Abstract
El objetivo de este protocolo de vídeo es discutir cómo realizar y analizar un tridimensional fluorescente orbital experimento de rastreo de partículas usando un microscopio de dos fotones modificado 1. A diferencia de los enfoques convencionales de exploración de trama (o campo amplio basado en una pila de marcos), el seguimiento orbital 3D permite localizar y seguir con una alta resolución espacial (10 exactitud nm) y la resolución temporal (respuesta de frecuencia 50 Hz) el desplazamiento de 3D una partícula fluorescente pasar longitud escalas de cientos de micras 2. El método se basa en un algoritmo de realimentación que controla el hardware de una de dos fotones microscopio de barrido láser con el fin de realizar una órbita circular alrededor del objeto a ser rastreados: el mecanismo de retroalimentación mantendrá el objeto fluorescente en el centro mediante el control del desplazamiento de el haz de exploración 3-5. Para demostrar las ventajas de esta técnica, hemos seguido un orgánulo de movimiento rápido, el lisosoma, dentro de alcelular iving 6,7. Las células se cultivaron de acuerdo a protocolos estándar, y se tiñeron usando un colorante comercialmente lisosoma. Se discute brevemente la configuración de hardware y con más detalle el software de control, para llevar a cabo un experimento de seguimiento orbital 3D dentro de las células vivas. Se discuten en detalle los parámetros requeridos con el fin de controlar el microscopio de exploración y permitir el movimiento de la viga en una órbita cerrada alrededor de la partícula. Concluimos demostrando cómo este método puede ser usado efectivamente para seguir el movimiento rápido de un lisosoma marcado a lo largo de los microtúbulos en 3D dentro de una célula viva. Los lisosomas pueden moverse con velocidades en el intervalo de 0,4-0,5 m / seg, típicamente presentan un movimiento dirigido a lo largo de la red de microtúbulos 8.
Introduction
Un gran número de enfoques han sido desarrollados hasta la fecha para realizar un seguimiento de partículas fluorescentes en tres dimensiones usando un microscopio. La mayoría de los enfoques se basan en el uso de cámaras rápidas, ideal para realizar un seguimiento en dos dimensiones, por lo general combinados con modificaciones personalizadas de la óptica de emisión del microscopio para lograr el seguimiento en la dirección axial. Microscopios de barrido láser confocal (ya sea o dos fotones) convencionalmente puede rastrear una partícula fluorescente mediante la realización de una secuencia temporal de z-pilas, aunque este proceso es típicamente mucho tiempo, y produce resolución de tiempo razonable (10 Hz) sólo si la partícula está realizando un seguimiento es mantenido en el centro de una pequeña región de formación de imágenes de trama por un mecanismo de retroalimentación activo 2.
La idea de quedarse atrapado en la partícula es la base del método de seguimiento orbital. En lugar de una trama escanear una órbita circular que se realiza alrededor de la partícula fluorescente. La intensidad de la fluorescencia a lo largola órbita localiza con precisión la posición de la partícula 4.
La posición localizada de la partícula puede entonces ser utilizada para accionar los escáneres de microscopio y re-centro de la órbita en la posición de la partícula. Los escáneres galvanómetro del microscopio son impulsados por una tensión analógica. El componente de AC de este voltaje permite realizar una órbita con el haz de láser enfocado, es decir, un seno y una onda de coseno aplicado a los espejos de exploración X e Y permitirá la realización de una órbita circular. El desplazamiento de la señal de DC facilita el cambio de la posición del centro de la órbita. Una vez que un período de órbita y se determina la forma de onda para la señal de CA está configurado, el sistema de retroalimentación necesita actualizar sólo el componente DC de la señal.
Un software capaz de leer la señal fluorescente obtenida de los detectores se requiere para el control de los escáneres y los detectores, para calcular la posición de la partícula y actualizar el DC fueraestablecer. Para una evaluación exitosa imágenes de una cuidadosa selección de los parámetros de órbita (tamaño y calendario) que se requiere y estos parámetros tienen que ser ajustado en base a las características de las partículas fluorescentes que es necesario realizar un seguimiento.
