luz solar directa y la humedad 17, 18.
- Coloque la tira reactiva, boca arriba, sobre una toalla de papel limpia y seca.
- Usar una pipeta desechable para aspirar 1 ml de la orina preparado en la etapa 2.3.
- Establecer un temporizador durante 2 minutos, pero no lo inicie. Dispensar rápidamente 1 - 2 gotas de orina en cada almohadilla de prueba de la tira de reactivo. Iniciar inmediatamente el temporizador. Nota: No sumerja la tira reactiva directamente en el recipiente de la orina. Los indicadores de colorante / químicas en la tira de reactivo potencialmente pueden filtrarse fuera de la tira de reactivo en el recipiente de orina.
- A la hora indicada en el envase tira de reactivo, registrar los resultados cualitativos para los diversos analitos en la tira de reactivo mediante la comparación del color de las tiras reactivas individuales en los correspondientes indica un código de coloresres en el recipiente de reactivo. Resultados de orina normales típicos son: (normal o negativo) de sangre, proteínas, leucocitos, nitrito, glucosa, cetona, bilirrubina y urobilinógeno; PH de la orina (5,5 a 7,0); gravedad específica (1,001-1,020). Nota: Los niveles altos de proteína en una muestra de orina, pueden competir con la proteína de interés en los puntos de las nanopartículas vinculante. Para maximizar la cosecha proteína con nanopartículas, la relación de volumen de volumen de nanopartículas / orina se puede ajustar a cualquiera de limitar la competencia de las proteínas de alta abundancia, o puede ser optimizado para cosechar las proteínas que existen en concentraciones muy bajas. Si el valor de proteína en la orina es 1 + o mayor, añadir volúmenes 2x de las nanopartículas en el paso 2.5 a continuación. Si el analito de interés es una proteína abundante muy bajo, puede ser necesario aumentar el volumen de las nanopartículas hasta 2 ml (Figura 3).
- Transferir 20 ml de la orina aclarado desde el paso 2.3 en un tubo de polipropileno de 50 ml de fondo cónico limpio. Noperturbar cualquier residuo / pellet que puede estar en la parte inferior del tubo de la orina. Añadir 200 l de nanopartículas a la muestra 20 ml de orina. Mezclar brevemente en un vórtex. Nota: Si el valor de proteína en la orina es 1 + o mayor, añadir 400 l de nanopartículas a 20 ml de orina.
- Incubar la mezcla de orina / nanopartícula durante 30 min a RT, sin balanceo / mezcla.
- Haga girar la suspensión orina / nanopartícula en una centrífuga equipada con un rotor oscilante en 3700 xg durante 10 min. Nota: Si un pellet no es visible después de la centrifugación, girar las muestras para un adicional de 2 - 7 min.
- Retire y deseche el sobrenadante. Añadir 500 l de agua MilliQ al sedimento de nanopartículas.
- Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Transferir la solución de nanopartículas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio.
- Girar las nanopartículas en una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo a 16.100 xg durante 10 min. Nota: Si un pellet no es visible folLowing centrifugación, girar las muestras para un adicional de 2 - 7 min.
- Retire y deseche el sobrenadante.
- Repita los pasos 2,8 y 2,11 (dos veces) con 200 l 18 MilliQ agua para lavar las nanopartículas.
- Prepare el buffer de elución fresca: Añadir 970 l de acetonitrilo a 30 l de hidróxido de amonio en un tubo limpio. Precaución: El hidróxido de amonio es corrosivo. Utilizar con una ventilación adecuada. Nota: El tampón de elución debe prepararse inmediatamente antes de su uso. No guarde el tampón de elución.
- Añadir 20 l de tampón de elución al sedimento de nanopartículas. Resuspender las nanopartículas con la pipeta vigorosamente hacia arriba y abajo varias veces. Incubar durante 15 min a TA.
- Haga girar las muestras de nanopartículas a 16.100 xg durante 10 min. Retire y guarde el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. No perturbar el sedimento de nanopartículas. Deseche el sedimento en la basura de riesgo biológico.
