無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

Summary

マウス副嗅球（AOB）は、感覚コーディングのコンテキストで勉強することは困難であった。ここでは、AOBニューロンは、マウスのフェロモンとカイロモンの情報処理の研究を容易にする、その周辺の入力に機能的に接続されたままでいるエクスビボ製剤を生成する解剖を示す。

Abstract

マウス付属嗅覚システム（AOS）は、不揮発性、社会的な臭い、フェロモン、およびカイロモンを検出するための専門的な感覚経路である。 AOS経路の最初の神経回路は、副嗅球（AOB）と呼ばれる、そのような領土侵略や交配などの性の典型的な行動を確立する上で重要な役割を果たしている。この小さな（<1ミリメートル^3）回路は、同種の分泌物や排泄物中の化学感覚手がかりから性別、歪み、ストレスなどのユニークな行動の状態を区別するための能力を持っています。このシステムのコンパクトな組織は同時に、回路の大部分から記録するためのユニークな機会を提供しながら、AOBにおける感覚処理の調査は主に脳内でその実験的に不利な場所に、依然として厳しい。ここでは、接続したまま、前のマウスの頭蓋骨の単一半球の内側にそのままAOBを削除多段解剖を実証そのまま周辺鋤鼻感覚ニューロン（のVSN）、および局所神経回路の両方にイオン。手順は、麻酔薬の非存在下でのAOB回路素子からの電気生理学的および光学的記録を容易に目視検査を指示するAOBの表面を露光する。のVSNを収容する鋤鼻器（VNO）の中に細いカニューレを挿入すると、1は直接AOB下流の活動を記録しながら、社会的な臭いやフェロモンに周囲を公開することができます。この手順では、行動の変化へのフェロモンの暴露をリンクメカニズムに光を当てることができ、AOS情報処理に制御問い合わせを可能にします。

Introduction

哺乳動物の脳における感覚処理は、典型的には、感覚入力から特定の特徴を抽出する各々は、複数の相互に接続された神経回路にまたがる。感覚経路では、初期の情報処理は、通常の認知と行動のために不可欠である。付属品嗅覚系（AOS）は、副嗅球（AOB）はホルモンバランス^1,2、攻撃^3、および覚醒^4を指示下流構造に感覚周辺を結ぶ主要な神経回路である。このように、この回路内の情報処理が強く、動物の行動の変化にリンクされている。

副嗅球が密集下に主嗅球（MOB）の背側/尾側/後面に、マウスとラットに位置しており、嗅脳洞の血管化。 AOBは、鋤鼻器（VNO）に存在する末梢鋤鼻感覚ニューロン（のVSN）の軸索から求心性神経支配を受け、Smalのただ、軟口蓋上​​前歯鼻がLブラインドエンドチューブ。これらの軸索は、鼻腔の内側境界で中隔組織の繊細なシートを横断する。いくつかの研究は、麻酔したマウス^5-7または自由に探索した動物^8を用いてインビボで （マウスの尿など）のAOS悪臭の源へのAOBの神経応答をプロービングしています。英雄は、（a）は、気管切開の不揮発性悪臭を導入する深麻酔を確保し、液体の刺激^5-7の吸引を防ぐため、交感神経頸神経節⁶や鋤鼻器^5,7の直接カニュレーションの（b）の刺激に関与in vivo試験で麻酔しそして（c）前頭葉切除の有無にかかわらず開頭術は、AOB ⁶に電極進出を可能にする。アウェイク/研究のマイクロドライブの^8月10日 、関係外科的移植を振る舞う。要するに、これらの実験パラダイムは強力ですが、非常に困難で、多くの場合、全身麻酔を必要とする。

11月15日に、本 ​​体（ex vivoで ）外で生きている感覚な構造と下流の神経回路を維持しようとしました。 VNOとAOBとの間の接続は、同側のままであり、正中中隔組織は、単一の半 ​​球に酸素化superfusateに露出することができるので、我々は、それらの機能的接続性を維持しながら、これらの構造を単離するためにこのような単一の半 ​​球ex vivoでのアプローチを開発しようとしたためである。我々は最近、この目標^16を達成することに成功しました。 （正中ソフト中隔組織に沿って）軸索とAOBの両方が酸素化された人工脳脊髄液を（灌流にアクセス可能な、比較的浅い<600μmの特徴であるため、6時間 - この準備には、少なくとも4生きていると、機能的に接続され、VNOとAOBの両方を保持しますaCSFは）。このVNO-AOB ex vivoで準備が薄いカニューレを介して、VNOに制御刺激の導入を可能にし、目標と電極配置および/またはライブ蛍光顕微鏡用の小さなAOBへの直接視覚的にアクセス。一つは麻酔薬の非存在下でこれらの回路を研究することを望む場合、この方法は有利である。このアプローチは、遠心の接続を切断するので、ウェルAOB機能の変調に遠心問い合わせには適していない。 VNO-AOB ex vivoで準備が学ぶことは困難ですが、一度達成し、この強力な感覚回路の回路構成、情報処理、および神経可塑性を調査する際に信頼性の高いプラットフォームを生成します。

