Abstract
Målet med denne videoen protokollen er å diskutere hvordan vi skal utføre og analysere en tredimensjonal fluorescerende orbital partikkel sporing eksperiment ved hjelp av en modifisert to-foton mikroskop en. I motsetning til konvensjonelle tilnærminger (raster scan eller bred felt basert på en stabel med rammer), gjør at 3D-orbital sporing for å lokalisere og følge med en høy romlig (10 nm nøyaktighet) og tidsmessig oppløsning (50 Hz frekvensrespons) 3D-forskyvning av et bevegelig fluorescerende partikkel på lengde-skalaer av hundrevis av mikron to. Fremgangsmåten er basert på en algoritme for tilbakemelding som styrer maskinvaren i en to-foton laser scanning mikroskop for å utføre en sirkulær bane rundt objektet som skal spores: tilbakemeldingsmekanisme vil opprettholde den fluorescerende gjenstand i sentrum ved å styre forskyvningen av skannestrålen 3-5. For å demonstrere fordelene med denne teknikken, etterfulgt vi en rask bevegelse organelle, den lysosome, innen aliving celle 6,7. Celler ble platet i henhold til standard protokoller, og farget ved hjelp av et kommersielt lysosome fargestoff. Vi diskuterer kort på maskinvarekonfigurasjon og mer detaljert styringsprogramvaren, til å utføre en 3D orbital sporing eksperiment i levende celler. Vi diskuterer i detalj de parametere som er nødvendige for å få tak i skanningen mikroskop og muliggjøre bevegelse av strålen i en lukket bane rundt partikkelen. Vi konkluderer ved å demonstrere hvordan denne metoden kan være effektivt brukes til å spore raske bevegelser av en merket lysosome langs mikrotubuli i 3D i en levende celle. Lysosomer kan bevege seg med hastigheter i området fra 0,4 til 0,5 um / sek, typisk viser en rettet bevegelse langs mikrotubuli-nettverket 8..
Introduction
Et stort antall metoder er blitt utviklet til dags dato for å spore fluorescerende partikler i tre dimensjoner ved hjelp av et mikroskop. De fleste metodene er avhengige av bruken av raske kameraer, ideelt egnet for å spore i to dimensjoner, vanligvis kombinert med tilpassede modifikasjoner av strålingsoptikk av mikroskopet for å oppnå relativ i aksial retning. Laser scanning mikroskop (enten konfokale eller to fotoner) som konvensjonelt kan spore en fluoriserende partikkel ved å utføre en tidssekvens av z-stablene, selv om denne prosessen er vanligvis tidskrevende og gir rimelig tid-oppløsning (10 Hz) bare hvis partikkelen er sporet ligger holdt i sentrum av en liten rasterbildedannelse-region av en aktiv tilbakekoblingsmekanisme 2.
Ideen om å låse inn til partikkelen er i bunnen av orbital sporingsmetode. I stedet for et raster skanne en sirkulær bane er utført rundt den fluorescerende partikler. Intensiteten av fluorescensen langsbane nøyaktig lokaliserer partikkel posisjon 4.
Den lokaliserte plasseringen av partikkel kan deretter brukes til å aktivere mikroskop skannere og re-senter bane på partikkel stilling. Galvanometeret skannere av mikroskopet er drevet av en analog spenning. AC-komponenten av denne spenningen gjør det mulig å utføre en bane med en fokusert laserstråle, dvs. en sinus og cosinus bølge påføres på X og Y-avsøkningsspeilene vil tillate å utføre en sirkulær bane. Den DC-forskyvning av signalet muliggjør endring av stillingen av banen senteret. Så snart en bane er bestemt for, og bølgeformen for vekselstrømsignalet er konfigurert, må feedback system for å oppdatere bare DC-komponenten av signalet.
