Abstract
Novel biomarkörer spelar en avgörande roll för att ge mer känsligt och specifikt påvisande sjukdom. Tyvärr har många låg-överflöd biomarkörer som finns i biologiska vätskor kan inte vara lätt upptäckas med masspektrometri eller immun eftersom de förekommer i mycket låga koncentrationer, är labila och ofta maskerade med hög förekomst proteiner såsom albumin eller immunglobulin. Bete innehållande poly (N-isopropylakrylamid) (NIPAm) baserade nanopartiklar är i stånd att övervinna dessa fysiologiska barriärer. I ett steg de kan fånga, koncentrera och bevara biomarkörer från kroppsvätskor. Lågmolekylära analyter in i kärnan i nanopartikel och fångas upp av olika organiska kemiska färgämnen, som fungerar som hög affinitetsprotein beten. Nanopartiklarna kan koncentrera proteinerna av intresse genom flera tiopotenser. Denna koncentrationsfaktor är tillräcklig för att öka proteinnivån, så att proteinerna är inomdetektionsgränsen för nuvarande masspektrometrar, western blotting och immunanalyser. Nanopartiklar kan inkuberas med en uppsjö av biologiska vätskor och de har möjlighet att i hög grad anrika koncentrationen av lågmolekylära proteiner och peptider medan exklusive albumin och andra högmolekylära proteiner. Våra data visar att en 10.000-faldig amplifiering av koncentrationen av en särskild analyt kan åstadkommas, vilket möjliggör masspektrometri och immunoanalyser för att detektera tidigare odetekterbara biomarkörer.
Introduction
Trots slutförandet av det mänskliga genomet sekvensering, har betydande framsteg inte lyckats identifiera biomarkörer prediktiva för tidiga sjukdomsstadier, eller som korrelerar med terapeutiska resultat, eller prognos 1. En orsak till denna brist på framsteg är att många potentiellt viktiga biomarkörer existerar vid en mängd som ligger under detektionsgränsen för konventionell masspektrometri och andra biomarkörer plattformar. Masspektrometri (MS) och Multiple Reaction Monitoring (MRM) har en detektionskänslighet typiskt större än 50 ng / ml medan majoriteten av de analyter mätas genom immunanalyser i ett kliniskt laboratorium faller inom intervallet mellan 50 pg / ml och 10 ng / ml . Detta innebär att många biomarkörer, särskilt i ett tidigt skede av en sjukdom som inte kan detekteras med konventionell MS och MRM 2. Dessutom närvaron av hög förekomst proteiner såsom albumin och immunoglobulin i komplexa biologiska vätskor ofta mask med miljarder gånger excess låg överflöd, lågmolekylära proteiner och peptider 3, 4. Därför flera prov förberedande steg krävs innan masspektrometri sekvensering och identifiering. En sådan förberedande steg sysselsätter utarmningen av hög förekomst proteiner med kommersiellt tillgängliga utarmning kolumnerna 5-8. Tyvärr detta steg leder till en minskning av utbytet av tänkbara biomarkörer eftersom de ofta är icke-kovalent associerat med bärarproteiner som håller på att avlägsnas. En annan utmaning representeras av stabiliteten i kandidat biomarkörer ex-vivo när proven samlas. Proteiner är föremål för nedbrytning av endogena eller exogena proteaser 9. Hydrogel nanopartiklar kan överskrida dessa kritiska utmaningar genom att förstärka den förmodade biomarkörer koncentrationen till en nivå inom området för analysen, och samtidigt skydda proteinet från nedbrytning 10-13.
Det är viktigt att notera thpå LMW proteiner i blodet är en blandning av små intakta proteiner samt fragment av stora proteiner. Vävnadshärledda proteiner större än 60 kDa är för stora för att passivt in i blodomloppet genom det vaskulära basalmembranet, men de kan vara representerade i blod såsom peptider eller proteinfragment 14. Vårt mål är att mäta nya cirkulerande biomarkörer som kan vara kandidater för tidig upptäckt av sjukdomen, patientens stratifiering för terapi, och övervakning av behandlingssvar. Våra nanopartiklar skapas för att selektivt utesluta hög förekomst immunoglobuliner och albumin, medan samtidigt fånga mindre proteiner och peptider och koncentrera dem upp till 100-faldig beroende på utgångsvolymen.