Los fundamentos físicos y matemáticos de la técnica se han descrito en el pasado de 4,5 tanto para aplicaciones 2D y 3D. En este protocolo se describen brevemente los principales componentes de hardware de la configuración, y con más detalle la elección de los parámetros y de la preparación de la muestra necesario para un experimento típico permitiéndonos tras el desplazamiento de un lisosoma en una alta resolución temporal dentro de una célula viva.
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Protocol
1. Preparación de muestras
- Mantener células CHOK1 en matraces de cultivo de tejido utilizando DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 UI / ml de penicilina 50 g / ml de estreptomicina. Se incuban las células en una incubadora humidificado 5% de CO 2 a 37 ° C.
- Cosecha y luego placa células CHOK1 sobre un diámetro micro-bien 14 mm con un espesor de 0,16 mm superficie. Se siembran las células de la densidad óptima para la imagen, en torno al 60-70% de confluencia.
- Se incuban las células durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. Lavar las células tres veces en HBSS (Hank Buffered Saline Solution), e incubar las células en una solución que contiene 50 nM de DND26 Lysotracker verde y 150 nM de verde rastreador de la tubulina. Se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C. Paso opcional: Antes de la incubación, realizar una tinción adicional con un colorante de tinción de la matriz mitocondrial (25 nM).
- Lavar las células tres veces en HBSS para eliminar cualquier colorante no unido. Añadir medio de cultivo DMEM fresco antes de la imagción de las células.
2. Microscopio Configuraciones
El microscopio para el rastreo de partículas se describe en el protocolo de vídeo está montado en el bastidor de un microscopio invertido comercialmente disponible (Figura 4). Sin embargo módulos comerciales para el rastreo de partículas orbital 3D ya están disponibles.
- Use un II coherente Camaleón-Ultra Ti: Sa femtosegundo fuente de luz de excitación láser, con una longitud de onda sintonizable rango de salida entre 690 nm-1040 nm.
- Asegúrese de que el rayo láser está alineado en el puerto trasero del microscopio utilizando espejos IR-revestido. El rayo láser se atenúa usando una placa de media onda giratoria seguido por un polarizador lineal calcita. Atenuar el haz de manera que la potencia media en la muestra es entre 0.5 y 2 mW.
NOTA: El rayo láser se refleja por un par de espejos accionados por motor galvanómetro que permiten el control de la posición y trayectoria del haz enfocado en el plano de la muestra. En unaconfiguración típica del haz de láser colimado que sale de los espejos de galvanómetro se expande (10X) que pasa a través de un expansor de haz, antes de entrar en la parte trasera del objetivo del microscopio después de la reflexión en espejo dicroico pase corto. - Recoger la luz de fluorescencia de la muestra mediante la colocación de un objetivo de alta abertura numérica agua (60X, NA 1.2) en la trayectoria de la luz. Elegir un cubo de filtro de fluorescencia de acuerdo con las longitudes de onda de emisión deseados en uno o dos de configuración de canal. Emplear filtros de paso de banda de emisión para seleccionar aún más la gama espectral de la fluorescencia emitida.
- Colocar la muestra en una platina motorizada, y ajustar la multa movimiento del objetivo del microscopio utilizando un piezo-controlador objetivo.
- Dirija la luz del cubo de filtro en tubos fotomultiplicadores donde se discrimina la señal y la envía a un I / O tarjeta de adquisición de datos digital.
NOTA: El ordenador genera formas de onda son la salida analógica de la tarjeta de E / S y son Provided a los escáneres de control de la electrónica. La entrada de conteo de fotones de los fotomultiplicadores y la señal de salida a los escáneres se mide y se controla a través de la tarjeta de E / S por el Laboratorio de software de fluorescencia Dynamics SimFCS.
3. Imaging
- Coloque las células en el escenario y enfocar con iluminación de luz transmitida.
- Cambiar a formación de imágenes de exploración de trama para identificar las células que han incorporado el colorante y para visualizar los microtúbulos subyacentes. Identificar la zona inicial donde el movimiento de la vesícula está presente.
