Abstract
Das Ziel dieses Video-Protokoll ist zu diskutieren, wie mit einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop 1 durchzuführen und zu analysieren, eine dreidimensionale Fluoreszenzorbitalpartikelverfolgung Experiment. Wie zu herkömmlichen Ansätzen (Rasterabtastung oder Weitfeld basierend auf einem Stapel von Frames) gegenüberliegt, kann die 3D-Tracking-Orbital zu lokalisieren und zu verfolgen mit hoher räumlicher (10 nm Genauigkeit) und zeitliche Auflösung (50 Hz Frequenzgang) die 3D-Verschiebung ein bewegtes fluoreszierende Partikel auf Längenskalen von Hunderten von Mikrometern 2. Das Verfahren basiert auf einem Algorithmus, der die Rückkopplungs Hardware eines Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop, um eine Kreisbahn um das Objekt auszuführen steuert basierend verfolgt werden: Der Rückkopplungsmechanismus wird das fluoreszierende Objekt in der Mitte durch die Steuerung der Verschiebung zu halten der Abtaststrahl 3-5. Um die Vorteile dieser Technik zu demonstrieren, folgten wir einem sich schnell bewegenden Organelle, das Lysosom, in aliving Zelle 6,7. Zellen wurden nach Standardprotokollen überzogen, und unter Verwendung eines im Handel Lysosom Farbstoff. Wir besprechen kurz die Hardware-Konfiguration und im Detail die Steuer-Software, um eine 3D-Orbital Tracking-Experiment in lebenden Zellen durchzuführen. Diskutieren wir im Detail die um die Rastermikroskop zu steuern und zu ermöglichen, die Bewegung des Strahls in einer geschlossenen Bahn um die Teilchen erforderlichen Parameter. Wir schließen, durch den Nachweis, wie diese Methode effektiv verwendet, um die schnelle Bewegung eines markierten Lysosom an Mikrotubuli in 3D in einer lebenden Zelle zu verfolgen. Lysosomen mit Geschwindigkeiten im Bereich von 0,4-0,5 um / s bewegen, in der Regel Anzeige einer gerichteten Bewegung entlang der Mikrotubuli-Netzwerk 8.
Introduction
Zahlreiche Ansätze sind bisher entwickelt worden, um fluoreszierende Partikel in drei Dimensionen unter Verwendung eines Mikroskops zu verfolgen. Die meisten Ansätze beruhen auf der Verwendung von schnellen Kameras ideal geeignet, um in zwei Dimensionen, die typischerweise mit individuellen Änderungen der Emissionsoptik des Mikroskops kombiniert Verfolgung in axialer Richtung zu erreichen verfolgen. Laser-Scanning-Mikroskop (entweder konfokale oder zwei Photonen) üblicherweise eine Leuchtstoffpartikel durch Ausführen einer zeitlichen Abfolge von Z-Stapeln zu verfolgen, wobei dieses Verfahren typischerweise zeitaufwendig und liefert angemessene zeitliche Auflösung (10 Hz), wenn das Teilchen verfolgt wird in der Mitte eines kleinen Rasterabbildungsbereich durch eine aktive Rückkopplungsmechanismus 2 gehalten.
Die Idee der Verriegelungs, um die Partikel der Boden der Orbitalverfolgungsverfahren. Anstelle von einer Rasterabtastung einer Kreisbahn um den fluoreszierenden Teilchen durchgeführt. Die Intensität der Fluoreszenz entlangdie Umlaufbahn genau lokalisiert die Partikelposition 4.
Die lokalisierte Position des Partikels kann dann verwendet werden, um die Mikroskopscanner und Wieder Zentrum der Umlaufbahn von der Partikelposition zu betätigen. Die Galvanometer-Scannern des Mikroskops durch eine analoge Spannung angetrieben. Die Wechselstromkomponente dieser Spannung ermöglicht die Durchführung einer Umlaufbahn mit dem fokussierten Laserstrahl, dh einer Sinus und einer zur X und Y Scanspiegel angewendet wird es Durchführen einer kreisförmigen Umlaufbahn Kosinuswelle. Der Gleichstrom-Offset des Signals erleichtert das Ändern der Position der Bahn entfernt. Sobald eine Umlaufdauer bestimmt wird und die Wellenform des Wechselspannungssignals konfiguriert ist, muss das Rückführsystem, um nur die DC-Komponente des Signals zu aktualisieren.