Vår grupp identifierat en uppsättning av små organiska färgämnen som framgångsrikt kan fungera som hög affinitet molekylära beten för proteiner och peptider. Protein-dye bindning tros bero på en kombination av hydrofoba och elektrostatisk växelverkanar. De aromatiska ringarna på färgämnet interfoliera med proteiner via hydrofoba fickor på proteinytan 11.
Betet, beroende på deras kemi, visar en särskild affinitet för valda klasser av analyter. Betet konkurrera med bärarproteiner, såsom albumin, för de proteiner eller peptider. De lågmolekylära proteiner / peptider bli instängd i partikeln. Högmolekylära proteiner, såsom albumin och immunoglobulin förhindras från att komma in i partikeln på grund av siktningsförmåga på grund av det begränsande porstorlek av hydrogelen 11 (figur 1).
Hydrogel nanopartiklar syntetiseras av utfällningspolymerisation initierats av ammoniumpersulfat 11. N-isopropylakrylamid (NIPAm), är co-monomerer av akrylsyra (AAC) och allylamin (AA) och tvärbindare N.N'-Methylenebisacrylamide (BIS) reagera vid 70 ° C under 6 timmar i utspädda villkor 11, 13. Det höga proteinbindningsaffinitet av poly (N-isopropylakrylamid-sam-akrylsyra) (poly (NIPAm-sam-AAC) nanoparticlesis uppnås genom kovalent införlivande av aminoinnehållande färgämnen (dvs.., Sulfonatedanthraquinonetriazine färgämnen) i nanopartiklar genom en amideringsreaktion utföras i vattenhaltiga eller organiska lösningsmedel, beroende på de hydrofila / hydrofoba egenskaper hos färgämnena 11, 13. nukleofil substitution av amingrupperna i nanopartikeln med kloridatomen hos en anthraquinonetriazine färgämne används för att skapa färgämnesinnehållande poly (NIPAm -CO-allylamin) (AA) nanopartiklar 11, 12. En två-stegs polymerisationsprocess utnyttjas för att skapa hydrogel nanopartiklar som innehåller ett yttre skal av vinylsulfonsyra (VSA) 11, 13.
Hydrogel nanopartiklar kan appliceras på olika biologiska vätskor, däribland helblod, plasma, serum, cerebrospinalvätska, svett och urin. I ett steg, i lösning, den n:anoparticles utföra en snabb (inom minuter) beslag och koncentration av lågmolekylära analyter 10, 11, 13, 15-18. Proteiner därefter elueras från nanopartiklar och detekteras med hjälp av Western blotting 19-21, masspektrometri 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, immun / ELISA 10, 11, 15, 18, eller omvänd fas proteinmicroarray 16, 24 analyser. Nanopartiklar funktion med kemisk bete, och presentera en kärna eller kärn skal arkitektur, fånga och koncentrera proteiner baserade på bete / skal fysikalisk-kemiska egenskaper. Olika färgämnen införlivas i nanopartiklarna kommer därför fånga olika undergrupper av proteiner med varierande effektivitet baserat på färgämnesaffinitet, lösningens pH och närvaron / frånvaron av konkurrerande hög-flödande proteiner 13. Vidare kommer mängden av nanopartiklar i förhållande till volymen av lösningen påverka proteinutbytet från nanopartiklarna. Dessa aspekter avhydrogel nanopartiklar skörd demonstreras med hjälp av tre olika nanopartiklar beten skörd proteiner från plasmaprover som innehåller höga halter av protein, och från urinprover som vanligtvis inte innehåller stora mängder protein. I detta protokoll visar vi skörd och koncentrering tumörnekrosfaktor alfa (TNFa) från plasmaprover med användning av poly (NIPAm-sam-AAC), Poly (NIPAm / färgämne) och kärn- shell nanopartiklar (Poly (NIPAm-sam-VSA)) . Poly (NIPAm / färgämne) nanopartiklar visat att koncentrera Mycobacterium arter antigen som tillsattes till humana urinprov, för att efterlikna Mycobacterium tuberculosis-infekterade individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human plasma och urin samlades från friska frivilliga givare, med skriftligt informerat samtycke, efter George Mason University Institutional Review Board godkända protokoll. Givarna var jämnt fördelade mellan kaukasiska män och kvinnor i åldrarna 25 och 42 prov analyserades var för sig och var inte samman.
