Abstract
Цель данного видео протокола является обсуждение как выполнить и проанализировать трехмерную флуоресцентный орбитальный эксперимент отслеживания частиц с использованием модифицированного двухфотонного микроскопа 1. В отличие от традиционных подходов (растр сканирования или широкое поле на основе стека кадров), орбитальный слежения 3D позволяет локализовать и следовать с высоким пространственным (точность 10 нм) и временным разрешением (50 Гц АЧХ) 3D смещение перемещения люминесцентные частицы на длине масштабах от сотен микрон 2. Метод основан на алгоритме обратной связи, которая управляет аппаратными средствами двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа, чтобы выполнить круговую орбиту вокруг объекта, которые необходимо отслеживать: механизм обратной связи будет поддерживать флуоресцентный объекта в центре, контролируя смещение сканирующий луч 3-5. Чтобы продемонстрировать преимущества этой техники, мы следовали быстро движущихся органеллы, лизосому, в рамках альiving клеток 6,7. Клетки высевали в соответствии со стандартными протоколами, и окрашивали с использованием коммерчески лизосом краситель. Мы обсудим кратко аппаратную конфигурацию и более подробно программного управления, чтобы выполнить 3D орбитальный эксперимент отслеживания внутри живых клеток. Мы подробно обсудим параметры, необходимые для того, чтобы контролировать сканирующего микроскопа и позволить движение луча по замкнутой орбите вокруг частицы. Мы пришли к выводу, демонстрируя, как этот метод может быть эффективно использован для отслеживания быстрое движение меченой лизосом вдоль микротрубочек в 3D в живой клетке. Лизосомы может перемещаться со скоростью в диапазоне 0,4-0,5 мкм / сек, как правило, отображение, направленное движение по сети микротрубочек 8.
Introduction
Большое количество подходов были разработаны до настоящего времени отслеживать флуоресцентные частицы в трех измерениях с помощью микроскопа. Большинство подходов основаны на использовании быстрых камер, идеально подходит для отслеживания в двух измерениях, как правило, в сочетании с индивидуальными модификаций выбросов оптики микроскопа, чтобы достичь отслеживания в осевом направлении. Лазерная сканирующих микроскопов (либо конфокальные или двух фотонов) условно можно отслеживать флуоресцентный частицу, выполняя временную последовательность Z-стеки, хотя этот процесс, как правило, отнимает много времени, и дает разумное разрешение по времени (10 Гц), если только частица отслеживается является хранится в центре небольшого региона растровых изображений активным механизмом обратной связи 2.
Идея блокировки в частице является основой метода орбитальной отслеживания. Вместо растра сканирования выполняется круговая орбита вокруг флуоресцентного частицы. Интенсивность флуоресценции вместеорбита точно локализует положение частиц 4.
Локализованный положение частицы затем можно использовать для приведения в действие микроскопом сканеры и повторного центр орбиты от положения частиц. Гальванометра сканеры микроскопом движет аналоговое напряжение. Компонент AC этого напряжения позволяет осуществлять орбиту с сфокусированным лазерным лучом, т.е. синус и косинус волны, приложенного к X и Y сканирующие зеркала позволит выполнять круговую орбиту. DC смещение сигнала облегчает изменения положения центра орбиты. После того, как период орбиты определяется и форма сигнала для сигнала переменного тока настроен, система обратной связи необходимо обновить только постоянную составляющую сигнала.
Программное обеспечение в состоянии прочитать флуоресцентный сигнал, собранную с детекторов требуется контролировать сканеры и детекторы, чтобы вычислить положение частицы и обновить DC отустановить. Для успешного обратной томография тщательного выбора параметров орбиты (объемы и сроки) не требуется, и эти параметры должны быть скорректированы на основе характеристик люминесцентных частиц, что необходимо отслеживать.
Физические и математические основы техники были описаны в прошлом 4,5 для обоих 2D и 3D приложений. В этом протоколе мы кратко опишем основные аппаратные компоненты установки, и более подробно выбор параметров и подготовка образца, необходимый для типичного эксперимента, позволяющего нам после смещения лизосом в высоким временным разрешением в живой клетке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Подготовка образцов
- Поддержание CHOK1 клетки в тканевых культуральных колбах с использованием DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 МЕ / мл пенициллина 50 мкг / мл стрептомицина. Инкубируйте клетки в 5% CO 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
- Урожай а затем пластины CHOK1 клеток на 14 мм диаметром микро-скважины с толщиной поверхности 0,16 мм. Семенной клетки для оптимальной плотности для работы с изображениями, 60-70% слияния.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С, 5% СО 2. Промыть клетки три раза в HBSS (Hank буферный солевой раствор), и инкубируют клетки в раствор, содержащий 50 нМ Lysotracker DND26 зеленого и 150 нм тубулина следящей зеленый. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при 37 ° С. Необязательный шаг: До инкубации, выполнить дополнительное пятно с митохондриальной окрашивания матрица красителя (25 нМ).