- Una vez que una vesícula aislado se identificó, establecer los siguientes parámetros para el seguimiento orbital:
- Seleccione el radio de la órbita para definir el tamaño de la exploración circular de acuerdo con el tamaño de la partícula siendo rastreado. Para un emisor de punto, establecer el radio de la órbita igual a la cintura de la función de dispersión del punto (PSF) de la viga de excitación para maximizar la sensibilidad y la respuesta.
- Ajuste el axialdistanciarse para definir la distancia entre las dos órbitas que se realizan para localizar la posición de la partícula a lo largo de la dirección axial. Establezca la distancia axial a 1,5-3 veces la cintura PSF.
- Definir el tiempo de permanencia en función del brillo de la partícula para establecer el tiempo dedicado a cada punto de la órbita, que también determinará el tipo de foto-blanqueo. Utilice un tiempo de espera entre 10 a 100 microsegundos.
- Establecer el número de puntos en cada órbita a 64 o 128 para producir períodos orbitales en el orden de 4-32 ms y proporcionar una alta resolución temporal para determinar la posición de la partícula.
- Cambie la señal DC compensar envía a los espejos con el fin de centrar el haz sobre la partícula a través de la interfaz gráfica de usuario a través de una selección cursor en la imagen raster-escaneada.
- Comience seguimiento al cambiar el modo de microscopio de raster de imágenes para la exploración orbital.
- Active la recogida de opiniones y datos.
4. TrajectAnálisis ory
- Utilice el software para visualizar la fluorescencia recogida en cada punto a lo largo de la órbita y en cada punto en la forma de una "alfombra intensidad" tiempo. La intensidad de recogida a lo largo de la alfombra proporciona información sobre la interacción de la partícula con otros objetos brillantes. Utilice el software para visualizar tanto la información de trayectoria (es decir, el desplazamiento de CC en el tiempo de la x, y y los escáneres de la -piezo z), así como la intensidad de fluorescencia obtenida de la tubo fotomultiplicador con el tiempo en forma de series de tiempo.
- Utilice la representación de series de tiempo y la información 'alfombra intensidad "para seleccionar sólo una región de interés en la trayectoria.
- Utilice el software para mostrar una proyección 2D de la parte seleccionada de la trayectoria de la partícula. Seleccione los controles apropiados para el código de color de acuerdo a la trayectoria de la intensidad de fluorescencia de las partículas.
- Seleccione la opción para mostrar la partículo trayectoria en 3D, y código de color de acuerdo a la intensidad de fluorescencia. Girar la trayectoria en 3D utilizando los controles para visualizar las características del movimiento lisosoma a lo largo de los microtúbulos.
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Representative Results
De acuerdo con este protocolo de seguimiento de una sola partícula 3D rápido puede llevar a cabo dentro de las células vivas con un microscopio de dos fotones modificado para seguir el desplazamiento de los lisosomas marcados con fluorescencia. El experimento llevado a cabo consiste en el seguimiento de un lisosoma aislado en movimiento dentro de la célula después del proceso de maduración endosoma 9. Los lisosomas se tiñeron utilizando un tinte verde fluorescente y se excita a 930 nm de excitación que explotan 2 fotones. Nuestros datos muestran que es posible obtener x, y, z trayectorias de desplazamiento con una resolución temporal de 32 mseg (Figura 1a). El análisis alfombra muestra la intensidad registrada a lo largo de cada órbita con el tiempo (Figura 1b). Durante el seguimiento de la intensidad integrada de la fluorescencia emitida se puede grabar (Figura 2a). La trayectoria 3D reconstruida muestra un movimiento dirigido, como se puede esperar de una vesícula en movimiento en la red de microtúbulos. Adicionalmente, es posible correlacionar la trayectoria 3D una imagen de exploración de trama de la región (Figura 2b) que rodea a. Esto confirma el movimiento de la partícula a lo largo de la dirección de un haz de microtúbulos.