En programvare i stand til å lese det fluorescerende signalet hentet fra detektorene er nødvendig for å kontrollere skannere og detektorene, for å beregne posisjonen til partikkel og oppdatere DC offsatt. For en vellykket tilbake avbildning av et forsiktig valg av baneparametere (størrelse og timing) er påkrevd, og disse parametere må bli justert basert på egenskapene til de fluoriserende partikler som det er nødvendig å spore.
De fysiske og matematiske grunnlaget for teknikken ble beskrevet i det siste 4,5 for både 2D-og 3D-programmer. I denne protokollen beskriver vi kort hovedmaskinvarekomponentene i oppsettet, og i mer detalj på valget av parametrene og prøvepreparering som kreves for et typisk forsøk tillater oss å følge forskyvningen av en lysosome ved en høy tidsmessig oppløsning i en levende celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvepreparering
- Oppretthold CHOK1 celler i vevskultur-kolber ved bruk av DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum og 100 IE / ml penicillin 50 ug / ml streptomycin. Inkuber cellene i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° C.
- Harvest og deretter plate CHOK1 celler på en 14 mm diameter mikro-brønn med en overflatetykkelse på 0,16 mm. Seed celler for optimal tetthet for bildebehandling, rundt 60-70% konfluens.
- Inkuber cellene over natten ved 37 ° C, 5% CO 2. Vask cellene tre ganger i HBSS (Hanks bufret saltvannsløsning), og inkuberes cellene i en oppløsning inneholdende 50 nM av Lysotracker DND26 grønn og 150 nM av tubulin tracker grønt. Inkuber cellene i 1 time ved 37 ° C. Valgfritt trinn: før inkubering, utfører en ytterligere flekken med en mitokondrielle matriks farging fargestoff (25 nM).
- Vask cellene tre ganger i HBSS for å fjerne eventuelt ubundet fargestoff. Legg frisk DMEM dyrkningsmedium før imaging cellene.
2. mikroskop konfigurasjoner
Mikroskopet for partikkel sporing beskrevet i video-protokollen er montert på rammen av et kommersielt tilgjengelig invertert mikroskop (figur 4). Men kommersielle moduler for 3D orbital partikkel tracking er nå tilgjengelig.
- Bruk en Coherent Chameleon-Ultra II Ti: Sa femtosecond laser eksitasjon lyskilde, med en fleksibel produksjon bølgelengdeområdet mellom 690 nm-1040 nm.
- Sørg for at laserstrålen er på linje i den bakre porten på mikroskopet ved hjelp av IR-belagt speil. Laserstrålen blir dempet ved hjelp av en roterende halvbølgeplate, etterfulgt av en kalsitt lineær polarisator. Svekke strålen slik at den gjennomsnittlige effekt på prøven er mellom 0,5 og 2 mW.
MERK: laserstrålen er reflektert av et par av galvanometer-motoriske aktuerte speil som tillater kontroll av posisjon og banen til den fokuserte strålen i prøveplanet. I entypisk konfigurasjon av kollimert laserstråle som kommer ut av de galvanospeil ekspanderes (10X) som passerer gjennom en stråle ekspander, før de går inn på baksiden av mikroskopobjektiv etter refleksjon på kort-pass dikroisk speil. - Samle fluorescens lys fra prøven ved å plassere en høy numerisk apertur vann objektiv (60X, NA 1,2) inn i lysbanen. Velg et fluorescens filter kube i henhold til de ønskede emisjonsbølgelengder i enten én eller to kanal-konfigurasjon. Anvende utslippsbåndpassfiltre for å velge det spektralområdet for den emitterte fluorescens ytterligere.
- Plasser prøven på en motorisert stadium, og justere den fine bevegelse av mikroskopobjektiv ved hjelp av en objektiv piezo-regulator.
- Rette lyset fra filter kuben inn fotomultiplikatorrør hvor signalet blir diskriminert og sendt til en digital I / O innsamling kort.
MERK: Datagenererte bølgeformer er den analoge utgangen av I / O-kort og er innsamlingsløsed til skannerne kontrollere elektronikk. Fotonet telling innspill fra photomultipliers og utgangssignalet til skannerne måles og styres via I / O-kort ved Laboratorium for Fluorescens Dynamics SimFCS programvare.