- Промыть клетки три раза в HBSS, чтобы удалить любой несвязанный краситель. Добавить свежую среду роста DMEM до ИМАГчисле клетки.
2. Микроскоп Конфигурации
Микроскоп для отслеживания частиц описанного в протоколе видео собран на раме коммерчески доступного инвертированного микроскопа (Рисунок 4). Однако коммерческие модули для 3D слежения орбитальная частиц теперь доступны.
- Используйте когерентного Chameleon-Ultra II Ti: Sa фемтосекундного лазерного возбуждения источника света, с перестраиваемой диапазоне выходных длин волн от 690 нм-1040 нм.
- Убедитесь, что лазерный луч выравнивается в задней порту микроскопом с помощью ИК-покрытием зеркала. Лазерный луч ослабляется с помощью вращающегося полуволновой пластинки с последующим кальцит линейного поляризатора. Ослабление пучка таким образом, чтобы средняя мощность на образце составляет от 0,5 до 2 мВт.
ПРИМЕЧАНИЕ: лазерный луч отражается парой гальванометра моторных приводных зеркал, которые позволяют контролировать положение и траекторию сфокусированного пучка в плоскости образца. ВТипичная конфигурация коллимированное лазерный луч, выходящий из гальванометрических зеркал расширяется (10X), проходящий через расширитель пучка, перед входом в задней части объектива микроскопа после отражения на короткий проход зеркальные. - Собирают света флуоресценции от образца, помещая высокой числовой апертурой воды цели (60X, NA 1.2) на пути прохождения света. Выберите куб флуоресценции фильтра в соответствии с требуемыми длинами волн излучения в любой конфигурации канала один или два. Применять полосовых выбросов фильтры для дальнейшего выбора спектрального диапазона излучаемого флуоресценции.
- Поместите образец на моторизованной этапе, и выполнить точную движение объектива микроскопа, используя объективную пьезо-контроллер.
- Направьте свет от куба фильтра в фотоумножителями где сигнал предвзято и отправленных в цифровой I / O сбора данных карты.
ПРИМЕЧАНИЕ: компьютерная графика волны являются аналоговый выход платы ввода-вывода / и Providред к сканеров управлять электроникой. Входной счета фотонов от ФЭУ и выходного сигнала к сканеров измеряются и контролируются через карты ввода / вывода в лаборатории для флуоресценции Динамика SimFCS программного обеспечения.
3 изображений
- Расположите клеток на сцене и сфокусироваться с помощью проходящего света освещение.
- Переключение в режим визуализации растрового сканирования, чтобы определить клетки, которые включены краску и визуализировать основные микротрубочки. Определить начальную область, где движение пузырьков присутствует.
- После того, как изолированные везикулы идентифицируется, установите следующие параметры для орбитальной слежения:
- Выберите радиус орбиты, чтобы определить размер круговой сканирования в соответствии с размером частицы отслеживается. Для точки излучателя, установите радиус орбиты, равной талии Функция рассеяния точки (PSF) пучка возбуждения максимизации чувствительности и реакции.
- Установите осевуюрасстояние, чтобы определить расстояние между двумя орбитах, которые выполняются, чтобы локализовать положение частицы вдоль осевого направления. Установите осевое расстояние к 1,5-3 раза ФСФ талии.
- Определить время задержки в зависимости от яркости частицы, чтобы установить время, затрачиваемое на каждой точке орбиты, которая также будет определять фото-отбеливания скорость. Используйте время пребывания между 10-100 мкс.
- Установите количество точек в каждой орбите до 64 или 128 с получением периоды орбиты в порядке 4-32 мс и обеспечивает высокое временное разрешение для определения положения частиц.
- Изменение смещения постоянного тока сигнал, посланный к зеркалам для центровки луча на частицы с помощью графического интерфейса пользователя через выбор курсора в растрового сканирования изображения.
- Начните отслеживание путем переключения режима микроскопа от растрового-визуализации для орбитальной сканирования.
- Активируйте обратной связи и сбора данных.
4 Trajectрии Анализ
- С помощью программного обеспечения для отображения флуоресценции собранных в каждой точке вдоль орбиты и в каждый момент времени в форме «интенсивности ковер". Интенсивность собраны по ковру обеспечивает информацию о взаимодействии частицы с другими ярких объектов. С помощью программного обеспечения для отображения как траекторию информацию (т.е. смещения постоянного тока в течение долгого времени в X, Y сканеры и из г -piezo), а также интенсивности флуоресценции, собранной из ФЭУ в течение долгого времени в виде временных рядов.
