Abstract
Syftet med den här videon protokoll är att diskutera hur man ska utföra och analysera en tredimensionell fluorescerande orbital tracking partikelexperiment med hjälp av en modifierad två-photon mikroskop 1. Till skillnad från konventionella metoder (raster scan eller bred fält baserad på en hög med ramar), gör att 3D orbital tracking för att lokalisera och följa med en hög spatial (10 nm noggrannhet) och tidsmässig upplösning (50 Hz frekvensomfång) 3D förskjutning av en rörlig fluorescerande partikel på längdskalor från hundratals mikrometer 2. Metoden är baserad på en återkopplingsalgoritm som styr hårdvaran i en två-foton-laserscanningsmikroskop i syfte att utföra en cirkulär bana runt det objekt som skall spåras: återkopplingsmekanism kommer att bibehålla det fluorescerande objektet i centrum genom att styra förskjutningen av avsökningsstrålknippet 3-5. För att demonstrera fördelarna med denna teknik, följde vi en snabb rörelse organell, lysosomen inom aliving cell 6,7. Celler ströks enligt standardprotokoll och färgades med användning av en kommersiellt lysosom färgämne. Vi diskuterar kortfattat hårdvarukonfiguration och mer detaljerat kontroll programvara, för att utföra en 3D omloppsspårningsexperiment inuti levande celler. Vi diskuterar i detalj de parametrar som krävs för att styra svepmikroskop och möjliggöra rörelse av balken i en sluten bana kring partikeln. Vi avslutar med att visa hur denna metod kan användas effektivt för att spåra den snabba rörelsen av en märkt lysosom längs mikrotubuli i 3D i en levande cell. Lysosomer kan röra sig med hastigheter inom intervallet från 0,4 till 0,5 ^ m / sek, typiskt visar en riktad rörelse längs det mikrotubulära nätverket 8.
Introduction
Ett stort antal metoder har utvecklats till dags dato för att spåra fluorescerande partiklar i tre dimensioner med hjälp av ett mikroskop. De flesta tillvägagångssätt förlitar sig på användningen av snabba kameror, idealiskt lämpade för att spåra i två dimensioner, typiskt i kombination med anpassade modifieringar av de utsläpps optiken i mikroskop för att åstadkomma spårning i den axiella riktningen. Laserskanning mikroskop (antingen konfokala eller två fotoner) konventionellt kan spåra en fluorescerande partikel genom att utföra en tidssekvens av z-stackar, även om denna process är normalt tidskrävande och ger rimlig tid upplösning (10 Hz) om partikeln som spåras är hålls i centrum av en liten rasteravbildningsregionen av en aktiv återkopplingsmekanism 2.
Idén om att binda sig till partikeln är basen av omloppsspårningsmetoden. I stället för ett raster skanna en cirkulär bana utförs runt fluorescerande partikeln. Intensiteten i fluorescens längsbanan lokaliseras exakt partikel position 4.
Den lokaliserade positionen av partikeln kan sedan användas för att manövrera mikroskop skannrar och åter centrum omloppet på partikelpositionen. Galvanometern skannrar av mikroskopet drives av en analog spänning. AC-komponenten av denna spänning tillåter att utföra en omloppsbana med den fokuserade laserstrålen, dvs en sinus och en cosinus våg appliceras på X och Y avsökningsspeglar kommer att tillåta utförande av en cirkulär bana. Den DC-offset av signalen underlättar att ändra läget på den bana centrum. När en omlopp perioden bestäms och vågformen för AC-signalen är konfigurerad behöver återkopplingssystemet för att uppdatera endast likströmskomponenten av signalen.
En programvara kunna läsa fluorescerande signal samlas in från detektorerna krävs för att styra skannrar och detektorerna, för att beräkna positionen hos partikeln och uppdatera DC offinställd. För en lyckad respons avbildning ett noggrant val av bana parametrar (storlek och timing) krävs och dessa parametrar måste justeras baserat på egenskaperna hos de fluorescerande partiklar som det är nödvändigt för att spåra.
De fysiska och matematiska grunderna för den teknik som beskrevs tidigare 4,5 för både 2D och 3D-applikationer. I detta protokoll beskriver vi kortfattat de viktigaste hårdvarukomponenter för installationen, och mer detaljerat valet av parametrar och provberedning krävs för ett typiskt experiment tillåter oss efter förskjutningen av en lysosom på en hög tidsupplösning i en levande cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Provberedning
- Bibehåll CHOK1 celler i vävnadsodlingsflaskor med användning av DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 100 lU / ml penicillin 50 | ag / ml streptomycin. Inkubera cellerna i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
- Skörd och sedan plattan CHOK1 celler på en 14 mm diameter mikro bra med en yta tjocklek på 0.16 mm. Seed celler för optimal täthet för avbildning, cirka 60-70% sammanflytning.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C, 5% CO2. Tvätta cellerna tre gånger i HBSS (Hanks buffrade saltlösning), och inkubera cellerna i en lösning innehållande 50 nM av Lysotracker DND26 grönt och 150 nM av tubulin tracker grön. Inkubera cellerna under 1 h vid 37 ° C. Valfritt steg: Före inkubation, utföra ytterligare en fläck med en mitokondriell matris färgning färgämne (25 nM).
