Abstract
O objetivo deste protocolo de vídeo é discutir como executar e analisar uma fluorescente orbital experimento de rastreamento de partículas tridimensional usando uma versão modificada do microscópio de dois fótons 1. Ao contrário de abordagens convencionais (digitalização raster ou campo grande baseado em uma pilha de quadros), o monitoramento orbital 3D permite localizar e seguir com uma alta espacial (precisão nm 10) e resolução temporal (frequência de resposta de 50 Hz) o deslocamento 3D uma partícula fluorescente passar comprimento escalas de centenas de microns 2. O método baseia-se num algoritmo de realimentação que controla o hardware de um de dois fotões microscópio de varrimento laser, a fim de realizar uma órbita circular em torno do objecto a ser rastreado: o mecanismo de realimentação vai manter o objecto fluorescente no centro através do controlo da deslocação da o feixe de varrimento 3-5. Para demonstrar as vantagens desta técnica, seguimos uma organela em movimento rápido, o lisossoma, dentro de alcélula iving 6,7. As células foram semeadas de acordo com protocolos convencionais, e corados com um corante comercialmente lisossoma. Discutimos brevemente a configuração de hardware e de forma mais detalhada o software de controle, para realizar um experimento de monitoramento orbital 3D dentro de células vivas. Discutimos detalhadamente os parâmetros necessários, a fim de controlar o microscópio de varredura e permitir o movimento do feixe em uma órbita fechada em torno da partícula. Conclui-se, demonstrando como esse método pode ser efetivamente usado para rastrear o movimento rápido de um lisossoma marcado ao longo dos microtúbulos em 3D dentro de uma célula viva. Lisossomas podem mover-se com velocidades na gama de 0,4-0,5 um / seg, exibindo tipicamente um movimento dirigido ao longo da rede de microtúbulos 8.
Introduction
Um grande número de abordagens têm sido desenvolvidas até agora para controlar partículas fluorescentes em três dimensões utilizando um microscópio. A maioria das abordagens se baseiam na utilização de câmeras rápidas, ideal para acompanhar em duas dimensões, normalmente combinados com modificações personalizadas da óptica de emissão do microscópio para alcançar rastreamento na direção axial. Microscópios de varredura a laser (ou confocal ou dois fótons) convencionalmente pode acompanhar uma partícula fluorescente através da realização de uma seqüência de tempo de z-stacks, embora este processo é normalmente demorado, e produz resolução de tempo razoável (10 Hz) somente se a partícula ser rastreado é mantida no centro de uma pequena região de imagem raster por um mecanismo de feedback activo 2.
A ideia de bloqueio em que a partícula é a base do método de controle orbital. Em vez de um raster digitalizar uma órbita circular é realizada em torno da partícula fluorescente. A intensidade da fluorescência ao longoa órbita localiza com precisão a posição de partícula 4.
A posição localizada da partícula pode então ser utilizado para accionar os scanners de microscópio e centro-re a órbita na posição de partícula. Os scanners galvanométricos do microscópio são accionados por uma tensão analógica. O componente AC desta voltagem permite realizar uma órbita com o feixe de laser focado, ou seja, um seno e co-seno de onda aplicada aos X e Y digitalização espelhos irá permitir a realização de uma órbita circular. O desvio do sinal de corrente contínua facilita a mudança de posição do centro da órbita. Depois de um período de órbita, é determinada e a forma de onda para o sinal de corrente alternada está configurada, o sistema de realimentação tem de actualizar apenas o componente DC do sinal.
Um software capaz de ler o sinal de fluorescência recolhido dos detectores é necessário para controlar os leitores e detectores, para calcular a posição da partícula e actualizar o CC foradefinido. Para uma reacção de sucesso imagens de uma cuidadosa escolha dos parâmetros da órbita (tamanho e de sincronização) é necessária e estes parâmetros têm de ser ajustadas com base nas características das partículas fluorescentes que é necessário para controlar.