- Colocar las muestras en un estante en una campana para vapores químicos. Abra las tapas y aumUbaté a TA durante 30 min. Alternativamente, colocar las muestras bajo flujo de nitrógeno a 40 ° C hasta que se seque (1 - 2 h).
- Añadir 15 l de Tris-glicina SDS tampón de muestra (2x) a las muestras. Se calienta a 100 ° C en un bloque de calor seco durante 5 minutos con las tapas abiertas o hasta que el volumen que queda en el tubo no es más de 20 l. Nota: no utilizar un baño de agua hirviendo. La humedad del baño de agua será evitar la evaporación de la memoria intermedia.
- Coloque la tapa en los tubos. Sacar los tubos del bloque de calor. La muestra puede ser almacenada a -80 ° C o utilizarse inmediatamente para el análisis de transferencia de western aguas abajo.
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Representative Results
Hidrogel Nanoparticle Tamaño y Uniformidad
Poli (Nipam-AAC) partículas se han producido con muy alto rendimiento y reproducibilidad entre y dentro de los lotes. Las partículas tienen muy buena estabilidad coloidal a temperatura ambiente durante el tiempo necesario para la captura, almacenamiento, y la elución de las proteínas (por lo menos 48 h), y la precipitación de nanopartículas no se ha observado (Figura 1) 11. La estabilidad coloidal puede ser muy importante para la rápida absorción de proteínas / péptido por las nanopartículas.
Biomarcadores de baja abundancia potenciales cosechadas a partir de plasma
La incorporación de la carnada colorante impulsa la absorción de las moléculas en solución y asegura que las moléculas capturadas se conservan de la degradación 13, 15, 18, 25. Por esta razón, los inhibidores de la proteasa no son necesarios durante el procesamiento previo de la muestra. Este atributo de las nanopartículas hace suitable como una tecnología de preservación para la recogida de muestras en el campo y para el envío de fluidos biológicos a TA.
La molécula de cebo puede ser incorporado en la partícula de hidrogel mediante copolimerización o unión covalente a los grupos funcionales presentes en la nanopartícula. Como ejemplo, poli (NIPAM-co-AAC) nanopartículas se construyeron con aminoácidos que contienen colorantes a través de longitud cero reacciones de amidación de reticulación, mientras que las nanopartículas con una carcasa exterior que contiene un copolímero de ácido vinilsulfónico (VSA) fueron creados por una segunda reacción de polimerización 10-13. Diferentes tipos de nanopartículas se pueden producir mediante la incorporación de un colorante químico diferente dentro de la nanopartícula y por lo tanto mejorar la recolección de clases específicas de proteínas. Un concepto importante de nuestra tecnología es que los diferentes cebos pueden muestran una afinidad preferencial por diferentes proteínas debido a que la interacción proteína-colorante depende principalmente de una combinación de interacciones hidrofóbicas, interacciones 3-Dciones, y las fuerzas electrostáticas. Hemos observado que algunos analitos pueden ser capturados con una alta afinidad por químicamente diferentes tintes debido a la complejidad de las fuerzas de unión. Ver Tamburro et al., Para una extensa explicación y ejemplos de este principio 13. Por ejemplo, se utilizaron cuatro tipos diferentes de cebo de captura (nanopartículas) para cosechar TNF a partir de plasma usando 200 l de partículas y 200 l de plasma para cada tipo de nanopartícula. En todos los casos después del tratamiento con las nanopartículas, TNF no era detectable en el sobrenadante por SDS-PAGE con tinción de plata, mientras que TNF era detectable en el eluato de nanopartículas (Figura 1C). (Carril 1 = TNFa recombinante (MW 17.000 Da), carriles 2 y 3, 4 y 5, 6 y 7 y 8 y 9 representan los resultados para cuatro tipos diferentes de cebos de nanopartículas respectivamente; C = control, S = sobrenadante, P = nanopartícula eluato).