- Tvätta cellerna tre gånger i HBSS för att avlägsna eventuellt obundet färgämne. Lägg färskt DMEM tillväxtmedium före imaging cellerna.
2. Mikroskop Konfigurationer
Mikroskopet för spårning partikel som beskrivs i videon protokollet monteras på ramen av en kommersiellt tillgänglig inverterat mikroskop (Figur 4). Men kommersiella moduler för 3D tracking orbital partikeln finns nu tillgängliga.
- Använd en enhetlig Chameleon-Ultra II Ti: Sa femtosecond laserexcitation ljuskälla, med en inställbar utgångsvåglängdsområdet 690 nm-1040 nm.
- Se till att laserstrålen är inriktad i den bakre porten av mikroskopet med IR-belagda speglar. Laserstrålen har dämpats med användning av en roterande halwågsplatta följt av en kalcit linjär polarisator. Dämpa strålen så att den genomsnittliga effekten på provet är mellan 0,5 och 2 mW.
OBS: Laserstrålen reflekteras av ett par galvanometer-motor manövrerade speglar som tillåter kontroll över läget och banan för den fokuserade strålen i provplanet. I entypisk konfiguration kollimerade laserstrålen lämnar av galvanometerns speglar utvidgas (10X) som passerar genom ett strålexpanderare, innan den bakre delen av mikroskop mål efter reflektion på korta pass dikroisk spegel. - Samla fluorescens ljuset från provet genom att placera en hög numerisk apertur vattenmålet (60X, NA 1.2) i ljusgången. Välj en fluorescensfilter kub efter önskad emissionsvåglängder i antingen kanalkonfiguration en eller två. Anställ emissionsbandpassfilter för att ytterligare välja spektralområde av den emitterade fluorescensen.
- Placera provet på ett motoriserat steg och justera fin rörelse av mikroskopobjektivet med användning av en objektiv piezo-regulator.
- Rikta ljuset från filterkuben i fotomultiplikatorrör, där signalen diskriminerade och som skickas till en digital I / O-dataförvärvskort.
OBS: Datorgenererat vågformer är den analoga utgången på I / O-kort och är provided till skannrar styr elektroniken. Den fotonräknande input från fotomultiplikatorerna och utsignalen till skannrar mäts och styrs via I / O-kortet från laboratoriet för Fluorescence Dynamics SimFCS programvara.
3 Imaging
- Placera cellerna på scenen och fokus genomfallande ljus belysning.
- Växla till rasteravsökningsavbildning för att identifiera de celler som har inkorporerat färgämnet och att visualisera de underliggande mikrotubuli. Identifiera den ursprungliga område där vesikler rörelse är närvarande.
- När en isolerad vesikel identifieras, ange följande parametrar för orbital tracking:
- Välj radien för den omloppsbana för att definiera storleken på den cirkulära scan i enlighet med storleken av partikeln som spåras. För en punkt emitter, ställa in radien på omloppsbanan lika med midjan på punktspridningsfunktion (PSF) av exciteringsstråle för att maximera känsligheten och respons.
- Ställ den axiellaavstånd för att definiera avståndet mellan de två banor som utförs för att lokalisera den partikel position utmed den axiella riktningen. Ställ in axiella avståndet till 1,5-3 gånger PSF midjan.
- Definiera uppehållstiden i enlighet med ljusstyrkan på partikeln för att ställa in tid på varje punkt i omloppsbana, som också kommer att bestämma foto blekning takt. Använd en uppehållstid mellan 10-100 ps.
- Ställ in antal poäng i varje bana till 64 eller 128 för att ge omloppsbana perioder i storleksordningen 4-32 ms och ge en hög tidsupplösning för att bestämma partikelpositionen.
- Ändra DC offset signal till speglarna för att centrera strålen på partikeln genom det grafiska användargränssnittet via en markör i den raster-scannade bilden.
- Börja spåra genom att växla mikroskopläge från raster-avbildning till orbital scanning.
- Aktivera feedback och datainsamling.