Os fundamentos físicos e matemáticos da técnica foram descritos no passado de 4,5 para ambas as aplicações de 2D e 3D. Neste protocolo, descrevemos resumidamente os principais componentes da configuração de hardware, e em mais detalhe a escolha dos parâmetros e a preparação da amostra necessária para uma experiência típica, permitindo-nos a seguir o deslocamento de um lisossoma em alta resolução temporal dentro de uma célula viva.
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Protocol
Preparação 1 Amostra
- Manter células CHOK1 em frascos de cultura de tecidos, utilizando meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 UI / ml de penicilina de 50 ug / ml de estreptomicina. Incubar as células em uma incubadora humidificada 5% CO 2 a 37 ° C.
- Colheita e, em seguida, as células CHOK1 prato sobre um diâmetro de micro-reservatório 14 mm, com uma espessura de superfície de 0,16 mm. Células de sementeira para a densidade óptima para a imagiologia, cerca de 60-70% de confluência.
- Incubar as células durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2. Lavam-se as células três vezes em HBSS (Solução Salina Tamponada de Hank), e incubar as células numa solução que contém 50 nM de Lyso Tracker DND26 verde e 150 nM de verde tubulina rastreador. Incubar as células durante 1 hora a 37 ° C. Passo opcional: Antes da incubação, realizar uma mancha adicional coloração com um corante de matriz mitocondrial (25 nM).
- Lavam-se as células três vezes em HBSS para remover qualquer corante não ligado. Adicionar meio de crescimento DMEM fresco antes de imagção das células.
2. Microscópio Configurações
O microscópio para o rastreamento de partículas descrito no protocolo de vídeo está montado na armação de um microscópio invertido comercialmente disponível (Figura 4). No entanto módulos comerciais para 3D rastreamento de partículas orbital já estão disponíveis.
- Use a Ti Coherent Chameleon-Ultra II: fonte de luz laser de excitação femtosegundo Sa, com um comprimento de onda de saída ajustável entre 690 nm-1040 nm.
- Certifique-se de que o feixe de laser é alinhado na porta traseira do microscópio usando espelhos revestidos por IR. O feixe de laser é atenuado usando uma placa de meia onda rotativa seguida por um polarizador linear calcite. Atenuar o feixe de modo a que a potência média da amostra está entre 0,5 e 2 mW.
NOTA: O feixe de laser é reflectido por um par de espelhos accionados galvanómetro-motores que permitem o controlo da posição e da trajectória do feixe focado no plano da amostra. Numaconfiguração típica do feixe laser colimado de sair dos espelhos galvanométricos ampliada (10x), que passa através de um expansor de feixe, antes de entrar na parte de trás da objectiva de microscópio, após reflexão no espelho dicróico de curta passagem. - Recolha a luz de fluorescência da amostra através da colocação de um objectivo água abertura numérica elevada (60X, NA 1.2) no caminho da luz. Escolher um cubo de filtro de fluorescência de acordo com os comprimentos de onda de emissão desejadas em uma ou duas configurações de canal. Empregam filtros de banda de emissão para seleccionar ainda mais a gama espectral da fluorescência emitida.
- Colocar a amostra para um palco motorizado, e ajustar o movimento fino da objetiva do microscópio usando um piezo-controlador objetivo.
- Dirigir a luz a partir do cubo de filtro em tubos fotomultiplicadores, onde o sinal é discriminados e enviadas para um I / O cartão de aquisição de dados digital.
NOTA: Os utilizadores são formas de onda da saída analógica da placa de I / O e são provided para os scanners sistema eletrônico. A entrada de contagem de fótons dos fotomultiplicadores e do sinal de saída para os scanners são medidos e controlados através do cartão de I / O por do Laboratório de Fluorescência software Dynamics SimFCS.
3 Imagens
- Posicione as células no palco e se concentrar utilizando transmitida iluminação de luz.