Dosis-respuesta para DiffeTipos de alquiler N anoparticles
Con el fin de realizar una curva de calibración, y por lo tanto evaluar el rendimiento y la precisión, los experimentos deben realizarse con proteínas de pinchos-en de concentración conocida. Los resultados publicados para una variedad de fluidos corporales y analitos demuestran cómo la nanopartícula pre-procesamiento mantiene la linealidad del ensayo y establece una curva de calibración al tiempo que mejora el límite de detección efectiva de 10, 16, 26. También hemos publicado estudios de entre-precisión de laboratorio usando las nanopartículas para realizar multi-reacción monitoreo espectrometría de masas como la creciente sensibilización 27.
Para comparar IL-17 eficacia de la recolección por diferentes tipos de nanopartículas, se añadió IL-17 recombinante (17,5 kDa) a muestras de plasma a que, o bien poli (NIPAM-co-AAC) o poli (NIPAM-co-VSA) nanopartículas se añadieron posteriormente . Dos conjuntos de cuatro diluciones en serie de 100 ng de IL-17 recombinante se prepararon en 10081; l de plasma (100 ng / l 100, 50 ng / l 100, 25 ng / l 100 y 12,5 ng / l 100). poli (NIPAM-co-AAC) o poli (NIPAM-co-VSA) partículas se añaden a las muestras de plasma respectivos en un 1: (v / v) de partículas 1: relación de plasma. Un ensayo de proteína total espectrofotométrica se realizó en las muestras de sobrenadante. Western Blot con anticuerpo policlonal de conejo anti-IL-17 se realizó en 20 g de sobrenadante de plasma (S) después de la cosecha de nanopartículas y los eluatos de nanopartículas (P) (Figura 4). Ambos tipos de nanopartículas adecuadamente cosechada y concentrada por IL-17 en cada dilución. Las bandas adicionales en la transferencia de western representan albúmina de suero humano y la inmunoglobulina que reacciona de forma cruzada con el anticuerpo secundario. (partículas AAC: calles 1 y 2 = 1 ng / l IL-17, carriles 3 y 4 = 0,50 ng / l, carriles 5 y 6 = 0,25 ng / l, carriles 7 y 8 = 0.125 ng / l, Carril 9 = IL-17; partículas VSA: Los carriles 1 y 2 = 1 ng / l IL-17, carriles 3 y 4 = 0,50 ng / l,Los carriles 5 y 6 = 0,25 ng / l, carriles 7 y 8 = 0.125 ng / l).
La detección de proteínas potencialmente de diagnóstico en la orina
Muestras de orina humana, obtenidas de donantes voluntarios sanos con el consentimiento informado por escrito, se les añadió una especie de Mycobacterium antígeno recombinante proteína secretora temprana Target Mycobacterium tuberculosis (ESAT-6) para imitar los individuos infectados por Mycobacterium tuberculosis. 1 g cada uno de ESAT-6 (15 kDa) y la IL-2 (15,5 kDa) se añadieron a alícuotas de 1 ml de orina humana recogidos de donantes voluntarios sanos. El análisis de orina se realizó sobre las muestras con una tira de reactivo de orina para determinar la relación óptima de nanopartículas a la orina, que se basa en la presencia / ausencia de proteínas urinarias. Poli (NIPAM / colorante) nanopartículas se utilizaron para cosechar proteínas a partir de muestras de orina tratados y no tratados. Electroforesis en gel unidimensional de los eluatos de nanopartículas se realizó followed por tinción con plata. Las muestras en U4 y U6 carriles representan eluidos de nanopartículas de ESAT-6 y IL-2 muestras de orina tratados, mostrando claramente bandas prominentes a 15 kDa (Figura 5). La espectrometría de masas de los eluatos identificados ESAT-6 (UniProt POA567 adhesión, 84,0 cobertura, 9 péptidos) e IL-2 (UniProt P60568 adhesión, 38,56 cobertura, 3 péptidos). Orina sin recolección de nanopartículas se muestra en el carril de la etiqueta "sin".