1. Nanoparticle Bearbetning av serum eller plasmaprover
Potentiella låga rikliga biomarkörer i plasma fångas, i lösning, med hydrogel nanopartiklar. Partiklarna sättes till plasma, inkuberades, separeras genom centrifugering, tvättades och de infångade proteinerna elueras. De eluerade proteinerna torkades under kväveflöde för nedströms masspektrometri-sekvensering och identifiering.
- Späd 500 ul av serum 1: 2 med 50 mM Tris-HCI, pH 7 (500 | il serum + 500 | il Tris-HCl) i ett mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 500 mikroliter av poly (NIPAm / AAC) core nanopartiklar. Inkubera under 15 min vid RT.
- Spin provet vid 16.100 xg, 25 ° C under 10 min i en centrifug utrustad med en fixerad vinkelrotor. Avlägsna och kassera supernatanten.
- Lägg 500 pl natriumtiocyanat (25 mM) till pelleten. Resuspendera nanopartiklar genom kraftig pipettering upp och ned flera gånger.
- Spin provet vid 16.100 xg, 25 ° C under 10 min i en centrifug med en fixerad vinkelrotor. Avlägsna och kassera supernatanten.
- Lägg 500 l av MilliQ vatten till nanopartikelpellet. Resuspendera nanopartiklar genom kraftig pipettering upp och ned flera gånger.
- Spin provet vid 16.100 xg, 25 ° C under 10 min i en centrifug med en fixerad vinkelrotor. Avlägsna och kassera supernatanten.
- Bered färsk elueringsbuffert: Lägg 700 l acetonitril till 300 ^ ammoniumhydroxid i ett rent rör. Varning: Ammoniumhydroxid är frätande. Använd med lämplig ventilation. Obs: Elueringsbufferten måste vara prepARöda omedelbart före användning. Förvara inte elueringsbufferten.
- Lägg 300 ^ il elueringsbuffert till nanopartikelpellet. Resuspendera nanopartiklar genom kraftig pipettering upp och ned flera gånger. Inkubera under 15 min vid RT.
- Spin provet vid 16.100 xg, 25 ° C under 10 min i en centrifug med en fixerad vinkelrotor. Ta ut och spara eluatet i en ren, märkt mikrocentrifugrör.
- Upprepa steg från 1,9 till 1,10. Kombinera de två eluat i ett mikrocentrifugrör.
- Torka eluaten under kväveflöde i en kvävgasindunstare grenrör vid 42,1 ° C, med luftflödet inställt på 8 (Figur 2F).
- Förvara den torkade eluatet vid RT i O / N lagring eller vid -20 ° C för långtidsförvaring, före masspektrometri, western blotting eller ELISA-analyser (valfritt).
2. Nanoparticle Behandling av Urinprov
Normal urin innehåller mindre än 30 mg / dl protein ochmindre än 1 + blod. Men många sjukdomar / tillstånd kan förändra de normala nivåerna av urinprotein och blod. För att underlätta att finna den volym av nanopartiklar för att lägga till i urinprovet, är en urinanalys utförs före nanopartiklar skörd. Urin biomarkörer kan existera i extremt låga koncentrationer, vilket kan kräva att optimera förhållandet mellan nanopartiklar till urinvolymen. Denna procedur beskriver nanopartiklar skörd av urinprov för nedströms western blot-analys.
- Samla urinprov i en ren, torr plastmugg. En 22 ml minimivolym krävs. Affär urin prover vid -80 ° C tills den ska analysera.
- Tina den frusna urin vid RT eller vid 4 ° CO / N. Blanda kort på en virvelblandare. Häll minst 22 ml urin in i en 50 ml konisk botten polypropenrör.
- Snurra urinen i en centrifug med swing-out rotor vid 3.700 xg under 15 minuter. Häll av urin, utan att störa pelleten, i en ren 50 ml konisk botten polypropylene röret. Kassera pelleten.
- Utför urinalysis användning av en multianalyt "urin dipstick" reagensremsa. Obs: Förvara reagensremsor i en väl tillsluten behållare borta från direkt solljus och fukt 17, 18.
- Lägg reagensremsa, sidan uppåt, på en ren, torr pappershandduk.
- Använd en engångspipett att aspirera en ml av urin som framställts i steg 2,3.
- Ställ in en timer för 2 min men inte starta den. Snabbt fördela 1-2 droppar av urin på varje testdyna av reagensremsa. Omedelbart starta timern. OBS: Doppa inte reagensremsan direkt i urinbehållaren. Färgämnet / kemiska indikatorer i reagensremsa kan eventuellt läcka ut från reagensremsan i urinbehållaren.