- Mudar para a imagem raster varredura para identificar as células que incorporaram o corante e visualizar os microtúbulos subjacentes. Identificar a área inicial onde o movimento vesícula está presente.
- Uma vez que uma vesícula isolada é identificado, definir os seguintes parâmetros para o rastreamento orbital:
- Seleccione o raio da órbita para definir o tamanho da varredura circular de acordo com o tamanho da partícula a ser rastreado. Para um ponto emissor, definir o raio da órbita igual à cintura da Função propagação ponto (PSF) do feixe de excitação para maximizar a sensibilidade e de resposta.
- Defina o axialdistanciar para definir a distância entre as duas órbitas que são realizados para localizar a posição de partículas ao longo da direcção axial. Defina a distância axial de 1,5-3 vezes a cintura PSF.
- Define o tempo de permanência de acordo com o brilho das partículas para definir o tempo gasto em cada ponto da órbita, que também irá determinar a taxa de branqueamento foto-. Use o tempo de espera entre 10-100 ms.
- Defina o número de pontos em cada órbita a 64 ou 128 para produzir períodos de órbita na ordem de 4-32 ms e fornecer uma alta resolução temporal para determinar a posição da partícula.
- Alterar o DC offset sinal enviado para os espelhos, a fim de centralizar o feixe sobre a partícula através da interface gráfica do usuário através de uma seleção cursor na imagem digitalizada-raster.
- Começar a acompanhar desligando o modo de microscópio de varredura de geração de imagens para digitalização orbital.
- Ative a coleta feedback e dados.
4. TrajectAnálise ory
- Usar o software para exibir a fluorescência recolhidos em cada ponto ao longo da órbita e, em cada ponto de tempo sob a forma de um «tapete intensidade '. A intensidade coletadas ao longo do tapete fornece informações sobre a interação da partícula com outros objetos brilhantes. Usar o software para mostrar tanto a informação percurso (isto é, o deslocamento de DC ao longo do tempo de x, y e digitalizadores do -piezo z), bem como a intensidade de fluorescência recolhido a partir do tubo de fotomultiplicador ao longo do tempo sob a forma de séries de tempo.
- Use a representação de séries temporais e as informações 'intensidade tapete "para selecionar apenas uma região de interesse na trajetória.
- Use o software para exibir uma projeção 2D da parte selecionada da trajetória da partícula. Selecione os controles apropriados para cor-código a trajetória de acordo com a intensidade de fluorescência de partículas.
- Selecione a opção para exibir o partigo trajetória em 3D, e cor code-lo de acordo com a intensidade de fluorescência. Gire a trajetória em 3D usando os controles para visualizar as características do movimento lisossomo ao longo do microtúbulo.
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Representative Results
De acordo com este protocolo de rastreio rápido 3D única partícula pode ser realizada dentro de células vivas utilizando um microscópio de dois fotões modificado para controlar o deslocamento de lisossomos marcados com fluorescência. O experimento realizado consiste em acompanhamento de um lisossoma isolado em movimento no interior da célula após o processo de maturação endosome 9. Os lisossomos foram coradas utilizando um corante fluorescente verde e animado em 930 nm exploram dois fótons de excitação. Os nossos dados mostram que é possível obter x, y, z trajectórias de deslocamento com uma resolução temporal de 32 ms (Figura 1a). A análise tapete mostra a intensidade registada ao longo de cada órbita ao longo do tempo (Figura 1b). Durante o acompanhamento da intensidade integrada da fluorescência emitida pode ser registada (Figura 2a). A trajetória de reconstrução 3D exibe uma moção dirigida, como se pode esperar de uma vesícula em movimento na rede de microtúbulos. Additionally, é possível correlacionar a trajetória 3D para uma imagem Varredura da região circundante (Figura 2b). Isto confirma o movimento da partícula ao longo da direcção de um feixe de microtúbulos.