Protocol

全ての実験は、UTの南西施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実施し、実験動物が経験するストレス、不快感や痛みを最小にするように選択した。

1。解剖会議所

カスタム解剖室と小さな、薄いプラスチック板は、最良の結果（ 図1）のために必要とされる。このプロトコルを試みる前に、チャンバを構築するか、入手する。

2。解剖ソリューション

1. ステップ3.22から5.4で使用するための標準的な人工脳脊髄液（ACSF）を1リットル調製。 NaClを125 mMの塩化カリウム2.5 mMの_塩化カルシウム2 mMのMgCl _2を 1 mMの、 _炭酸水素ナトリウム25 mMののNaH ₂ PO ₄ 1.25ミリモル、ミオイノシトール3 mMのピルビン酸ナトリウム2mMの、アスコルビン酸ナトリウム0.4ミリメートル追加し、25グルコースmMの発熱物質を含まない水1Lに。
2. 初期解剖のaCSF（200ミリリットル）を準備ステップ3.3から3.22で使用しています。標準のACSF 200ミリリットルを取り、 _塩化マグネシウム水和物0.366グラムを追加することにより、9㎜のMgCl ₂濃度を高めています。
3. NaClを115 mMの塩化カリウム5mmでのCaCl _2、2 mMのMgCl _2を 、2 mMの、 _炭酸水素ナトリウム25 mMのHEPES 10 mMのを含むステップ4.11から5.4で使用するためのカニューレを通じてVNOへの刺激を運ぶために、標準のリンゲル液を準備し、 10 mMのグルコース。
4. 気泡使用するまで15分間で最低37℃の水浴中で95％O _{2、5％CO 2}ガスで標準のaCSFおよびリンガー0.5 L 0.8 L。
5. バブル95％O ₂との初期切開のaCSF 200mlを、それを4℃で15〜20分間、氷上で5％のCO ₂ガスに達するまで