3. Imaging
- Plasser cellene på scenen og fokusere med overført lys belysning.
- Bytt til raster scan bildebehandling å identifisere de cellene som har innarbeidet fargestoff og å visualisere de underliggende mikrotubuli. Identifiser første område hvor vesikkel bevegelse er tilstede.
- Når en isolert vesikkel er identifisert, angi følgende parametere for orbital sporing:
- Velg radien for banen for å bestemme størrelsen av den sirkulære skanne i henhold til størrelsen av partikkelen som spores. For et punkt emitter, angir radien for banen lik midje av Point Spread Function (PSF) av eksitasjon strålen for å maksimere følsomheten og respons.
- Sett aksialavstand for å definere avstanden mellom de to banene som er utført for å lokalisere partikkel posisjon langs den aksiale retning. Sett aksiale avstanden til 1,5-3 ganger PSF midjen.
- Definer holdetid i henhold til lysstyrken til partikkelen til å sette tid brukt på hvert punkt på bane, som også vil bestemme foto-bleking rate. Bruk en holdetid mellom 10-100 usekunder.
- Angi antall poeng i hver bane til 64 eller 128 for å gi bane perioder i størrelsesorden 4-32 msek og gir en høy tidsoppløsning for å bestemme partikkel posisjon.
- Endre DC offset signal sendes til speilene for å sentrere strålen på partikkel gjennom det grafiske brukergrensesnittet via en markørvalg i raster-skannede bildet.
- Begynne å spore ved å bytte mikroskopet modus fra raster-imaging til orbital skanning.
- Aktiver tilbakemeldinger og datainnsamling.
4. Trajectory Analyse
- Bruk programvare for å vise fluorescens oppsamlet ved hvert punkt langs banen og på hvert tidspunkt i form av en 'intensitet teppe ". Intensiteten samlet sammen teppet gir informasjon om samspillet til partikkelen med andre lyse objekter. Bruk programvare for å vise både banen informasjon (dvs. DC-forskyvning over tid av x, y og skannere av z -piezo) samt fluorescensintensiteten oppsamlet fra fotomultiplikatorrøret over tid i form av tidsserier.
- Bruk tidsserien representasjon og "intensitet teppet" informasjon for å velge bare en region av interesse i banen.
- Bruk programvare for å vise en 2D-projeksjon av det valgte parti av partikkel bane. Velg de hensiktsmessige kontroller for å fargekode banen i henhold til partikkel-fluorescensintensitet.
- Velg alternativet for å vise partikkelbanen i 3D, og farge-kode i henhold til det fluorescensintensiteten. Rotere banen i 3D ved hjelp av kontrollene til å visualisere funksjonene i lysosome bevegelse langs mikrotubuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I henhold til denne protokollen fort 3D enkelt partikkel sporing kan utføres inne i levende celler ved hjelp av en modifisert to-foton mikroskop for å spore forskyvningen av fluorescensmerkede lysosomer. Eksperimentet utføres består av sporing en isolert lysosome beveget seg inne i cellen etter endosome modningsprosess ni. Lysosomene ble farget med et fluorescerende grønt fargestoff og spent på 930 nm utnytter to-foton eksitasjon. Våre data viser at det er mulig å oppnå x, y, z fortrengningsforløp med en tidsmessig oppløsning på 32 msek (Figur 1a). Teppet analyse viser intensiteten registrert langs hver bane over tid (Figur 1b). Under den sporing av den integrerte intensitet av utsendt fluorescens kan bli registrert (Figur 2a). Den rekonstruerte 3D banen viser en rettet bevegelse, som kan forventes fra en vesikkel flytte på microtubuli nettverk. Additionally, er det mulig å korrelere 3D-bane til et rasterscan bilde av den omliggende regionen (figur 2b). Dette bekrefter bevegelse av partikkel langs retningen av et mikrotubuli bunt.