Eine Software in der Lage, die von den Detektoren gesammelten Fluoreszenzsignal ausgelesen wird benötigt, um die Scanner und den Detektoren zu steuern, um die Position des Teilchens zu berechnen und zu aktualisieren, die DC ausgesetzt. Für eine erfolgreiche Rückmeldung Abbilden einer sorgfältigen Auswahl der Bahndaten (Größe und Timing) erforderlich ist, und diese Parameter auf der Basis der Eigenschaften der Leuchtstoffpartikel, die es notwendig, zu verfolgen ist, eingestellt werden.
Die physikalischen und mathematischen Grundlagen der Technik wurden in der Vergangenheit 4,5 für 2D-und 3D-Anwendungen beschrieben. In diesem Protokoll beschreiben wir kurz die wesentlichen Hardware-Komponenten der Einrichtung, und genauer die Wahl der Parameter und die Probenvorbereitung für einen typischen Versuch erlaubt uns folgende Verschiebung eines Lysosom mit hoher zeitlicher Auflösung in einer lebenden Zelle erforderlich.
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Protocol
1. Probenvorbereitung
- Aufrechterhaltung CHOK1-Zellen in Gewebekulturflaschen mit DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 100 IU / ml Penicillin 50 ug / ml Streptomycin ergänzt. Die Zellen in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C aufweist.
- Ernte und dann die Platte CHOK1 Zellen auf einem 14 mm Durchmesser Mikro gut mit einer Oberfläche Dicke von 0,16 mm. Samenzellen für eine optimale Dichte für die Bildgebung, etwa 60-70% Konfluenz.
- Zellen bei 37 ° C über Nacht inkubieren, 5% CO 2. In HBSS (Hank Kochsalzlösung), waschen die Zellen dreimal, und Inkubation Zellen in einer Lösung, die 50 nM Lysotracker DND26 grün und 150 nm von Tubulin-Tracker grün. Zellen Inkubation für 1 h bei 37 ° C aufweist. Optionaler Schritt: Vor der Inkubation, führen Sie eine zusätzliche Fleck mit einem mitochondrialen Matrix Färbung Farbstoff (25 nM).
- Waschen Sie die Zellen dreimal in HBSS um ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Fügen Sie frisches DMEM Wachstumsmedium vor der IMAGing die Zellen.
2. Mikroskop Konfigurationen
Das Mikroskop für die in der Video-Protokoll beschrieben Partikelverfolgung auf dem Rahmen eines im Handel erhältlichen Umkehrmikroskop (4) zusammengebaut. Allerdings kommerziellen Module für 3D-Orbitalpartikelverfolgung sind jetzt verfügbar.
- Verwenden Sie ein Coherent Chameleon Ultra II-Ti: Sa Femtosekunden-Laseranregungslichtquelle, mit einer abstimmbaren Ausgangswellenlängenbereich zwischen 690 nm-1040 nm auf.
- Sicherzustellen, dass der Laserstrahl in der hinteren Öffnung des Mikroskops unter Verwendung von IR-beschichtete Spiegel ausgerichtet ist. Der Laserstrahl wird mittels eines rotierenden Halbwellenplatte, gefolgt von einem linearen Polarisator Calcit gedämpft. Dämpfen den Strahl, so dass die mittlere Leistung an der Probe zwischen 0,5 und 2 mW.