As células foram adicionalmente marcadas com um marcador vermelho para mitocôndrias para gravar eventual interação da vesícula com essas organelas durante seu movimento. É possível correlacionar a trajectória 3D da partícula no interior da célula (Figura 3A) para o tapete intensidade registada a partir da emissão de fluorescência Mitotracker (Figura 3b). Isso nos permite gravar as interações de proximidade da vesícula com a rede mitocondrial em função da sua posição dentro da célula. O pico das emissões registado no "canal mitocôndrias" não dá informações funcionais sobre a forma como as organelas interagir. Ele pode fornecer apenas informações sobre o tempo de sua interaçãoe a posição espacial relativa do objecto fluorescente com respeito à partícula a ser rastreado. Esta posição relativa é extraído a partir do ângulo máximo da órbita em que o pico de emissão é registada. Uma representação esquemática do microscópio foi utilizado para realizar esta experiência pode ser observado na Figura 4.
Figura 1 Deslocamento vs trajetórias de tempo e intensidade do tapete. a) x, y e z deslocamento lisossoma vs vestígios de tempo. b) A trajectória intensidade (isto é, a intensidade recolhidos ao longo de cada eixo vertical órbita circular é o tempo) fornece informação sobre o ambiente de fluorescência da partícula. Os pontos brilhantes fora da caixa correspondem às interações da partícula com outros objetos brilhantes, e estão associados a saltos na trajetória como th e órbitas re-centra-se na fonte de fluorescência brilhante. A região em caixa corresponde à parte do percurso entre dois saltos.
Figura 2 Seguindo a trajetória 3D de um lisossoma. a) reconstrução 3D de uma parte da trajetória de um lisossoma coletados por meio de rastreamento de partículas. A trajetória é codificado por cores para a intensidade de fluorescência coletados a partir da partícula (vermelho, alto, azul, baixa contagem de fótons). Escalas eixos estão em nm. Note-se que x, y, z eixos têm diferentes gamas. Projeção b) 2D da trajetória 3D, exibindo uma sobreposição da trajetória em cima da microtúbulos fotografada em um raster varredura imediatamente após a trajetória foi coletado. C) As mitocôndrias coradas com Mitotracker .
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Figura 3. Estendendo o rastreamento orbital para mais de um canal (excitação a 930 nm). a) trajectória 3D de um lisossoma no interior da célula. b) Intensidade do tapete no canal verde (a fluorescência recolhidos neste canal é utilizado para controlo). c) Intensidade de tapete no canal vermelho, em que as mitocôndrias foram coradas com uma matriz fluorescente vermelho corante alvejado. As regiões onde a trajetória entra em contato com a mitocôndria (setas) aparecem como colisões de intensidade no tapete, como o feixe em órbita ao redor do lisossoma cruza na matriz mitocondrial.
Figura 4 Esquemas da instalação experimental: modificado de dois fótons microscópio. Representação esquemática do laser set-up: a 2-Photon Ti: Sa laser com uma gama 690-1,040 nm foi-nosed, de um polarizador e uma metade waveplate são usados para controlar a energia de excitação. Todos os outros itens estão listados na figura utilizando os códigos indicados. Usamos um objetivo 60X com um NA de 1,2.
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Discussion
Apesar dos avanços enormes de técnicas de microscopia de fluorescência e instrumentações, nos últimos anos, alcançando trajetórias de partículas fluorescentes em três dimensões com uma resolução temporal alta manteve-se um desafio no campo. Se alta resolução temporal foi alcançado partículas de rastreio em duas dimensões, a extensão no sentido axial tipicamente traz uma drástica redução na resposta de frequência do sistema 10.