Figura 1. Nanopartículas cosecha y concentrar las proteínas de baja abundancia de fluidos biológicos complejos. (A) Flujo de trabajo para las proteínas de la cosecha. Tiempo total de procesamiento es de aproximadamente 1,5 horas. Las proteínas en solución se concentran a partir de sangre, suero, plasma, orina, sudor, saliva, u otros fluidos corporales (concentración 1000 veces representado). (B)Lote para la comparación por lotes que muestra el tamaño uniforme de las nanopartículas. Microscopía de Fuerza Atómica sobre mica muestra uniformidad de tamaño (0,7 m de diámetro) y ausencia de aglutinación en dos lotes de nanopartículas. Electroforesis en gel (C) 1-D, con la posterior tinción con plata, de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) secuestrado a partir de plasma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. nanopartículas procedimiento de recogida de plasma / suero para el análisis de espectrometría de masas aguas abajo. Nanopartículas (A) permanecen suspendidas en solución de (poli (NIPAM / colorante) se muestra). (B) nanopartículas se añaden a la muestra de plasma diluido. (C) La nanopartícula-plasma suspensión is girar en una centrífuga para separar las nanopartículas a partir del sobrenadante. (D) Mensaje centrifugación, las nanopartículas formar un sedimento distinta en la parte inferior del tubo. (E) Después de lavar las nanopartículas, se retira el eluato que contiene las proteínas cosechadas y se guarda . para el análisis de aguas abajo (F) El eluido se seca en corriente de nitrógeno en un evaporador a 42.1 ° C, el flujo de aire 8, por 1 -. 2 horas antes de la espectrometría de masas Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de orina usando tiras de reactivo multi-analito para el control de calidad de la muestra. (A) Cada almohadilla en la tira de reactivo se impregna con tintes químicos, enzimas, y / o indicadores que reaccionan con una diferiranalito orina ENT (por ejemplo., glucosa, bilirrubina, cetonas, gravedad específica, sangre, pH, proteína, urobilinógeno, nitrito, y / o esterasa de leucocitos). La orina se clarificó por centrifugación. Una gota de orina se añade a cada pad en la tira reactiva. (B) El color de cada pad se compara visualmente con los bloques de color en el contenedor, a la hora especificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La recolección de IL-17 a partir de plasma utilizando núcleo (AAC) o core-shell (VSA) nanopartículas. Electroforesis en gel de 1-D y Western Blot con anti-IL-17 demuestra la capacidad de ácido acrílico (AAc) y VSA nanopartículas de núcleo y corteza para cosechar varios concentrations de IL-17 a partir de plasma. (S = sobrenadante después de la cosecha de nanopartículas, las partículas P = nanopartícula eluato AAC:. Carriles 1 y 2 = 1 ng / l IL-17, carriles 3 y 4 = 0,50 ng / l, carriles 5 y 6 = 0.25ng / l, Lanes 7 & 8 = 0.125 ng / l, Lane 9 = IL-17; partículas VSA: Calles 1 y 2 = 1 ng / l IL-17, carriles 3 y 4 = 0,50 ng / l, carriles 5 y 6 = 0,25 ng / mu l, carriles 7 y 8 = 0.125 ng / l) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Recuperación de antígeno de Mycobacterium tuberculosis y citoquinas IL-2 a partir de orina utilizando nanopartículas de hidrogel. Tinción de plata siguiente 1-D gEL electroforesis de muestras de orina. Las muestras en los carriles U4 y U6 representan eluidos de muestras de orina que contienen recombinante ESAT-6 y IL-2, mostrando claramente bandas prominentes a 15 kDa. La espectrometría de masas de los eluatos identificados ESAT-6 (UniProt POA567 adhesión, 84,0 cobertura, 9 péptidos) e IL-2 (UniProt P60568 adhesión, 38,56 cobertura, 3 péptidos). (RAW = orina sin recolección de nanopartículas; U1, U2, U3, U5, U7, U8 = orina carecen de ESAT-6 y IL-2 tras la recolección nanopartícula recombinante). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de la proteína | Número de proteínas GI | Concentración en el suero / plasma [ng / ml] | Referencia |