HINWEIS: Der Laserstrahl wird durch ein Paar von Galvanometer-Stellspiegeln, die Motorsteuerung der Position und der Trajektorie des fokussierten Strahls in der Probenebene reflektierte ermöglichen. In einetypische Konfiguration der kollimierte Laserstrahl-Austritts der Galvanometerspiegel expandiert (10x), die durch einen Strahlexpander, bevor sie in die Rückseite des Mikroskopobjektiv nach Reflexion am Kurzpass dichroitischer Spiegel. - Sammeln Sie das Fluoreszenzlicht aus der Probe, indem eine hohe numerische Apertur Wasser Objektiv (60x, NA 1.2) in den Strahlengang. Wähle ein Fluoreszenzfilterwürfel gemäß den gewünschten Emissionswellenlängen in einer oder beiden Kanalkonfiguration. Beschäftigen Emissionsbandpassfilter weiter wählen den Spektralbereich der emittierten Fluoreszenz.
- Legen Sie die Probe auf einen motorisierten Tisch, und stellen Sie die Feinbewegung des Mikroskopobjektivs mit Hilfe einer objektiven Piezo-Controller.
- Lenken das Licht von der Filterwürfel in Photovervielfacherröhren, wo das Signal diskriminiert und in ein digitales I / O-Datenerfassungskarte gesendet.
HINWEIS: Computer erzeugten Wellenformen sind das analoge Ausgangssignal des I / O-Karte und provided den Scanner Steuerelektronik. Die Photonenzählung Eingabe von den Photomultipliern und das Ausgangssignal an den Scanner gemessen und über die I / O-Karte durch das Labor für Fluoreszenzdynamik SimFCS Software gesteuert.
3. Imaging
- Positionieren Sie die Zellen, die auf der Bühne und konzentrieren sich mit Durchlichtbeleuchtung.
- Wechseln Sie zu Raster-Scan-Bildgebung, um die Zellen, die den Farbstoff aufgenommen haben zu identifizieren und die zugrunde liegenden Mikrotubuli zu visualisieren. Identifizieren Sie die erste Bereich, in dem Vesikel Bewegung vorhanden ist.
- Sobald eine isolierte Vesikel identifiziert wird, legen Sie die folgenden Parameter für die Orbitalverfolgung:
- Wählen des Radius der Umlaufbahn, um die Größe der Kreisabtastung entsprechend der Größe der Teilchen verfolgt definieren. Für einen Punkt Emitter, stellen Sie den Radius der Umlaufbahn gleich der Taille des Point Spread Function (PSF) der Anregungsstrahl, um die Empfindlichkeit und Reaktion zu maximieren.
- Stellen Sie die axialeAbstand zu dem Abstand zwischen den beiden Bahnen, die ausgeführt werden, um die Partikelposition in der axialen Richtung zu lokalisieren definieren. Stellen Sie den axialen Abstand zu 1,5-3 mal der PSF Taille.
- Definieren Sie die Verweildauer je nach der Helligkeit des Teilchens, die Zeit auf jedem Punkt der Umlaufbahn, die auch die Foto-Bleichrate bestimmen verbrachte eingestellt. Verwenden Sie eine Verweildauer zwischen 10-100 us.
- Die Anzahl der Punkte in jeder Umlaufbahn auf 64 oder 128 in den Orbit Perioden in der Größenordnung von 4-32 ms ergeben und bieten eine hohe zeitliche Auflösung für die Bestimmung der Partikelposition.
- Ändern des Gleichstromoffsetsignals an den Spiegel, um den Strahl auf den Teilchen durch die grafische Benutzerschnittstelle über eine Cursor-Auswahl in dem gerasterten Bild Zentrum geschickt.
- Beginnen Tracking durch Umschalten des Mikroskop-Modus von Rasterbildern wird Orbital Scannen.
- Aktivieren Sie die Feedback-und Datenerfassung.
4. Trajectcher Analyse
- Verwenden Sie die Software, um die an jedem Punkt entlang der Bahn und zu jedem Zeitpunkt in der Form einer "Intensität Teppich 'gesammelt Fluoreszenz anzuzeigen. Die entlang der Teppich gesammelt Intensität Informationen über die Wechselwirkung des Teilchens mit anderen hellen Objekten. Die Software verwenden, um sowohl das Bahninformationen (über die Zeit der x, y-Scanner und der z -piezo dh die Verschiebung DC) als auch die Fluoreszenzintensität in Form von Zeitreihen von der Fotovervielfacherröhre über die Zeit gesammelt wurden.