4. Trajectory Analys
- Använda programvaran för att visa fluorescens samlas vid varje punkt längs banan och vid varje tidpunkt i form av en "intensitets mattan". Intensiteten samlats längs mattan ger information om interaktionen mellan partikeln med andra ljusa föremål. Använda programvaran för att visa både banan information (dvs. DC förskjutning över tiden för x, y skannrar och z -piezo) samt fluorescensintensiteten som samlats in från fotomultiplikatorröret över tid i form av tidsserier.
- Använd tidsserierepresentation och "intensitets mattan" information för att välja endast ett område av intresse i banan.
- Använd mjukvara för att visa en 2D-projektion av det valda partiet av partikelbanan. Välj lämpliga kontroller för att färgkoda banan enligt partikelfluorescensintensiteten.
- Markera alternativet för att visa pArtikeln bana i 3D, och färg-kod den enligt fluorescensintensiteten. Vrid bana i 3D med hjälp av reglagen för att visualisera funktionerna i lysosomen rörelse längs mikrotubuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt detta protokoll kan utföras snabb 3D singel spårning partikel inuti levande celler med hjälp av en modifierad två-photon mikroskop för att spåra förskjutning av fluorescerande lysosomer. Experimentet utförs består i att spåra en isolerad lysosom rör sig inne i cellen efter endosomen mognadsprocessen 9. De lysosomer färgades med hjälp av en fluorescerande grönt färgämne och exciteras vid 930 nm som utnyttjar 2-foton-excitation. Våra data visar att det är möjligt att erhålla x, y, z förskjutningsbanor med en temporal upplösning på 32 ms (Figur 1A). Mattan Analysen visar intensiteten registreras längs varje bana med tiden (Figur 1b). Under spårning kan registreras den integrerade intensiteten av den emitterade fluorescensen (Figur 2a). Den rekonstruerade 3D bana visar en riktad rörelse, som kan förväntas av en vesikel rör sig på mikrotubuli nätet. Ettdditionally är det möjligt att korrelera 3D bana till en rasteravsökningsbild av den omgivande regionen (figur 2b). Detta bekräftar den rörelse av partikeln längs riktningen för en mikrotubuli knippet.
Cellerna dessutom färgade med en röd markör för mitokondrier att registrera eventuell interaktion mellan vesikeln med dessa organeller under en transport. Det är möjligt att korrelera 3D partikelns bana inuti cellen (figur 3a) till intensiteten mattan registrerades från MitoTracker fluorescensemission (figur 3b). Detta tillåter oss att spela in närhets interaktion mellan vesikler med mitokondrie nätet som en funktion av deras position i cellen. Den emissionstopp registreras i "mitokondrier kanal" inte ger funktionell information om hur de organeller samverkar. Det kan ge bara information om tidpunkten för deras interaktionoch den relativa rumsliga positionen för det fluorescerande objektet med avseende på det partikel som spåras. Denna relativa positionen extraheras från den vinkel inom omloppsbana där toppemission registreras. En schematisk representation av det mikroskop som vi använde för att utföra detta experiment kan observeras i figur 4.
Figur 1 Förskjutning vs tidsbanor och intensitet mattan. a) x, y och z lysosom förskjutning mot tidsspår. b) Intensiteten bana (dvs intensiteten samlats längs varje cirkulär bana vertikala axeln är tid) ger information om fluorescens omgivningar partikeln. Ljusa fläckar utanför den inramade motsvarar interaktioner av partikeln med andra ljusa föremål och som är förknippade med hopp i banan som th e banor åter centers på den ljusfluorescenskällan. Den inramade regionen motsvarar den del av banan mellan två hopp.
Figur 2 Efter 3D-banan för en lysosom. a) 3D-rekonstruktion av en del av banan för en lysosom in med hjälp av spårning partikel. Banan är färgkodade för fluorescensintensiteten in från partikeln (röd, hög, blå, låga foton räknas). Yxor skalor är i nm. Notera att x, y, z-axlarna har olika intervall. B) 2D-projektion av 3D-bana, som visar en överlagring av banan ovanpå den mikrotubuli avbildas i ett raster skanna omedelbart efter den bana uppsamlades. C) Mitokondrier färgade med MitoTracker .
re 3 "src =" / filer / ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg "/>
Figur 3 Utvidgning av omlopps spårning till mer än en kanal (excitation vid 930 nm). a) 3D bana en lysosom i cellen. b) Intensitet mattan i den gröna kanalen (fluorescens samlas i denna kanal används för spårning). c) Intensitet mattan i den röda kanalen, där mitokondrier färgades med en röd fluorescerande matris riktade färgämne. De regioner där banan kommer i kontakt med de mitokondrier (pilhuvuden) visas som intensitets gupp i mattan, eftersom strålen som kretsar runt lysosomen korsar in i mitokondriematrisen.