| abl-interactor 1 isoforma un | 61743942 | Desconocido | |
| AMP-activated proteína quinasa gamma2 isoforma subunidad un | 33186925 | Desconocido | |
| Cas-Br-M (murino) ecotropic retroviral transformadora secuencia | 52426745 | Desconocido | |
| quimiocinas (motivo CC) ligando 18 (pulmonar y la activación regulado) | 4506831 | 30 | 34 |
| quimiocina (Motivo CC) ligando 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| condroadherina | 153251229 | Desconocido | |
| cromosoma 16 marco de lectura abierto 80 | 8392875 | Desconocido | |
| Consortin | 213021160 | Desconocido | |
| defensina, alfa 4, corticostatin | 4503303 | Desconocido | |
| 20149675 | Desconocido | ||
| glicoproteína Ib (plaquetas), polipéptido beta | 4504073 | Desconocido | |
| proteína de unión a nucleótidos de guanina (proteína G), polipéptido q | 40254462 | Desconocido | |
| Heparanasa | 148746204 | Desconocido | |
| factor de crecimiento similar a la insulina 2 (somatomedina A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritina | 15187164 | Desconocido | |
| derivado de células de leucocitos quimiotaxina 2 | 59806345 | 200000 | 33 |
| lipocalina 2 (oncogén 24p3) | 38455402 | 0.05 | 28 |
| Monoglicérido lipasa, CRA_b isoforma | 6005786 | Desconocido | |
| N-etilmaleimida sensible proteína de unión del factor, alphun | 47933379 | Desconocido | |
| un corte homeobox 2 | 119220564 | Desconocido | |
| fibra densa exterior de colas de los espermatozoides 4 | 171184433 | Desconocido | |
| paladar, pulmón y nasal epitelio asociado | 18765705 | Desconocido | |
| reconocimiento de la proteína peptidoglicano 2 | 156616294 | Desconocido | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| CASC3 Proteína | 15721939 | Desconocido | |
| RAB27B, RAS miembros la familia del oncogén | 5729997 | Desconocido | |
| Asociación Ras (RalGDS / AF-6) de la familia de dominio 6 isoforma un | 29789443 | Desconocido | |
| relacionados con ras RAB10 proteína de unión a GTP | 33695095 Desconocido | ||
| proteína de dedo de anillo 166 | 30520320 | Desconocido | |
| respuesta de la privación de suero (proteína de unión a fosfatidilserina) | 4759082 | Desconocido | |
| familia transportista soluto 33 (transportador-acetil CoA), miembro 1 | 4757708 | Desconocido | |
| ST6 beta-galactosamida 2,6-alfa-isoforma un sialyltranferase 1 | 27765091 | 15 | 32 |
| -timosina como 3 | 34013530 | Desconocido | |
| potenciador transducina como de división 3 (E (SP135) homólogo, Drosophila) | 157384982 | Desconocido | |
| transglutaminasa 1 | 4507475 | Desconocido | |
| WD repetición de dominio 1 | 9257257 | Desconocido | |
| WD repetición de dominio 91 | 222080092 | px; "> Desconocido||
| de repetición que contiene 2 xin actina vinculante | 119372317 | Desconocido |
Cuadro 1 Ejemplos de proteínas de baja abundancia cosechados por nanopartículas de suero / plasma. (PeptideAtlas peptidome espectrometría de masas) 28-34 Adaptado con referencia permissionfrom 13 (Tamburro, D. et al nanopartículas core-shell Multi-funcionales:... Descubrimiento de biomarcadores previamente invisibles J Am Chem Soc, 133, 19178 a 19188, (2011 ).) Derechos de autor 2011 American Chemical Society.
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Discussion
Importancia clínica
Se cree que una muestra de suero o plasma para contener baja abundancia de proteínas y péptidos que pueden proporcionar una rica fuente de información sobre el estado del organismo en su conjunto en circulación. A pesar de la promesa de la proteómica en suero, hay tres barreras fisiológicas fundamentales y serios que frenan el descubrimiento de biomarcadores y la traducción al beneficio clínico 10, 11, 16, 25.