- Используйте представление временных рядов и 'интенсивность ковер' информацию, чтобы выбрать только интересующую область в траектории.
- С помощью программного обеспечения для отображения 2D проекцию выбранной части траектории частицы. Выберите соответствующие элементы управления для цветового кода траекторию в зависимости от интенсивности флуоресценции частиц.
- Выберите опцию для отображения рСтатья траектории в 3D, и цвет-код, что в зависимости от интенсивности флуоресценции. Поверните траектории в 3D с помощью органов управления для визуализации особенности движения лизосом вдоль микротрубочек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с этим протоколом быстрая 3D отслеживания одна частица может быть выполнена внутри живых клеток с использованием модифицированного двухфотонного микроскопа, чтобы отслеживать перемещение флуоресцентно меченных лизосом. Эксперимент выполняется заключается в отслеживании изолированную лизосому движется внутри клетки после процесса созревания эндосом 9. Лизосом окрашивали с помощью флуоресцентного зеленую краску и возбуждается на 930 нм эксплуататорских возбуждение 2-фотона. Наши данные показывают, что можно получить х, Y, Z траектории перемещения с временным разрешением 32 мс (Рисунок 1а). Анализ ковер отображает интенсивность записанный вместе каждой орбите в течение долгого времени (рисунок 1b). Во время отслеживания интегральная интенсивность излучаемого флуоресценции могут быть записаны (рис 2а). Восстановленный 3D траектория отображает направленное движение, как можно ожидать от пузырька, движущегося по сети микротрубочек.dditionally, можно соотнести 3D траекторию на образ растрового сканирования окружающего области (рис 2b). Это подтверждает движение частицы вдоль направления пучка микротрубочек.
Клетки дополнительно окрашивают красным маркером для митохондрий для записи возможного взаимодействия пузырька с этих органелл при их движении. Это можно соотнести 3D траекторию частицы внутри клетки (фиг.3а) к ковру интенсивности, записанной с флуоресцентной эмиссии Mitotracker (фиг.3В). Это позволяет записывать близости взаимодействия пузырька с митохондриальной сети в зависимости от их позиции в камере. Пик выбросов записано в "митохондрий канала" не дает функциональную информацию о том, как органеллы взаимодействовать. Это может обеспечить только информацию о времени их взаимодействияи относительное пространственное положение флуоресцентного объекта по отношению к частице отслеживается. Это относительное положение извлекается из угла в орбите, где записан пик излучения. Схематическое представление микроскопом мы использовали, чтобы выполнить этот эксперимент можно наблюдать на рисунке 4.
Рисунок 1. Водоизмещение против временных траекторий и интенсивности ковер. а) х, у и г лизосом смещение от времени следы. б) Траектория интенсивность (т.е. интенсивность собраны вдоль каждой вертикальной оси круговой орбиты время) предоставляет информацию о флуоресцентных окрестностях частицы. Яркие пятна вне коробку соответствуют взаимодействий частицы с другими ярких объектов, и связаны с прыжками в траектории, й е орбиты повторно центры по самым ярким источником флуоресценции. В штучной упаковке область соответствует части траектории между двумя скачками.
Рисунок 2 После 3D траектории лизосом. а) 3D реконструкция части траектории лизосом собраны с помощью отслеживания частиц. Траектория имеет цветовую маркировку для интенсивности флуоресценции, полученной от частицы (красный, высокий; синий, низкое количество фотонов). Топоры весы находятся в нм. Отметим, что X, Y, Z оси имеют различные диапазоны. Б) 2D проекцию траектории 3D, отображения наложение траектории сверху микротрубочки изображаемого в растр сканирования сразу после траектория была собрана. С) Митохондрии окрашивали Mitotracker .
Re 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51794 / 51794fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3 Продление орбитального слежения, чтобы более одного канала (возбуждение при 930 нм). а) 3D траектория лизосом в клетке. б) Интенсивность ковер в зеленом канале (флуоресценции собранных в этом канале используется для отслеживания). в) Интенсивность ковер в красном канале, где митохондрии окрашивали с красным флуоресцентным матрицы направлены краситель. Области, где траектория вступает в контакт с митохондрий (стрелки) отображаются в виде ударов интенсивности в ковер, так как пучок на орбите вокруг лизосом пересекает в митохондриях.