3。プライマリ解剖

1. 解剖エリアを準備します。 3 35ミリメートルペトリ皿、酸素化aCSFを、断頭はさみ、ストレートはさみを解剖、解剖ハサミを湾曲、アドソン鉗子、＃11頭皮を配置エルブレードとハンドルと氷上でかみそりの刃。
2. 酸素化aCSFは4℃に冷却した後、深くIsothesia 2〜5ミリリットル（99.9％イソフルラン）を用いて乾燥チャンバー内に動物を麻酔する。動物が深く麻酔であることを保証するために、尾、足のピンチテストを実行します。
3. 深麻酔が確認されると、動物を斬首し、すぐにチルド解剖のaCSFで満たされたペトリ皿に頭を置く。注：使用しないときは、作業中はクールに保つために冷蔵解剖のaCSFで組織を浸します。
4. 湾曲したハサミで下側面（腹咽頭、下顎、舌）を取り外します。
5. アドソン鉗子deglove（皮）表面的な皮膚や頭蓋骨から筋肉の添付ファイルを使用して。ピールは、添付ファイルの唯一のサイトまで、尾側から吻側への頭皮は前歯を超えている。湾曲したハサミを使用して接続ポイントで組織を切断する。ピンセットでそれをつかんで目を削除し、準備から引き離す。 N耳degloving手順の最後には、上顎骨のない筋肉の添付ファイルにアドソン鉗子を使用して、繊細な鼻軟骨に無理な力を避ける。注：ストレートはさみで頭蓋骨の尾側面から頭皮を外します。
6. シザーヒントは前頭骨（直前嗅脳洞へ）に数mmになるまでまっすぐハサミで、吻側に尾側から頭蓋骨の正中線を削減。
7. アドソン鉗子を使用して頭蓋骨の頭頂と前頭骨を取り除きます。注：前頭骨の破片は、多くの場合、鼻腔洞への尾鼻の骨に付着したままになります。嗅球に連絡しないように注意し、慎重にこれらの作品を削除します。
8. 副鼻腔に前頭葉2ミリメートルの尾によって冠状カットを行ってからカットして、脳の尾を削除するために、メスを使用しています。完全に事後組織を切断するために、メス接点腹頭蓋骨の骨の輪郭の先端を確認してください。注：これは有効に横嗅覚路や嗅球の機械的ストレスをかけることなく、脳の大半を除去する。
9. ストレートはさみで腹頭蓋骨の露出尾側面を外します。副鼻腔、残りの神経組織を残す。
10. まっすぐはさみを使って頭蓋骨の解剖学的右側頬骨弓や顔の筋肉を取り除く
11. 口の屋根を公開する（腹側を上にして）鼻を裏返します。
12. 切歯のすぐ尾味覚をカットし、削除します。口の屋根に口蓋と平行の下でメスの刃の先端を挿入することで、これを行うと、その後切歯に向けてブレードを移動します。
13. アドソン鉗子と口蓋の解放（吻側）の端を持ち、尾側に引いて外します。
14. 頭蓋骨の解剖学的左側に、臼歯の近くの小さな孔から開始し、尾側口蓋孔を拡張するために手術用メスの刃を使用しています。メスのblaの先端を挿入することによってこれを達成する臼歯の近くに無効に解除し、手首を回転させる。注：ブレードの先端のみを使用し、細心の注意を払ってください - 深いカットが中隔組織を損傷する可能性が。
15. メスの刃の先端を使用して、解剖学的左鋤鼻器官に吻側を開始、切歯を通じて口蓋孔からカット。複数のスコアリングカットを使用してください。深すぎるのブレードを挿入することにより、中隔組織と鋤鼻神経を損傷しないようにしてください。
16. 背側頭蓋骨が上を向いているので、組織をオンにしてから、準備の尾エッジに垂直にまっすぐかみそりの刃（正中線に平行）に向けます。
17. 組織の腹側縁で、すぐに正中線の左にカミソリの刃の刃先をタッチします。そっと刃を揺すると、左口蓋孔（ステップ3.14で導入された領域をカット）に沿って移動する。
18. 組織の背側縁部に、正中線のすぐ左（1mm未満）をかみそりの刃先を配置する。
19. 保管ブレードは、組織の前方に向けて圧力を徐々にカミソリの刃を揺らし、正中線に平行である。篩板の抵抗に注目してください。この抵抗を突破した直後に停止します。注：この時点では、右半球は左半球から緩める。唯一残っている接続は、篩板の背側鼻前部に沿って半球の間にある。
20. 手袋をした指で尾側に近く、それらをつかみ、ゆっくりと横方向に前方にそれらを回転させて半球を分離する。注：この手順は、特にずれたか脆いsnouts（ 例えば 、高齢のマウス）を用いたマウスでは、実験的な変動性の源である。強い抵抗に遭遇した場合にも、互いに離れる半球を回転しようとしたときに、結合組織を弱める背側鼻（篩板の前方に）スコア。そうする間に、中隔TIが損傷することができ、深くメスを挿入しない細心の注意を取るssueと鋤鼻神経。
21. 板に組織接着剤を少量（50〜100μl）をつけて軽くアドソン鉗子を使用して、接着剤の上に右半球の側縁に配置します。板に時期尚早グルー重合、緩い付着を防止するために、ペーパータオルを使用して準備の側面から余分な水分を取り除きます。 NOTE：組織が接着剤の上に配置された後に接着剤の重合を促進するために試料に冷却した切開のaCSF数滴を適用する。これは、組織が板にしっかりと保持保たれます。
22. 二解剖室の中央に真空グリースを少量（3〜5ミリメ​​ートル、直径、深さ2mm）を置き、しっかりとグリースに対して組織反対板の側面に配置します。すぐに細かい解剖領域に転送し、酸素化標準のaCSFで灌流を開始、チルド解剖のaCSFと解剖室を埋める。オリエント板嗅球が直接になるように新鮮に酸素化され、標準のACSFストリーム。