Las células se tiñeron adicionalmente con un marcador rojo para las mitocondrias para grabar eventual interacción de la vesícula con estos orgánulos durante su movimiento. Es posible correlacionar la trayectoria 3D de la partícula dentro de la célula (Figura 3a) a la alfombra intensidad registrada de la emisión de fluorescencia MitoTracker (Figura 3b). Esto nos permite registrar las interacciones de proximidad de la vesícula con la red mitocondrial en función de su posición dentro de la célula. El pico de emisión registrados en el "canal de las mitocondrias" no da información funcional sobre la forma en que los orgánulos interactúan. Puede proporcionar sólo información sobre el momento de su interaccióny la posición espacial relativa del objeto fluorescente con respecto a la partícula siendo rastreado. Esta posición relativa se extrae desde el ángulo dentro de la órbita donde se registra el pico de emisión. Una representación esquemática del microscopio se utilizó para llevar a cabo este experimento se puede observar en la Figura 4.
Figura 1. Desplazamiento vs trayectorias de tiempo y alfombra intensidad. a) x, y y z desplazamiento lisosoma vs. trazas de tiempo. b) La trayectoria intensidad (es decir, la intensidad de recogida a lo largo de cada eje vertical órbita circular es el tiempo) proporciona información sobre el entorno de fluorescencia de la partícula. Los puntos brillantes fuera de la caja corresponden a las interacciones de la partícula con otros objetos brillantes, y se asocian a saltos en la trayectoria como ª e órbitas vuelve a centrar en la fuente de fluorescencia más brillante. La región de caja corresponde a la porción de la trayectoria entre dos saltos.
Figura 2. Siguiendo la trayectoria 3D de un lisosoma. a) reconstrucción en 3D de una parte de la trayectoria de un lisosoma recogió mediante rastreo de partículas. La trayectoria es un código de color para la intensidad de la fluorescencia obtenida de la partícula (rojo, alto, azul, bajo recuento de fotones). Escalas de los ejes están en nm. Tenga en cuenta que x, y, z ejes tienen diferentes rangos. Proyección b) 2D de la trayectoria 3D, que muestra una superposición de la trayectoria en la parte superior de los microtúbulos fotografiado en una trama inmediatamente después de escanear Se recogió la trayectoria. C) Las mitocondrias teñidas con MitoTracker .
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Figura 3. Extendiendo el seguimiento orbital a más de un canal (excitación a 930 nm). a) trayectoria 3D de un lisosoma dentro de la célula. b) alfombra intensidad en el canal verde (la fluorescencia recogida en este canal se utiliza para el seguimiento). c) Intensidad de la alfombra en el canal rojo, donde las mitocondrias se tiñeron con una matriz fluorescente de color rojo colorante objetivo. Las regiones en las que la trayectoria entra en contacto con las mitocondrias (puntas de flecha) aparecen como protuberancias de intensidad en la alfombra, como el haz en órbita alrededor de la lisosoma se cruza en la matriz mitocondrial.
Figura 4. Esquema del montaje experimental: modificado microscopio de dos fotones. Representación esquemática del láser configuración: a 2-Fotón Ti: Sa láser con un rango 690-1,040 nm nosotros eraed, un polarizador y una placa de onda media se utilizan para controlar la potencia de excitación. Todos los demás elementos se enumeran en la figura utilizando las abreviaturas indicadas. Se utilizó un objetivo de 60X con una NA de 1,2.
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Discussion
A pesar de los enormes progresos de las técnicas de microscopía de fluorescencia y instrumentaciones de los últimos años, logrando trayectorias de las partículas fluorescentes en tres dimensiones con una alta resolución temporal se ha mantenido un reto en el campo. Si de alta resolución temporal se ha logrado partículas de rastreo en dos dimensiones, la extensión a la dirección axial típicamente trae una drástica reducción en la respuesta de frecuencia del sistema 10.