Cellene ble i tillegg farget med en rød markør for mitokondriene å registrere eventuell interaksjon av vesikkel med disse organeller i løpet av deres bevegelse. Det er mulig å korrelere 3D-banen til partikkel inne i cellen (figur 3a) til intensiteten teppet tatt opp fra mitotracker fluorescensemisjonen (figur 3b). Dette tillater oss å ta opp de nærhets interaksjoner av vesikkel med den mitokondrielle nettverket som en funksjon av deres posisjon i cellen. Utslippstoppnivået i "mitokondriene kanal" ikke gir funksjonell informasjon om hvordan organ samhandle. Det kan bare gi informasjon om tidspunktet for deres interaksjonog den relative romlige posisjonen til fluorescerende gjenstand med hensyn til partikkel som spores. Denne relative posisjon er trukket ut fra vinkelen i den bane der emisjonstopp er registrert. En skjematisk representasjon av mikroskopet vi brukt til å utføre dette forsøket kan observeres i figur 4.
Figur 1. Displacement vs tids baner og intensitet teppe. a) x, y og z lysosome forskyvning mot tid spor. b) Intensiteten bane (dvs. intensiteten samles langs hver sirkulær bane vertikale aksen er tid) gir informasjon om fluorescens omgivelsene av partikkel. Lyspunkter utenfor eske tilsvarer interaksjoner av partikkel med andre lyse objekter, og er forbundet til hopp i banen som th e baner re-sentre på den lyseste fluorescens kilde. Den eske region tilsvarer det parti av banen mellom to hopp.
Figur 2. Etter 3D banen til et lysosome. a) 3D rekonstruksjon av en del av banen til en lysosome oppsamlet ved hjelp av partikkel-sporing. Banen er fargekodet for fluorescens intensitet samlet inn fra partikkelen (rød, høy, blå, lave foton teller). Axes skalaer er i nm. Legg merke til at x, y, z-aksene har forskjellige serier. B) 2D-projeksjon av 3D-bane, som viser en overlapping av banen på toppen av mikrotubuli avbildes i et rasterscan umiddelbart etter at banen ble oppsamlet. C) Mitokondrier farget med mitotracker .
re 3 "src =" / filer / Ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Forlenge orbital relativ til mer enn en kanal (eksitasjon ved 930 nm). a) 3D banen til et lysosome i cellen. b) Intensitet teppe i den grønne kanalen (fluorescens oppsamlet i denne kanal benyttes for sporing). c) Intensitet teppe i den røde kanal, hvor mitokondrier ble farget med et rødt fluorescerende matrise målrettet fargestoff. De områder hvor banen kommer i kontakt med mitokondrier (pilhoder) vises som intensitets støt i teppet, da strålen går i bane rundt lysosome passet inn i den mitokondrielle matriks.
Figur 4. Skjematisk av det eksperimentelle oppsettet: modifisert to-foton mikroskop. Skjematisk fremstilling av laser set-up: en 2-Photon Ti: Sa laser med en rekke 690-1,040 nm var ossed, en polarisator og en halv waveplate blir brukt til å styre den magnetiseringseffekt. Alle de andre elementene er oppført i figuren ved hjelp av de angitte forkortelser. Vi brukte en 60X objektiv med en NA på 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for de enorme utvikler av fluorescens mikroskopi teknikker og besetninger i løpet av de siste årene, oppnå baner av fluorescerende partikler i tre dimensjoner med høy tidsoppløsning har vært en utfordring i feltet. Hvis høy tidsmessig oppløsning er oppnådd sporings partikler i to dimensjoner, forlengelse til den aksiale retning bringer typisk en drastisk reduksjon i frekvensreaksjonen til systemet 10..