- På tiden som anges på reagensstickor, spela in de kvalitativa resultaten för de olika analyter på reagensremsan genom att jämföra färgen på enskilda reagensremsor till motsvarande färgkodade indicarer på reagensbehållaren. Typiska normala urin resultaten är: (normal eller negativ) efter blod, protein, leukocyter, nitrit, glukos, keton, bilirubin och urobilinogen; Urin pH (5,5-7,0); specifik vikt (1,001-1,020). OBS: Hög proteinnivåer i ett urinprov kan konkurrera med proteinet av intresse om bindningsställen på de nanopartiklar. För att maximera proteinskörd med nanopartiklar, kan nanopartikelvolym / urinvolymen förhållandet justeras till antingen begränsar konkurrensen från hög förekomst proteiner, eller kan optimeras för att skörda proteiner som finns i mycket låga koncentrationer. Om urinproteinvärdet är 1 + eller större, till 2x volymer av nanopartiklar i steg 2.5 nedan. Om analyten av intresse är en mycket låg förekommande proteinet, kan det vara nödvändigt att öka volymen av nanopartiklar upp till 2 ml (Figur 3).
- Överför 20 ml av den klarade urin från steg 2.3 till en ren 50 ml konisk botten polypropylen rör. Intestör eventuellt skräp / pellet som kan vara i botten av urinröret. Lägg 200 pl av nanopartiklar till urinprovet 20 ml. Blanda kort på en virvelblandare. OBS: Om urinproteinvärdet är 1 + eller större, tillsätt 400 l av nanopartiklar till 20 ml urin.
- Inkubera urin / nanopartikelblandningen under 30 min vid RT, utan gungning / blandning.
- Snurra urinen / nanopartikelsuspension i en centrifug utrustad med swing-out rotor vid 3.700 xg under 10 minuter. Obs: Om en pellet är inte synliga efter centrifugering, snurra proven under ytterligare 2-7 min.
- Avlägsna och kassera supernatanten. Tillsätt 500 l MilliQ vatten till nanopartikelpellet.
- Resuspendera nanopartiklar genom kraftig pipettering upp och ned flera gånger. Överför nanopartikellösning till en ren 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Snurra nanopartiklar i en centrifug utrustad med en fast vinkel rötor vid 16.100 xg under 10 min. Obs: Om en pellet inte syns foljande centrifugering, snurra proven under ytterligare 2-7 min.
- Avlägsna och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 2,8 och 2,11 (två gånger) med 200 ^ 18 MilliQ vatten för att tvätta nanopartiklar.
- Bered färsk elueringsbuffert: Lägg 970 l acetonitril till 30 l ammoniumhydroxid i ett rent rör. Varning: Ammoniumhydroxid är frätande. Använd med lämplig ventilation. Obs: Elueringsbufferten måste beredas omedelbart före användning. Förvara inte elueringsbufferten.
- Lägg 20 pl elueringsbuffert till nanopartikelpellet. Resuspendera nanopartiklar genom kraftig pipettering upp och ned flera gånger. Inkubera under 15 min vid RT.
- Snurra nanopartiklar proverna vid 16.100 xg under 10 minuter. Avlägsna och spara supernatanten i en ren, 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inte störa nanopartikelpellet. Kasta pelleten i biologiskt papperskorgen.
- Placera proverna i ett ställ i en kemisk draghuv. Öppna locken och ökaUbate vid RT under 30 min. Alternativt placera proverna under kväveflöde vid 40 ° C tills den är torr (1-2 h).
- Lägg 15 pl Tris-glycin SDS-provbuffert (2x) till proverna. Värm vid 100 ° C i ett värmeblock under 5 minuter med locken öppna eller tills volymen kvar i röret är inte mer än 20 ^ il. OBS: använd inte ett kokande vattenbad. Fukten från vattenbadet kommer att förhindra avdunstning av bufferten.
- Placera locket på rören. Ta bort rören från värmeblocket. Provet kan lagras vid -80 ° C eller användes omedelbart för nedströms western blot-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hydrogel nanopartiklar Storlek och likformighet
Poly (NIPAm-AAC) partiklar har tillverkats med extremt hög avkastning och reproducerbarhet mellan och inom partier. Partiklarna har väldigt bra kolloidalt stabilitet vid RT under den tid som krävs för avskiljning, lagring och eluering av proteiner (minst 48 h) och nanopartiklar nederbörden har inte observerats (figur 1) 11. Den kolloidala stabiliteten kan vara mycket viktig för snabb protein / peptidupptag av nanopartiklar.