- Nutzen Sie die Zeit und die Reihendarstellung 'Intensität Teppich' Informationen, die nur eine Region von Interesse in der Flugbahn zu wählen.
- Verwenden Sie die Software, um eine 2D-Projektion des ausgewählten Teil der Partikelflugbahn an. Wählen Sie die entsprechenden Kontrollen Farbcode die Flugbahn nach der Partikelfluoreszenzintensität.
- Wählen Sie die Option, um die p angezeigtArtikel Bahn in 3D, und Farbcode es nach der Fluoreszenzintensität. Drehen Sie die Flugbahn in 3D über die Steuerelemente, um die Funktionen des Lysosom Bewegung entlang der Mikrotubuli zu visualisieren.
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Representative Results
Nach diesem Protokoll schnelle 3D-Einzelpartikelverfolgung kann in lebenden Zellen mit einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop, um die Verschiebung des Fluoreszenz-markierten Lysosomen verfolgen durchgeführt werden. Die durchgeführte Experiment besteht aus einer isolierten Verfolgung Lysosom bewegenden im Inneren der Zelle nach dem Endosom Reifungsprozess 9. Die Lysosomen wurden mit einem fluoreszierenden grünen Farbstoff angefärbt und bei 930 nm zu nutzen 2-Photonen-Anregung angeregt wird. Unsere Daten zeigen, dass es möglich ist, x, y, z-Verschiebung Trajektorien mit einer Zeitauflösung von 32 ms (1a) zu erhalten. Der Teppich Analyse zeigt die Intensität entlang jeder Umlaufbahn über die Zeit (Abbildung 1b) aufgezeichnet. Während der Verfolgung der integrierten Intensität des emittierten Fluoreszenz aufgezeichnet werden (Abbildung 2a). Der rekonstruierte 3D-Trajektorie zeigt eine gerichtete Bewegung, wie aus einem Vesikel-Bewegung in der Mikrotubulus-Netzwerk zu erwarten. Einußerdem ist es möglich, die 3D-Trajektorie zu einem Raster-Scan-Bild des Umgebungsbereichs (2b) zu korrelieren. Dies bestätigt die Bewegung der Teilchen entlang der Richtung eines Mikrotubulus Bündel.
Die Zellen wurden zusätzlich mit einem roten Marker gefärbt für den späteren Mitochondrien Interaktion der Vesikel mit diesen Organellen während ihrer Bewegung zu erfassen. Es ist möglich, die 3D-Trajektorie der Teilchen innerhalb der Zelle (3a) auf die Intensität Teppich aus dem MitoTracker Fluoreszenz-Emission (Figur 3b) aufgezeichnet korrelieren. Dies ermöglicht es, die Wechselwirkungen Nähe des Vesikels mit der mitochondrialen Netzwerk in Abhängigkeit von ihrer Position innerhalb der Zelle zu erfassen. Das Emissionsmaximum im "Mitochondrien-Kanal" aufgezeichnet nicht geben funktionelle Informationen über die Art, wie die Organellen zu interagieren. Es können nur Informationen über den Zeitpunkt der Wechselwirkung bereitzustellenund die relative räumliche Position des fluoreszierenden Objekts in Bezug auf die Partikel verfolgt. Diese relative Position ist von dem Winkel in der Umlaufbahn, wo die Emissionspeaks erfasst extrahiert. Eine schematische Darstellung des Mikroskop wir verwendet, um dieses Experiment durchzuführen in 4 zu beachten.
Abbildung 1. Hubraum gegen die Zeit und die Intensität Trajektorien Teppich. a) x, y und z Lysosom Verschiebungs-Zeit-Spuren. b) Die Intensität Trajektorie (dh entlang jeder kreisförmigen Bahn senkrechte Achse gesammelt Intensität Zeit) liefert Informationen über die Umgebung der Fluoreszenz des Teilchens. Helle Flecken außerhalb der boxed entsprechen Wechselwirkungen des Teilchens mit anderen hellen Gegenständen und werden Sprünge in der Bahn als th verbunden E Bahnen wieder Zentren an der hellsten Fluoreszenzquelle. Die eingerahmten Bereich entspricht dem Abschnitt der Bahn zwischen zwei Sprüngen.