4。二解剖

1. 細かい鉗子を使用して製剤から目に見える反対側（左）嗅球または皮質組織を除去する。 （半鈍点を形成する）細かい鉗子を一緒につまんで、その後、正中線に近い背側組織の尾の部分に配置します。そっと前方運動でゆっくりと右半球から組織を剥離し、正中線に沿って挟ま鉗子を実行します。対側嗅球組織を含む反対組織のすべてを削除します。 AOBまたは鋤鼻神経に損傷を引き起こす可能性が組織を通して刺ししないよう十分注意してください。
2. 嗅球の背側/内側表面に沿って白い硬膜を観察します。細かい鉗子の2ペアが硬膜の白い部分に把握することで、嗅球の背側/尾側縁に沿って、この硬膜を引き裂き、そのポイントからそれらを離れて引っ張る。硬膜はしっかりある嗅球に巻きつけ、それが削除されている間に簡単に、それ自体の組織をスライスすることができます。嗅球とAOB自体の内側面への損傷を避ける。注：硬膜がこの時点で簡単に引き裂く抵抗する場合は、分離を容易にするために、春の先端解剖ハサミで小さなカットをご紹介します。
3. じっくりと根本的嗅球にダメージを与えることなく、細かい鉗子で前頭皮質を剥離し。 AOBのすぐ尾側半透過ネットとして現れる血管のコレクションを遵守してください。電気生理学的実験で電極への浸透を促進するために、細かい鉗子でこのネットを削除します。それは、前頭皮質の後退中のAOBから離れるようにピンセットでネットをつかみ、AOBに触れないように注意しながら、尾側および内側引いてそれを削除します。前頭皮質は、嗅球から分離された後、AOBに腹と後ピンセットで切断して取り外します。注：元を取るそれはあまりにも大まかに行われた場合、ネットを除去しながら注意してエクストリームのための糸球体層が損傷を受けることがあります。
4. 公開される対側鼻腔では、細かい鉗子を使用して、残りの反対側の中隔組織（血管を含んだ薄っぺらな黄色がかったシート）を削除します。 （中隔の骨の近く）尾/背部で組織を把持した後、前方側へ組織を持ち上げ/引き出します。 NOTE：対側性中隔組織が誤って片側切断工程（ステップ3.20）の間に除去することができる。このような場合には、白、無血管中隔の軟骨とやや透明、血管化中隔の骨を観察します。この場合は、ステップ4.4を省略することができる。
5. 慎重に中隔の軟骨とVNO「翼」（両方VNOsの背側縁に沿って走る骨組織の薄片の間の微妙な鉗子の一点を実行することで、対側VNOを削除します。
   1. 軟骨から翼離脱に続いて、腹側に鉗子の先端を移動させる正中線に近い反対VNOへ。鉗子でつかんで離し持ち上げることにより、それを削除することを可能にする、それを緩め、反対VNOの頭側/尾側軸に沿っていくつかの場所で、この手順を繰り返します。
6. 細かい鉗子で（それは中隔の骨の腹側縁部に沿って実行されている白の無血管帯に狭くなっている）尾/腹側縁部でカットすることにより、中隔の軟骨を除去するための準備をします。
7. 半鈍ポイントを作るために一緒に細かい鉗子をつまんで中隔の軟骨を除去します。ステップ4.6で行われたカットを識別し、そのカットする（横）の背後に挟ま鉗子を挿入し、ゆっくりと中隔組織から吻側進ん軟骨を持ち上げます。注：基礎となる中隔組織を混乱しないでください。軟骨を持ち上げたように、軟骨の緩い癒着に起因する中隔組織伸張の基盤となるシートを観察します。緩いAの、このサイトに沿って挟ま細かい鉗子の、定期的な穏やかな、安定した動きdhesionが大きく二つの構造の正常な分離を容易にすることができる。
8. 中隔骨を除去するために曲がった先端で第3位ピンセットを使用してください。中隔の骨の面に対してほぼ平行な角度で中隔骨にアプローチ。中隔組織と骨との間の中隔湾曲したコーディネートを挿入します。鉗子で骨をつかみ、ゆっくりと篩板の近くにひびまで前後に骨を移動します。注：場合によっては、中隔の骨は篩板の近くに崩壊に抵抗する。この場合は、静かにちょうどステップ4.8を繰り返した後、篩板の前方背側/腹軸に沿って中隔の骨を獲得するために細かい鉗子を使用しています。
9. 入口で細かい鉗子の1対つまんと細かい鉗子の別のペアで吻側引いて、VNOのすぐ吻側白い軟骨を除去します。
10. 速い灌流装置へポリイミドカニューレを取り付け、ポリイミドカニューレを通してリンゲル液（0.1〜0.3ミリリットル/分）の流れを開始する。NOTE：イン·ライン、小体積流量計で測定流量。コンピュータ制御の空気圧刺激スイッチング素子の使用は、刺激中の流量の変化を減少させる。応答が刺激固有であることを確認するために（リンゲル液をコントロールする）モック刺激に対する応答と刺激をテストするための神経応答を比較。
11. VNOの入り口にカニューレ平行に向けます。カニューレは良好VNOの入口に平行であるときに出口圧力がVNOをさせるように、血管の排気を導く「膨張」腕時計。すぐにそれはVNO開口部と平行に維持されるように、カニューレを一定の角度を保ち、VNOにカニューレを挿入します。注：プラスチック製の板に対する細かい鉗子の1対のカニューレを保持し、やや上向きに角度をカニューレの端を細い鉗子の別のペアを使用するために役立ちます。 1が誤ってVNOの後ろにカニューレを配置した場合、流出もVNO血管を引き起こす可能性があります避難する、適切なカニュレーションが行われた印象につながる。適切な場所は、リンゲル液中の染料を組み込むことによって確認することができる。カニューレが適切に配置されると、色素だけべきVNOの入口を介して出口。また、1は、カニューレがVNOの半透明の内側面を通して簡単に表示されていることを保証することにより、適切な配置を確認することができます。
12. AOBはVNOからカニューレを落とさないように注意して、標準のACSF直接流れになるまで、ゆっくりとプラスチック板を移動します。解剖が完了し、生理的機能の評価がすぐに開始することができる。ステップ5簡単な評価を行うための1つのアプローチについて説明します。