Potentiella låg förekomst Biomarkers Skördade från plasma
Införlivandet av färgämnet bete driver upptaget av molekyler i lösning och försäkrar att infångade molekyler är bevarade från nedbrytning 13, 15, 18, 25. Av denna anledning är proteashämmare inte behövs under provförbehandling. Detta attribut av nanopartiklarna gör dem suitable som en konservering teknik för provtagning i fält och för transport av biologiska vätskor vid RT.
Betet molekyl kan införlivas i hydrogelen partikeln genom sampolymerisation eller kovalent bindning till funktionella grupper närvarande i nanopartikeln. Som ett exempel har poly (NIPAm-sam-AAC) nanopartiklar tillverkade med amininnehållande färgämnen via noll längd tvärbindnings amideringsreaktioner, medan nanopartiklar med ett yttre skal innehållande vinylsulfonsyra (VSA) sampolymer ades av en andra polymerisationsreaktion 10-13. Olika typer av nanopartiklar kan framställas genom att införliva en annan kemisk färgämne inom nanopartikel och därmed förbättra avverkning av specifika klasser av proteiner. Ett viktigt begrepp i vår teknik är att olika beten kan visa framförallt affinitet för olika proteiner, eftersom interaktionen färgämnet-proteinet beror främst på en kombination av hydrofoba interaktioner, 3-D interactioner, och elektrostatiska krafter. Vi har observerat att vissa analyter kan fångas med en hög affinitet genom att kemiskt olika färgämnen på grund av komplexiteten av bindningskrafterna. Se Tamburro et al. För en omfattande förklaring och exempel på denna princip 13. Till exempel har fyra olika typer av fångst bete (nanopartiklar) som används för att skörda TNF från plasma med hjälp av 200 pl partiklar och 200 pl plasma för varje typ av nanopartiklar. I samtliga fall efter behandling med nanopartiklarna, TNFa kunde inte detekteras i supernatanten genom SDS-PAGE med silverfärgning, medan TNFa var detekterbart i nanopartikel eluatet (Figur 1C). (Lane 1 = rekombinant TNF (MW 17.000 Da), Lanes 2 & 3, 4 och 5, 6 & 7 och 8 och 9 representerar resultaten för fyra olika typer av nanopartiklar beten respektive; C = kontroll, S = supernatant, P = nanopartikel eluat).
Dos-respons för diffehyres Typer av N anoparticles
För att kunna utföra en kalibreringskurva, och därmed bedöma avkastningen och precision, experiment behöver utföras med spetsade-i proteiner med känd koncentration. Publicerade resultat för olika kroppsvätskor och analyter visa hur nanopartikel förbehandling bibehåller linjäritet av analysen och upprättar en kalibreringskurva samtidigt förbättra den effektiva detektionsgränsen 10, 16, 26. Vi har också publicerat studier av mellan-laboratorieprecision med hjälp av nanopartiklar för att utföra flera reaktion övervakning masspektrometri med förbättrad känslighet 27.
Att jämföra IL-17 skörd effektivitet genom olika typer av nanopartiklar, var rekombinant IL-17 (17,5 kDa) sattes till plasmaprover till vilka antingen poly (NIPAm-sam-AAC) eller poly (NIPAm-sam-VSA) nanopartiklar tillsattes därefter . Två uppsättningar av fyra seriespädningar av 100 ng av rekombinant IL-17 framställdes i 10081; l plasma (100 ng / 100 | il, 50 ng / 100 | il, 25 ng / 100 | il och 12,5 ng / 100 | il). poly (NIPAm-sam-AAC) eller poly (NIPAm-sam-VSA) partiklar tillsattes till de respektive plasmaprover i ett 1: 1 (volym / volym) partikel: plasma-förhållandet. En spektrofotometrisk total proteinanalys utfördes på de överstående prover. Western blotting med anti-kanin-polyklonal-IL-17 genomfördes på 20 ng av plasma supernatant (S) efter nanoparticle skörd och de nanopartiklar eluaten (P) (figur 4). Båda nanopartiklar typerna adekvat skördas och koncentrerad IL-17 vid varje utspädning. De ytterligare band på western blöt representerar humant serumalbumin och immunglobulin som korsreagerar med den sekundära antikroppen. (AAC partiklar: Lanes 1 & 2 = 1 ng / ^ il IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / ul, Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / | il, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ul, Lane 9 = IL-17; VSA partiklar: Lanes 1 & 2 = 1 ng / ^ il IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / | il,Spår 5 och 6 = 0,25 ng / l, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / l).