Abbildung 2. Nach der 3D-Flugbahn eines Lysosom. a) 3D-Rekonstruktion eines Teils der Flugbahn eines Lysosom gesammelt unter Verwendung von Partikelverfolgung. Die Flugbahn ist Farbe für die Fluoreszenzintensität von der Partikel gesammelt markiert (rot, hoch, blau, geringe Photonenzahl). Achsen Skalen sind in nm. Man beachte, daß x, y, z-Achsen haben unterschiedliche Bereiche. B) 2D-Projektion des 3D-Trajektorie, die Anzeige eine Überlagerung der Bewegungsbahn auf der Oberseite der Mikrotubuli in einem Raster abgebildet unmittelbar abzutasten, nachdem die Bahn aufgefangen. C) Mitochondrien MitoTracker gefärbten .
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Abbildung 3. Erweitern der Orbital Tracking auf mehr als einem Kanal (Anregung bei 930 nm). a) 3D-Flugbahn eines Lysosom innerhalb der Zelle. b) Intensität Teppich im grünen Kanal (der in diesem Kanal gesammelt Fluoreszenz wird für das Tracking verwendet.) c) Intensität Teppich im Rot-Kanal, wo die Mitochondrien wurden mit einem rot fluoreszierenden Matrix gefärbt gezielte Farbstoff. Die Regionen, in denen die Bahn in Kontakt kommt mit den Mitochondrien (Pfeilspitzen) werden als Intensität Unebenheiten in den Teppich, wie der Strahlumlaufbahn um den Lysosomen kreuzt in der mitochondrialen Matrix.
Abbildung 4. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus: modifiziertes Zwei-Photonen-Mikroskop. Schematische Darstellung des Laseraufbau: ein 2-Photonen-Ti: Sa-Laser mit einer Reichweite 690-1,040 nm war unsED, einen Polarisator und ein Halbwellenlängenplättchen verwendet werden, um die Erregungsenergie zu steuern. Alle anderen Produkte sind in der Abbildung mit den angegebenen Abkürzungen aufgelistet. Wir verwendeten einen 60X-Objektiv mit einer NA von 1,2.
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Discussion
Trotz der enormen Fortschritte der Fluoreszenzmikroskopie-Techniken und Instrumente in den letzten Jahren erreichen Bahnen der fluoreszierenden Teilchen in drei Dimensionen mit einer hohen zeitlichen Auflösung ist eine Herausforderung im Bereich geblieben. Wenn hohe zeitliche Auflösung wurde Tracking Teilchen in zwei Dimensionen erreicht, die Erweiterung zu der axialen Richtung führt typischerweise zu einer drastischen Reduktion der Frequenzgang des Systems 10.
In diesem Video-Protokoll konzentrierten wir uns auf die anschauliche Anwendung der Verfolgung eines einzelnen Teilchens in drei Dimensionen innerhalb einer lebenden Zelle mit einer hohen Zeitauflösung (32 ms in diesem Experiment) mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop. Die für die Durchführung eines solchen Experiments ist in der Regel erforderlich, um Setup-Labors, die Laser-Scanning-Mikroskopie zur Verfügung. Beide Geräte Add-ons für 3D-Orbital Tracking sowie die Steuersoftware sind auf dem Markt erhältlich, commerciaL Laserrastermikroskope, wie die von Olympus hergestellt. Die Verwendung eines gepulsten Hochleistungs-Infrarotlaserquelle, soweit vorhanden, ist vorteilhaft bei der Gestaltung des experimentellen Aufbaus, da sie nicht de-Abtasten des emittierten Fluoreszenz erforderlich. Weiterhin wurde in der Vergangenheit, die Infrarotbestrahlung ist gutartig gegenüber der Zelle unter bestimmten Bedingungen 11 gezeigt, angesichts der Reduzierung der aus der Fokus Fluoreszenz und Photobleaching.