5。評価

1. 外アンプとオシロスコープに接続され、2〜4MΩのホウケイ酸ガラス微小電極をAOBの表面に浸透。
2. ゆっくりと100〜200ミクロンの深さまで微小電極を進める50ミクロン/分の速度で表面。注：この組織深さで、1は、微小電極電圧の急激な、簡単な（〜1〜2ミリ秒）のたわみにより例示される時々の自発的な活動電位波形を発生します。
3. 活動電位波形に遭遇すると、微小電極を進めて停止します。
4. 観察、および/ ​​またはVSN活動の既知の活性化（ 例えば 、50のKClを含むリンゲル液）に制御リンゲルから刺激配信ソリューションを変えながら活動電位率を記録。切開が成功した場合は、活動電位速度または局所電場電位の刺激依存性変化を観察することができる。注：すべてのAOBニューロンは（50 mMのKClを含むリンゲル液を含む）発火率の増加に伴ってすべての刺激に応答します。発火率の刺激依存性の減少はまた、機能の接続性と成功解剖を示している。二つ以上のニューロンが発生した場合には、そのVNOの刺激に応答しない場合、または活動電位が複数の電極の貫通後に観察されていない場合、これは失敗した解剖を示唆している。この場合、新たな切開は、ステップ3で開始することができる。

Representative Results

この準備と成功を達成することは、大規模な練習が必要ですし、それが失敗する可能ないくつかのステップがあります。一つは、成功を達成する前に、多くの試みを必要とするように期待してください。カスタム解剖室は、このプロトコルが正常に完了するために必要であり、事前の解剖の後の段階を開始する取得する必要があります。 図1に示すチャンバ設計は、この目的のために十分であり、最小限の機械加工の要求に比較的安価なプラスチックで作ることができる。 1は、このような容器を生産する能力を欠いている場合は、ローカルまたはオンラインの加工会社に相談することができ、有料でチャンバーを構築することができます。

調剤全体の変動性の大きなソースは実験動物の頭蓋骨と鼻の骨の密度と脆さである。片側切断ステップ（ステップ3.14から3.20）の間に、目標は、同側の中隔組織と一緒に両方の鋤鼻器官を分離することで、同側副嗅球。中隔組織が ​​対側半球に付着したままにしかし、それは、鼻の背側骨に特に近い取付点は珍しいことではありません。 図2は、効果的かつ効果のない片側切断の例を示しています。

他の一般的な解剖エラーが鋤鼻神経の軸索は鋤鼻器（ 図3Aと図3B）の近くに中隔組織やAOB（ 図3Cおよび3D）の近くに損傷を受けることができる期間細かい解剖、中に生じる。これらと同様のイベントが使用できなく準備をレンダリングのVSNとAOB間の不完全な接続になります。