Upptäckt av potentiellt Diagnostiska äggvita i urinen
Mänskliga urinprov, som erhållits från friska frivilliga givare med skriftligt informerat samtycke, spetsades med en rekombinant mykobakteriearter antigen Tidig Sekretorisk Target Mycobacterium Tuberculosis protein (ESAT-6) för att efterlikna Mycobacterium tuberculosis-infekterade individer. 1 ^ g vardera av ESAT-6 (15 kDa) och IL-2 (15,5 kDa) sattes till 1 ml alikvoter av urin som samlats in från friska frivilliga givare. Urinanalys utfördes på proverna med en urinreagensremsa för att bestämma den optimala förhållandet mellan nanopartiklar till urin, som bygger på närvaro / frånvaro av urinproteiner. Poly (NIPAm / färgämne) nanopartiklar användes för att skörda proteiner från behandlade och obehandlade urinprov. Endimensionell gelelektrofores av nanopartiklar eluaten utfördes followed genom silverfärgning. Prov i U4 och U6 körfält representerar nanopartiklar eluat från ESAT-6 och IL-2-behandlade urinprover, som tydligt visar framstående band vid 15 kDa (Figur 5). Masspektrometri av eluaten identifierade ESAT-6 (UniProt anslutningen POA567, 84,0 täckning, 9 peptider) och IL-2 (UniProt anslutningen P60568, 38,56 täckning, tre peptider). Urin utan nanopartiklar skörd visas i körfältet märkt "Raw".
Figur 1. Nanopartiklar skörd och koncentrera låga förekomst proteiner från komplexa biologiska vätskor. (A) Arbetsflöde för skörd proteiner. Total behandlingstid är cirka 1,5 timme. Proteiner i lösning koncentreras från blod, serum, plasma, urin, svett, saliv eller andra kroppsvätskor (1000-faldig koncentration avbildad). (B)Parti till parti jämförelse visar samma storlek av nanopartiklar. Atomkraftsmikroskopi på glimmer visar enhetlig storlek (0,7 | im diameter) och frånvaro av klumpning i två partier av nanopartiklar. (C) 1-D-gelelektrofores, med efterföljande silverfärgning, av tumörnekrosfaktor alfa (TNFa) sekvestreras från plasman. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Nanoparticle skörd förfarande från plasma / serum för nedströms analys masspektrometri. (A) Nanopartiklar hålla sig svävande i lösningen (Poly (NIPAm / färg) visas). (B) Nanopartiklar läggs till det utspädda provet plasma. (C) Den nanopartikel-plasma fjädring is som centrifugerades i en centrifug för att separera de nanopartiklar från supernatanten. (D) in centrifugering, nanopartiklarna bildar en tydlig pellet i botten av röret. (E) Efter tvättning av nanopartiklar, är det eluat som innehåller de skördade proteiner avlägsnas och sparas . för nedströms analys (F) Eluatet torkas under kväveflöde i en indunstare vid 42,1 ° C, luftflöde 8, 1 -. 2 h före masspektrometri Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Urinanalys med hjälp av multi-analyt reagensremsor för prov kvalitetskontroll. (A) Varje dyna på reagensremsan impregneras med kemikalier, enzymer och / eller indikatorfärgämnen, vilka reagerar med en skiljerent urin analyt (t ex., glukos, bilirubin, keton, specifik vikt, blod, pH, protein, urobilinogen, nitrit och / eller leukocyt-esteras). Urin klargörs genom centrifugering. En droppe urin tillsätts till varje pad på reagensremsan. (B) Färgen på varje dyna jämförs visuellt med färgblocken på behållaren, vid den angivna tidpunkten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Skörd IL-17 från plasma med hjälp av kärna (AAC) eller core-shell (VSA) nanopartiklar. 