Obwohl schnelle Verfolgung eines fluoreszierenden Teilchens in zwei Dimensionen unter Verwendung einer empfindlichen Kamera durchgeführt werden, kann das Fehlen einer dreidimensionalen Informationen werden oft bei der Auslegung des biophysikalischen Sinne der Bahninformationen begrenzen. Zum Beispiel, Bläschen, die sich entlang der Mikrotubuli laufen häufig gegen Mikrotubuli Kreuzungsbereiche 8,12. In dieser Situation ist die Verwendung eines 3D-Tracking-Verfahren überwindet die Begrenzung der Verwendung von 2D-Projektionen eines 3D-Struktur.
Aufgrund des Zeitverhaltens der Objektiv Nanopositionierers piezo Vorrichtung ist die Periode der Bewegung in der z-Achse auf etwa 30 ms begrenzt ist, während in der x, y-Richtungen kann es bis zu wenigen Millisekunden gehen. Die Lokalisierungsgenauigkeit des Verfahrens skaliert als das Signal-Rausch-Verhältnis von 4,5. Der einzige offensichtliche Begrenzung des Verfahrens, das heißt den Verlust einer globalen Ansicht der Umgebung des Teilchens wird durch die Möglichkeit der Rekonstruktion einer zeitlichen Intensitäts Teppich 13, die die Geschichte der Wechselwirkung der fluoreszierenden Partikel mit benachbarten Fluoreszenzquellen kompensiert wird, Anzeigen entweder die gleiche oder eine unterschiedliche spektrale Emission.
Wir zeigen, dass die Bewegung der Lysosomen, Vesikel, gerichtet unterziehen Bewegung entlang von Mikrotubuli, angetrieben durch entweder Kinesinen oder Dyneine, kann innerhalb einer lebenden Zelle nach Färbung mit einem handelsüblichen Farbstoff folgen. Kürzlich, 2D-Tracking von Lysosomen war korrbegeistert, der Super-Resolution-Bildgebung des Mikrotubuli-Netzwerk, in dem Bemühen der Erfassung der Routen, die die Vesikel an Mikrotubuli-Mikrotubuli-Kreuzungen 8 nehmen. 3D-Flugbahnen der Lysosomen zeigen ein komplexeres Verhalten als unidirektionale Bewegung. Obwohl ein durchschnittlicher gerichtete Bewegung beobachtet werden kann, Biegen, Verdrehen und möglichen Drehungen entlang der Tubuli können aus diesen Bahnen beobachtet werden.
Wir haben zwei wichtige Schritte bei der Durchführung dieser Experimente identifiziert: Erstens ist es notwendig, eine Markierungsdichte der Lysosomen, die gleichzeitig hoch genug ist, hell gefärbten Teilchen zu erhalten, zu erreichen, und gleichzeitig bietet eine Dichte von Teilchen niedriger genug, um Tracking der einzelnen Partikel zu ermöglichen. Im Falle von zwei sich kreuzenden Teilchen kann das Mikroskop von einem Teilchen zu einem anderen zu wechseln, während Tracking. Der zweite entscheidende Schritt betrifft die Wahl des Pixelverweilzeit, so dass eine vernünftige Balance seintweenen hohes Signal-Rausch-Verhältnis und Verfolgungsgeschwindigkeit. Wir haben beobachtet, dass die Verfolgungsgeschwindigkeit in der Größenordnung von 32 ms pro Verfolgungszyklus sind typischerweise ausreichend, um den Lysosomen mit schneller gerichteten Bewegung mit einer Geschwindigkeit von weniger als 1 um / s zu folgen.
Zusammenfassend ermöglicht die Orbital Tracking in drei Dimensionen und mit einer zeitlichen Auflösung von <40 msec der intrazellulären Bewegung von fluoreszenzmarkierten Vesikeln gemessen. Das 3D-Tracking-Orbital hat das Potential, die in der Zukunft für die Untersuchung der verschiedenen hochdynamische Prozesse wie Zell uns das Studium der Dynamik Chromatin Echtzeit-Transkription und Diffusion von Plasmonen-Nanopartikel in der intrazellulären Medium verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A.
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