I denne video-protokollen fokuserte vi på den demonstrer anvendelse av sporer en individuell partikkel i tre dimensjoner innenfor et levende celle med en høy tidsoppløsning (32 msek i dette forsøk) ved hjelp av en to-foton mikroskop. Oppsettet som kreves for å utføre et slikt eksperiment er vanligvis tilgjengelig for laboratorier som utfører laser scanning mikroskop. Begge instrument add-ons for 3D-orbital sporing samt kontroll programvare er tilgjengelig på markedet, for commercial laser scanning mikroskop slik som de produsert av Olympus. Bruken av en pulset høyeffekts infrarød laserkilde, hvor tilgjengelig, er fordelaktig ved utformingen av det eksperimentelle oppsettet, siden det ikke krever de-skanning av den emitterte fluorescens. Videre ble det vist i det siste at infrarød bestråling er mer godartet mot cellen, som under visse betingelser 11, gitt reduksjon av ufokusert fluorescens og foto-bleking.
Selv om hurtig sporing av en fluorescerende partikkel i to dimensjoner kan utføres ved hjelp av en følsom kamera, kan fravær av en hvilken som helst tredimensjonal informasjon ofte være begrensende i tolke biofysisk betydningen av banen informasjon. For eksempel, vesikler som beveger seg langs mikrotubuli ofte kjører opp mot mikrotubuli skjærings regioner 8,12. I denne situasjon overvinner bruk av et 3D-sporingsteknikk grensen for ved hjelp av 2D-projeksjoner av en 3D-struktur.
Med hensyn til tidsresponsen for vårt mål nanopositioner piezo-enheten, er perioden av bevegelse i Z-aksen er begrenset til omtrent 30 msek, mens i den x, y-retningene det kan gå ned til noen få millisekunder. Lokaliseringen presisjon av metoden skalaer som signal til støy-forholdet 4,5. Den eneste åpenbare begrensning av metoden, dvs. tap av en global oversikt over miljøet til partikkelen, er kompensert av muligheten for å rekonstruere en tidsmessig intensitet teppe 13, sporing historien interaksjoner av fluorescerende partikkel med nabo fluorescerende kilder, viser enten den samme eller en forskjellig spektral emisjon.
Vi viser at bevegelsen til lysosomer, vesikler som gjennomgår rettet bevegelse langs mikrotubuli, drevet av enten kinesins eller dyneins, kan følges i en levende celle etter farging med en kommersielt tilgjengelig fargestoff. Nylig, 2D sporing av lysosomer var korropprømt til superoppløsning den av microtubuli nettverk, i arbeidet med å avdekke de rutene som vesiklene tar på mikrotubulus-mikrotubulus kryss åtte. 3D-baner av lysosomene viser en mer kompleks oppførsel enn ensrettet bevegelse. Selv om en gjennomsnittlig rettet bevegelse kan observeres, bøying, vridning og mulige rotasjoner langs tubuli kan observeres fra disse baner.
Vi har identifisert to kritiske trinn med å utføre disse eksperimentene: for det første er det nødvendig å oppnå en merking tetthet på lysosomene som er samtidig er høy nok til å oppnå lyst fargede partikler, og som på samme tid gir en tetthet på partikler, lave nok til å tillate sporing av individuelle partikler. I tilfelle av to kryssende partikler, kan mikroskopet skifte fra en partikkel til en annen under sporing. Den andre kritiske trinn gjelder valget av pikselen holdetid, slik at en rimelig balanse blilom høy signal til støyforhold og sporing hastighet. Vi har observert at relativ hastighet i størrelsesorden 32 millisekunder pr sporing syklus er typisk tilstrekkelig for å følge lysosomer som gjennomgår rask rettet bevegelse ved hastigheter under omkring 1 pm / sek.
I sammendrag, tillater orbital sporing for å måle i tre dimensjoner, og med en tidsmessig oppløsning på <40 msek den intracellulære bevegelser av fluorescensmerkede vesikler. 3D-orbital sporing har potensial til å være ansatt i fremtiden for studiet av ulike høydynamiske cellulære prosesser slik oss Studiet av kromatin dynamikk sanntid transkripsjon og diffusjon av Plasmonic nanopartikler i den intracellulære medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A.
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