1-D-gelelektrofores och western blotting med anti-IL-17 visar förmågan av akrylsyra (AAc) och VSA core shell nanopartiklar för att skörda olika concentrations av IL-17 från plasma. (S = supernatanten efter nanopartiklar skörd, P = nanopartiklar eluat AAC partiklar:. Lanes 1 & 2 = 1 ng / l IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / l, Lanes 5 & 6 = 0.25ng / l, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / l, Lane 9 = IL-17, VSA partiklar: Spår 1 & 2 = 1 ng / l IL-17, Lanes 3 & 4 = 0,50 ng / l, Lanes 5 & 6 = 0,25 ng / il, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / l) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Återvinning av Mycobacterium tuberculosis-antigen och cytokin IL-2 från urin med hjälp av hydrogel nanopartiklar. Silverfärgning efter 1-D gel elektrofores av urinprov. Prover i spår U4 och U6 representera eluaten från urinprov innehållande rekombinant ESAT-6 och IL-2, som tydligt visar framträdande band vid 15 kDa. Masspektrometri av eluaten identifierade ESAT-6 (UniProt anslutningen POA567, 84,0 täckning, 9 peptider) och IL-2 (UniProt anslutningen P60568, 38,56 täckning, tre peptider). (RAW = urin utan nanopartiklar skörd, U1, U2, U3, U5, U7, U8 = urin saknar rekombinant ESAT-6 och IL-2 efter nanopartiklar skörd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Proteinnamn | GI proteinnummer | Koncentration i serum / plasma [ng / ml] | Referens |
| abl-påverkare en isoform en | 61743942 | Okänd | |
| AMP-aktiverat proteinkinas gamma2 subenhet isoform a | 33186925 | Okänd | |
| Cas-Br-M (mus) ekotropiskt retroviral trans sekvens | 52426745 | Okänd | |
| kemokin (CC motiv) ligand 18 (lung och aktivering-reglerade) | 4506831 | 30 | 34 |
| kemokin (CC-motiv) ligand 5 | 22538814 | 1,5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Okänd | |
| kromosom 16 öppen läsram 80 | 8392875 | Okänd | |
| Consortin | 213021160 | Okänd | |
| defensin, alfa 4, corticostatin | 4503303 | Okänd | |
| 20149675 | Okänd | ||
| glykoprotein Ib (trombocyter), beta polypeptid | 4504073 | Okänd | |
| guanin nukleotid bindande protein (G-protein), q-polypeptid | 40254462 | Okänd | |
| Heparanas | 148746204 | Okänd | |
| insulinliknande tillväxtfaktor 2 (somatomedin A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | Okänd | |
| leukocyt cell härledd kemotaxinet 2 | 59806345 | 200.000 | 33 |
| lipokalin 2 (onkogen 24p3) | 38455402 | 0,05 | 28 |
| Monoglycerid lipas, isoform CRA_b | 6005786 | Okänd | |
| N-etylmaleimid-känslig faktor fastsättning protein, alphen | 47933379 | Okänd | |
| ett snitt homeobox 2 | 119220564 | Okänd | |
| yttre tät fiber av sperma svansar 4 | 171184433 | Okänd | |
| gommen, lunga och nasala epitel associeras | 18765705 | Okänd | |
| peptidoglykan erkännande protein 2 | 156616294 | Okänd | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Protein CASC3 | 15721939 | Okänd | |
| RAB27B, medlems ras-onkogen familjen | 5729997 | Okänd | |
| Ras association (RalGDS / AF-6) domän familj 6 isoform a | 29789443 | Okänd | |
| ras-relaterat GTP-bindande protein RAB10 | 33695095 Okänd | ||
| ringfingerprotein 166 | 30520320 | Okänd | |
| serumdeprivation respons (fosfatidylserin bindande protein) | 4759082 | Okänd | |
| löst ämne bärare familj 33 (acetyl-CoA transportör), ledamot 1 | 4757708 | Okänd | |
| ST6 beta-galactosamide alfa-2,6-sialyltranferase 1 isoform a | 27765091 | 15 | 32 |
| tymosin liknande 3 | 34013530 | Okänd | |
| transducin liknande förstärkare av split 3 (E (sp135) homolog, Drosophila) | 157384982 | Okänd | |
| transglutaminas 1 | 4507475 | Okänd | |
| WD upprepa domän 1 | 9257257 | Okänd | |
| WD upprepa domän 91 | 222080092 | px; "> Unknown||
| xin aktinbindande upprepa innehållande 2 | 119372317 | Okänd |
Tabell 1 Exempel låg förekomst proteiner skördas av nanopartiklar från serum / plasma. (PeptideAtlas peptidome masspektrometri) 28-34 Anpassad med permissionfrom referens 13 (Tamburro, D. et al Multifunktionella kärna-skal nanopartiklar:... Upptäckt av tidigare osynliga biomarkörer J Am Chem Soc, 133, 19.178-19.188, (2011 ).) Copyright 2011 American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinisk Relevans
Ett serum eller plasmaprov tros innehålla låga överflöd cirkulerande proteiner och peptider som kan ge en rik källa till information om tillståndet i organismen som helhet. Trots löftet om serum proteomik, det finns tre grundläggande och allvarliga fysiologiska hinder stävja biomarkörer och översättning till klinisk nytta 10, 11, 16, 25.