Figur 4 Schema för experimentuppställning: modifierad två-photon mikroskop. Schematisk bild av laser set-up: en 2-Photon Ti: Sa laser med en rad 690-1,040 nm var ossed, en polarisator och en halv retardationsskiva används för att styra exciteringskraft. Alla andra objekt visas i figuren med hjälp av de angivna förkortningarna. Vi använde en 60X objektiv med en NA på 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots de enorma framsteg i fluorescensmikroskopiska tekniker och instrumentationer under de senaste åren, som uppnådde banor av fluorescerande partiklar i tre dimensioner med hög tidsupplösning har varit en utmaning på området. Om hög tidsupplösning har uppnåtts spårnings partiklar i två dimensioner, förlängning till den axiella riktningen ger typiskt en drastisk minskning av frekvenssvaret för systemet 10.
I denna video-protokoll fokuserade vi på demonstra tillämpning av spåra en enskild partikel i tre dimensioner i en levande cell med en hög tidsupplösning (32 ms i detta experiment) med en två-photon mikroskop. Installations krävs för att utföra ett sådant experiment är typiskt tillgänglig för laboratorier som utför laserskanning mikroskopi. Båda instrument tillägg för 3D orbital spårning samt styrprogram finns tillgängliga på marknaden, för Commercial laser scanning mikroskop såsom de som tillverkas av Olympus. Användningen av en pulsad hög effekt infraröd laserkälla, där en sådan finns, är fördelaktigt i konstruktionen av den experimentella uppställningen eftersom det inte kräver de-scanning av den emitterade fluorescensen. Det var dessutom visats i det förflutna som infraröd strålning är mer godartad mot cellen, på särskilda villkor 11, med tanke på att minska ur fokus fluorescens och foto-blekning.
Även kan utföras snabbt spårning av en fluorescerande partikel i två dimensioner med hjälp av en känslig kamera, kan avsaknad av tredimensionella informationen vara ofta begränsande att tolka biofysiska börden av banan informationen. Till exempel, vesiklar som rör sig längs mikrotubuli kör ofta upp mot mikrotubuli korsningsområden 8,12. I denna situation är användningen av ett 3D-tracking teknik övervinner gränsen för användning av 2D-projektioner av en 3D-struktur.
På grund av svarstiden för vårt mål nanopositioner piezo-enhet, är den period av rörelsen i z-axeln begränsad till cirka 30 msek, medan i x, y-riktningarna kan det gå ner till några få millisekunder. Lokaliseringen metodens precision skalor som signal-brusförhållandet 4,5. Den enda uppenbara begränsning av metoden, det vill säga förlusten av en global syn på miljön av partikeln, kompenseras av möjligheten att rekonstruera ett tidsintensitets matta 13, spåra historien om samspelet mellan den fluorescerande partikeln med angränsande fluorescerande källor, visas antingen samma eller en annan spektral emission.
Vi visar att rörelse lysosomer, blåsor som genomgår riktade rörelse längs mikrotubuli, som drivs av antingen kinesiner eller dyneins, kan följas i en levande cell efter färgning med hjälp av en kommersiellt tillgänglig färgämne. Nyligen 2D spårning av lysosomer var corrupprymd till super-upplösning avbildning av mikrotubuli nätet, i ansträngningarna att upptäcka de linjer som de blåsor tar på mikrotubuli-mikrotubuli korsningar 8. 3D-banor lysosomema visar ett mer komplext beteende än enkelriktad rörelse. Även ett genomsnitt riktad rörelse kan observeras, böjning, vridning och möjliga rotationer längs kanalerna kan observeras från dessa banor.
Vi har identifierat två viktiga steg i att utföra dessa experiment: första, är det nödvändigt att uppnå en märkning densitet lysosomema som är samtidigt tillräckligt hög för att få ljust färgade partiklar, och att på samma gång ger en densitet av partiklar med låg tillräckligt för att möjliggöra spårning av individuella partiklar. I fallet med två korsande partiklar, kan mikroskopet växla från en partikel till en annan medan spåra. Den andra kritiska steget gäller valet av tids pixel uppehållstid, vilket gör att en rimlig balans varapolera högt signal-brusförhållande och spårningshastighet. Vi har observerat att spårningshastighet i storleksordningen 32 msek per spårning cykel är vanligtvis tillräckliga för att följa lysosomer som genomgår snabba riktad rörelse i hastigheter under 1 mm / sek.
Sammanfattningsvis orbital spårning gör det möjligt att mäta i tre dimensioner och med en tidsupplösning på <40 ms den intracellulära rörelse av fluorescerande vesiklar. 3D orbital tracking har potential att användas i framtiden för att studera olika mycket dynamiska cellulära processer sådana oss Studiet av kromatin dynamik realtid transkription och diffusion av plasmoniska nanopartiklar i den intracellulära mediet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A.
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