Neste protocolo de vídeo, focada na aplicação demonstrativa de rastrear uma partícula individual em três dimensões dentro de uma célula viva com uma alta resolução temporal (32 ms neste experimento) usando um microscópio de dois fotões. A configuração necessária para a realização de tal experiência é geralmente disponível para laboratórios que realizam microscopia de varredura a laser. Ambos os instrumentos complementos monitoramento orbital 3D, bem como o software de controle estão disponíveis no mercado, para commerciamicroscópios de varredura a laser l, como os fabricados pela Olympus. O uso de uma fonte de laser de alta potência de infravermelhos pulsada, quando disponível, é vantajoso no desenho da instalação experimental, uma vez que não necessita de-varrimento da fluorescência emitida. Além disso, foi demonstrado no passado que a irradiação infravermelha é mais benigno para a célula, sob condições específicas de 11, tendo em conta a redução de fluorescência de foco e foto-branqueamento.
Embora o paralelismo de uma partícula fluorescente em duas dimensões pode ser realizado utilizando uma câmara sensível, a ausência de qualquer informação tridimensional pode ser, muitas vezes limitando a interpretar o significado da informação biofísica trajectória. Por exemplo, as vesículas se deslocam ao longo de microtúbulos freqüentemente se deparam com regiões microtúbulos interseção 8,12. Nesta situação, o uso de uma técnica de rastreio 3D ultrapassa o limite de utilização de projecções 2D de uma estrutura 3D.
Devido ao tempo de resposta do dispositivo nosso objectivo nanopositioner piezo, o período do movimento no eixo z é limitado a cerca de 30 ms, enquanto que os valores de x, y instruções que podem ir até alguns milissegundos. A precisão do método de localização de escalas como a relação sinal-ruído de 4,5. A única limitação aparente do método, ou seja, a perda de uma visão global do ambiente da partícula, é compensado pela possibilidade de reconstruir um tapete intensidade temporal de 13, traçando a história das interações da partícula fluorescente com fontes fluorescentes vizinhos, exibindo o mesmo ou uma emissão espectral diferente.
Mostramos que o movimento dos lisossomos, vesículas que sofrem de movimento ao longo dos microtúbulos dirigidas, alimentado por uma kinesins ou dyneins, pode ser seguido dentro de uma célula viva após coloração utilizando um corante disponível no mercado. Recentemente, 2D rastreamento dos lisossomos era correxultante com a imagem de super-resolução da rede de microtúbulos, no esforço de detectar as rotas que levam as vesículas em microtúbulos-microtúbulos interseções 8. Trajetórias 3D dos lisossomos exibir um comportamento mais complexo do movimento unidirecional. Apesar de uma média dirigido movimento pode ser observado, flexão, torção e rotações possíveis ao longo dos túbulos podem ser observados a partir dessas trajetórias.
Foram identificados dois passos críticos na realização destas experiências: em primeiro lugar, é necessário conseguir uma densidade de rotulagem dos lisossomos, que é ao mesmo tempo suficientemente elevada para se obter partículas brilhantes coradas, e que, ao mesmo tempo, proporciona uma densidade de partículas baixa o suficiente para permitir o rastreamento de partículas individuais. No caso de duas partículas de passagem, o microscópio pode mudar de uma partícula para o outro enquanto que um rasto. O segundo passo essencial diz respeito à escolha do tempo de permanência do pixel, o que permite um equilíbrio razoável sertre alta relação sinal-ruído e velocidade de deslocação. Temos observado que a velocidade de rastreamento na ordem de 32 ms por ciclo de monitoramento são geralmente suficiente para acompanhar os lisossomos submetidos movimento rápido direcionado a velocidades inferiores a 1 mícron / seg.
Em resumo, rastreamento orbital permite medir em três dimensões e com uma resolução temporal de 40 ms <o movimento intracelular de vesículas marcados com fluorescência. O rastreamento orbital 3D tem o potencial para ser empregado no futuro para o estudo de diferentes processos celulares altamente dinâmicos tais nos o estudo da dinâmica da cromatina tempo real, transcrição e difusão de nanopartículas plasmonic no meio intracelular.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
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