En este video-protocolo nos centramos en la aplicación demostrativa de seguimiento de una partícula individual en tres dimensiones dentro de una célula viva con una alta resolución temporal (32 ms en este experimento) utilizando un microscopio de dos fotones. La configuración necesaria para llevar a cabo un experimento de este tipo es normalmente disponible para los laboratorios que realizan la microscopia de escaneo láser. Ambos instrumentos complementos para el seguimiento de la órbita 3D, así como el software de control están disponibles en el mercado, para commerciamicroscopios de barrido l láser tales como los fabricados por Olympus. El uso de una fuente de láser de alta potencia infrarroja pulsada, cuando estén disponibles, es ventajoso en el diseño de la configuración experimental, ya que no requiere de escaneado DE de la fluorescencia emitida. Además se ha demostrado en el pasado que la irradiación infrarroja es más benigna hacia la celda, en condiciones específicas 11, dada la reducción de la fluorescencia de enfoque y foto-blanqueo.
Aunque el seguimiento rápido de una partícula fluorescente en dos dimensiones se puede realizar utilizando una cámara sensible, la falta de información en tres dimensiones puede ser a menudo limitante en la interpretación del significado de la información biofísica trayectoria. Por ejemplo, las vesículas se mueven a lo largo de los microtúbulos con frecuencia chocan con las regiones microtúbulos intersección 8,12. En esta situación, el uso de una técnica de seguimiento 3D supera el límite de la utilización de proyecciones 2D de una estructura 3D.
Debido al tiempo de respuesta de nuestro dispositivo piezoeléctrico nanopositioner objetivo, el período del movimiento en el eje z se limita a aproximadamente 30 ms, mientras que en la direcciones x, que pueden bajar a unos pocos milisegundos. La precisión de localización del método de escalas como la relación señal a ruido de 4,5. La única limitación aparente del método, es decir, la pérdida de una visión global del entorno de la partícula, es compensado por la posibilidad de reconstruir una alfombra intensidad temporal 13, trazando la historia de las interacciones de la partícula fluorescente con fuentes fluorescentes vecinos, se presentan ya sea la misma o una emisión espectral diferente.
Se demuestra que el movimiento de los lisosomas, vesículas que se someten a movimiento a lo largo de los microtúbulos dirigidos, alimentada por kinesins o dyneins, se puede seguir dentro de una célula viva después de la tinción utilizando un colorante disponible en el mercado. Recientemente, el seguimiento de los lisosomas 2D era correufórico a la formación de imágenes de super-resolución de la red de microtúbulos, en el esfuerzo de detectar las rutas que llevan a las vesículas-microtúbulos microtúbulos intersecciones 8. Trayectorias 3D de los lisosomas muestran un comportamiento más complejo que el movimiento unidireccional. Aunque un promedio dirige el movimiento se puede observar, flexión, torsión y posibles rotaciones a lo largo de los túbulos pueden ser observados a partir de estas trayectorias.
Hemos identificado dos pasos críticos en la realización de estos experimentos: en primer lugar, es necesario para conseguir una densidad etiquetado de los lisosomas que es al mismo tiempo lo suficientemente alto para obtener partículas brillantes manchadas, y que al mismo tiempo proporciona una densidad de partículas de baja suficiente para permitir el seguimiento de las partículas individuales. En el caso de dos partículas de cruce, el microscopio puede cambiar de una partícula a otra mientras que el seguimiento. El segundo paso crítico se refiere a la elección del tiempo de permanencia de píxel, lo que permite un equilibrio razonable seainterpolar alta relación señal a ruido y la velocidad de seguimiento. Hemos observado que la velocidad de seguimiento en el orden de 32 ms por ciclo de seguimiento son típicamente suficiente para seguir los lisosomas sometidos a movimiento rápido dirigido a velocidades inferiores a 1 m / seg.
En resumen, el seguimiento orbital permite medir en tres dimensiones y con una resolución temporal de <40 mseg, el movimiento intracelular de vesículas marcados con fluorescencia. El seguimiento orbital 3D tiene el potencial para ser empleado en el futuro para el estudio de diferentes procesos celulares altamente dinámicos tales nosotros el estudio de la dinámica de la cromatina en tiempo real-de transcripción y de difusión de las nanopartículas plasmónica en el medio intracelular.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Tubuline tracker Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Coherent Chamelon- ultra II TI | Coherent | ||
| Glan Taylor Calcite Polarizer | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Galvanometer-motor mirror | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Motorized stage | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Data acquisition card | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Imaging software | LFD | Global for images-SimFCS |
References
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