Рис.4 Схемы экспериментальной установки: изменение двухфотонного микроскопа. Схематическое изображение лазерного Настройка: Ti 2-Фотон: Сб лазер с диапазон 690-1,040 нм был с намиред, поляризатор и половина фазовые используются для управления мощностью возбуждения. Все остальные элементы перечислены на рисунке с использованием указанного сокращений. Мы использовали цели 60X с НС 1,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на огромные прогрессирует от флуоресцентных методов микроскопии и контрольно-измерительных приборов в течение последних лет, достижения траектории люминесцентных частиц в трех измерениях с высоким временным разрешением осталась с проблемой в области. Если высоким временным разрешением были достигнуты частицы отслеживания в двух измерениях, расширение в осевом направлении, как правило, приводит к резкому снижению частотной характеристики системы 10.
В этом видео-протокола мы сосредоточились на демонстративное применение отслеживания отдельную частицу в трех измерениях в живой клетке с высоким временным разрешением (32 мс в этом эксперименте) с использованием двухфотонного микроскопа. Установка требуется для проведения такого эксперимента, как правило, доступны для лабораторий, выполняющих лазерной сканирующей микроскопии. Оба прибора дополнения для 3D орбитальной слежения, а также программное обеспечение управления доступны на рынке, для лизинговоел лазерные сканирующие микроскопы, такие как те, которые производятся на Олимп. Использование импульсного высокого энергетического источника инфракрасного лазера, где это возможно, имеет преимущество в дизайне экспериментальной установки, так как он не требует исключении из сканирования излучаемого флуоресценции. Кроме того, было продемонстрировано в прошлом, что инфракрасное облучение является более мягкий по отношению к клетке, при определенных условиях 11, учитывая сокращение вне фокуса флуоресценции и фото-отбеливание.
Хотя быстро отслеживание флуоресцентной частицей в двух измерениях может быть выполнена с использованием чувствительной камеры, отсутствие любой трехмерной информации может быть часто ограничивает в интерпретации биофизической значение траектории информации. Например, пузырьки, движущиеся вдоль микротрубочек часто наталкиваются микротрубочки пересечения регионах 8,12. В этой ситуации, использование методики 3D отслеживания преодолевает ограничение использования 2D проекции конструкции 3D.
Благодаря времени отклика нашей объективной nanopositioner пьезо устройства, период движения в оси ограничивается примерно 30 мс, в то время как в X, Y направления он может снизиться до нескольких миллисекунд. Точность локализации методом весы как отношение сигнал-шум 4,5. Единственное очевидное ограничение метода, то есть потеря глобальной зрения окружающей среды частицы, компенсируется возможностью восстановления временной ковер интенсивности 13, прослеживая историю взаимодействий флуоресцентного частицы с соседними люминесцентных источников, отображения либо одинаковыми, либо в различных спектральных излучение.
Мы покажем, что движение лизосом, пузырьки, которые подвергаются направленные движение вдоль микротрубочек, оснащается либо кинезинов или динеинами, можно проследить в живой клетке после окрашивания с использованием коммерчески доступного красителя. Недавно, 2D отслеживания лизосом был коррприподнятое к супер-разрешением визуализации сети микротрубочек, в усилиях обнаружения маршруты, пузырьки взять на микротрубочки микротрубочек пересечений 8. 3D траектории лизосом отображать более сложное поведение, чем однонаправленное движение. Хотя в среднем направленное движение можно наблюдать, гибка, скручивание и возможные повороты вдоль канальцев может наблюдаться от этих траекторий.
Мы определили два важнейших этапа выполнения этих экспериментов: сначала надо добиться плотности маркировки лизосом, что является в то же время достаточно высокой, чтобы получить ярко окрашенные частицы, и что в то же время обеспечивает плотность частиц низких достаточно, чтобы позволить отслеживание отдельных частиц. В случае двух частиц пересечения, микроскоп может переключаться от одной частицы к другой, при движении. Второй важный шаг касается выбора времени пиксель задержки, позволяя разумный баланс бытьTween высокое отношение сигнал-шум и скорости слежения. Мы заметили, что скорость отслеживания в порядке 32 мс по ходу наблюдения цикла, как правило, достаточно следовать лизосом проходящих быстро направленное движение со скоростью ниже 1 мкм / сек.
Таким образом, орбитальная слежения позволяет измерять в трех измерениях и с временным разрешением <40 мс внутриклеточный движения флуоресцентно меченых пузырьков. Орбитальный слежения 3D имеет потенциал, чтобы быть использован в будущем для изучения различных высоко динамичных клеточных процессов таких нас изучение динамики хроматина в реальном времени транскрипции и диффузии из плазмонных наночастиц в среде клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A.
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