1. Viktiga diagnostiska biomarkörer kan finnas i extremt låg förekomst (koncentration) i blodet. Tidigt sjuk vävnad, till exempel för-metastatisk cancer lesioner, kan utgöra mindre än några mm 3. Biomarkörer skjul i cirkulationen från en så liten vävnadsvolym kommer att bli mycket utspädd i hela blodvolymen. Relevanta analyter kan finnas under gränserna för masspektrometri och konventionella immundetektions.
2. Låga överflöd biomarkörer /proteiner är maskerad av närvaron av höga flödande proteiner, såsom albumin och immunoglobulin, som representerar upp till 90% av plasma proteomet 14.
3. Proteiner och peptider är känsliga för nedbrytning av endogena och exogena proteinaser efter venpunktion och provtransport / förvaring. Protein nedbrytning kan leda till falskt positiva eller falskt negativa resultat 35.
Hydrogel nanopartiklar utvecklades som porösa, stigande, polymerer innehållande anthraquinonetriazine färgämnen och / eller vinylsulfonsyra skal för protein och peptid skörd och bevarande i kroppsvätskor 11, 13. Vår grupp syntetiserat och testat hydrogel nanopartiklar funktion med en uppsjö av organiska färgämnen (dvs. , sulfonerade och icke-sulfonatedanthraquinonetriazine färgämnen) och visade de förmånliga affinitet för flera proteinanalyter 11, 13. Vi har också etablerat protokoll för identifiering av biomarkörer som använderhydrogel-nanopartiklar med lymfa, saliv, cerebrospinalvätska, svett, urin, plasma, blod, eller serumprover 11, 13, 23, 24, 26.
Optimera nanopartikelavverkningsparametrar före skörd proteiner av värdefulla kliniska / forskningsprover är nödvändigt för perfekt resultat. Mängden protein i proverna skall kvantifieras för att bestämma det optimala förhållandet av nanopartiklar till provvolymen. För analyter av okänd koncentration, en kurva dos-respons med hjälp av rekombinanta proteiner ger information om detektionsgränser. Om det finns lämpligt stickprov, kan olika typer av nanopartiklar användas för att bestämma den ideala nanopartiklar för analyten och provet.
Urinanalys före nanopartiklar skörd ger en check kvalitetskontroll urinprov. Affiniteten av nanopartikeln färgämnet bete beror på den isoelektriska punkten för proteinet av intresse och pH hos det omgivande mediet. Urin pH varalan 5,5 och 7,0 är optimalt för proteinskörd med poly (NIPAm / färgämne) nanopartiklar. Närvaron av hemolyserat eller intakta röda blodkroppar (1 + blod på reagensremsan) stör inte nanoparticle skörd.
I detta protokoll fokuserade vi på tillämpningen av hydrogel nanopartiklar att skörda proteiner från plasma och urin. Framtida applikationer kan innefatta andra kroppsvätskor som ögats glaskropp, eller ledvätska. Potential in vivo applikationer kan tänkas för framtiden, där nanopartiklar injiceras i sjuk vävnad för att samla biomolekyler. Det framtida arbetet kommer också att inriktas på utveckling av nya enheter för avskiljning och bevarande av biomarkörer, såsom en nanopartikel-baserad hudlapp för analys av huden transudate proteome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, vänligen hjälp med datainsamling och analys visas i Figur 5. Detta arbete stöddes delvis av (1) George Mason University, (2) den italienska IstitutoSuperiore di Sanita "inom ramen för Italien / USA samarbetsavtal mellan US Department of Health och Human Services, George Mason University, och det italienska hälsoministeriet, (3) NIH, Imat programbidrag 1R21CA137706-01 och 1R33CA173359-01 till LAL, och (4) Ceres Nanovetenskap, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