Pueden existir 1. biomarcadores diagnósticos importantes en muy baja abundancia (concentración) en la sangre. Tejido enfermo etapa temprana, tales como lesiones de cáncer pre-metastásicos, puede constituir menos de unos pocos mm 3. Biomarcadores arrojar a la circulación de un volumen de tejido tan pequeño se convertirá en altamente diluido en todo el volumen de la sangre. Pueden existir analitos pertinentes por debajo de los límites de detección de espectrometría de masas y los inmunoensayos convencionales.
2. biomarcadores de abundancia bajo /proteínas están enmascarados por la presencia de abundantes proteínas altas tales como la albúmina y la inmunoglobulina, que representan hasta el 90% del proteoma del plasma 14.
3. proteínas y los péptidos son susceptibles a la degradación por proteasas endógenas y exógenas siguiente punción venosa y la muestra transporte / almacenamiento. La degradación de proteínas puede conducir a resultados positivos o falsos negativos falsos 35.
Nanopartículas de hidrogel se desarrollaron como porosos, flotantes, polímeros que contienen colorantes anthraquinonetriazine y / o conchas ácido vinilsulfónico para la proteína y la cosecha péptido y la preservación en fluidos corporales 11, 13. Nuestro grupo sintetizado y probado nanopartículas funcionalizadas de hidrogel con una plétora de colorantes orgánicos (es decir. , sulfonados y tintes no sulfonatedanthraquinonetriazine) y mostraron las afinidades preferenciales para varias proteínas analitos 11, 13. También establecimos protocolos para el descubrimiento de biomarcadores que utilizannanopartículas de hidrogel con la linfa, saliva, fluido cerebroespinal, sudor, orina, plasma, sangre, o suero especímenes 11, 13, 23, 24, 26.
Optimización de los parámetros de recolección nanopartícula antes de proteínas de cosecha de preciosas muestras clínica / investigación es necesaria para obtener resultados ideales. La cantidad de proteína en las muestras debe cuantificarse para determinar la relación óptima de las nanopartículas con el volumen de la muestra. Para los analitos de concentración desconocida, una curva de dosis-respuesta utilizando proteínas recombinantes proporciona información con respecto a los límites de detección. Si hay muestra adecuada, varios tipos de nanopartículas se pueden utilizar para determinar la nanopartícula ideal para el analito y de la muestra.
Análisis de orina antes de la recolección de nanopartículas proporciona una comprobación de control de calidad de la muestra de orina. La afinidad de la carnada de tinte de nanopartículas depende del punto de la proteína de interés y el pH del medio circundante isoeléctrico. PH de la orina seaentre 5,5 y 7,0 es óptimo para la cosecha de proteínas con los poli (Nipam / tinte) nanopartículas. La presencia de glóbulos rojos intactos o hemolizadas (1 + sangre en la tira de reactivo) no interfiere con la cosecha de nanopartículas.
En este protocolo se centró en la aplicación de las nanopartículas de hidrogel para cosechar las proteínas del plasma y la orina. Las aplicaciones futuras podrían comprender otros fluidos corporales tales como vítreo del ojo, o fluido sinovial. Potencial en aplicaciones in vivo se puede prever para el futuro en el que las nanopartículas se inyectan en el tejido enfermo para recoger biomoléculas. El trabajo futuro se centrará también en el desarrollo de nuevos dispositivos para la captura y preservación de los biomarcadores, tales como un parche para la piel a base de nanopartículas para el análisis del proteoma trasudado piel.
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Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, amablemente ayudó con la recopilación de datos y el análisis se muestra en la Figura 5. Este trabajo fue apoyado en parte por (1) George Mason University, (2) el italiano IstitutoSuperiore di Sanita 'en el marco de la Italia / EE.UU. convenio de colaboración entre el Departamento de Salud y Servicios Humanos, la Universidad George Mason, y el Ministerio de Salud Pública italiana, (3) de los NIH, subvenciones del programa IMAT 1R21CA137706-01 y 1R33CA173359-01 a LAL, y (4) Nanociencias Ceres, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
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