準備の成功への最終的な障害は、VNOカニューレ挿入ステップ（ステップ4.11）である。 VNOカニューレの適切な配置は、の即時追放を引き起こし、VNO内腔の加圧になります鋤鼻ポンプからの残留血液。カニューレは比較的透明鋤鼻上皮の下にはっきりと見えるはずですし、カニューレの外観は、VNOの内側の長さに沿って均一にする必要があります。手順が正常に完了すると、1は、VSNの匂い物質（ 図4）の既知の送信元とVNO刺激に応答した神経活動の一つの単位電気生理学的記録のような生理学的ア ​​ッセイを用いて機能の接続性を確認することができます。

ステップ3.22から5.4で使用されるカスタム解剖室の図1、A）設計図。注：小さな穴は、このプロトコルで使用される解剖室の所望のB）の例の写真のような溶液やガス発生の入口と出口に対応するために穿孔することができる。 m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

片側切断段階（ステップ3.20）の後、図2の成功の、A、B）の代表的な画像（A）と失敗した（B）の準備を。 VNO、中隔組織、および嗅球（OBS）は、すべて、この場合の同側半球（右（下）半球から維持されなければならない。鼻甲介は同側半球上に表示された場合は、解剖が失敗した。目盛りである離れて1ミリメートル。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

d/51813/51813fig3highres.jpg "幅=" 600 "/>
図3。A、B）の VNOとAOB間無傷で損傷を受けた中隔組織の代表的な画像。 Bでは、解剖用鉗子は、C、D）は 、VNの軸索管を損傷し、無傷で損傷を受けたのAOBを組織との不注意な接触をした。 Dでは、同側のOBを取り巻く硬膜の除去は内側AOB近い組織の可視ブロブを引き起こし、AOB近く鋤鼻神経を切断された。スケールバーの長さは1ミリメートルである。

成功した準備でAOBニューロン（細胞外シングル単位記録）から記録された活動電位の図4。a）実施例ラスタプロット。黒のショーでトレース制御リンゲル液を5秒間、VNOに配信されたとき、発火率の変化なし（グレーBOX）。赤のショーでのトレースは、BALB / c雌マウスの尿とVNO刺激に対する同ニューロンの応答は、リンゲル生理食塩水。Bで同じ応答の）ペリ刺激時間のヒストグラムに100倍に希釈した。エラーバーは平均の標準誤差を表す。

Discussion

このプロトコルで説明VNO-AOB ex vivoでの準備は、in vivo ^5-7急性ライブスライスAOB機能の¹⁷の実験で麻酔をするのに便利な代替手段です。また、電気生理学的および光学的記録のために回路素子を公開急性AOBスライス実験とは異なり、この準備は、すべての感覚求心性神経内およびAOBの接続を保持します。これはまた、in vivoでのアプローチで 、麻酔の言うことができますが、麻酔薬の存在は、必ずしもこれと他の嗅覚回路¹⁸における情報処理のために重要である神経機能、すなわち興奮性/抑制性のバランスを変化させる。製剤は、麻酔薬の使用を回避するので、AOBと表面が完全にsuperfusateに曝露しているので、ローカル神経処理中に薬​​理学的照会に適している。

この調製物のいくつかの制限は、もちろん、あります。 EVがある最も深いAOB層、多くの抑制性顆粒細胞^16を収容する内部細胞層の、すなわち深部の段階的な変性のidence。さらに、遠心入力はAOB機能の積極的な参加からそれらを排除し、解剖時に切断される。 VNOのカニューレ挿入は鋤鼻ポンプの正常な動作をバイパスし、VNO内腔に存在する内因性の液体を離れてフラッシュします。

この方法で成功を達成するための重要なステップは、繊細な片側切断（3.20ステップ）とVNOカニューレ挿入（ステップ4.11）である。一つは確実に機能的に接続されたex vivoでの製剤を製造するために大規模な練習を要求することを期待することができます。ここで利用される二次切開チャンバは、（例えば、希釈尿など）マウスフェロモンの源とVNOの刺激の間に単一の電極を使用して録音機能的結合を評価するために使用することができる。二解剖室^13,15の変形ができるBE準備は、多光子イメージングなど、他の目的に適した角度に回転することができ、その作った。

生きているAOBを研究する多くの技術的なハードルは、長い社会臭いやフェロモン感覚処理の我々の理解に対する障壁を提起している。この解剖プロトコルにおけるこの感覚経路の最も初期の神経成分を離れて切開することにより、これらの困難な研究回路への実験的なアクセスを得ることができる。私たちは、鋤鼻感覚処理¹⁹と、感覚のマッピング（ハーメンら 、未発表）への詳細なお問い合わせは、この準備を利用している。この技術は、AOB内の感覚処理に今後の研究、組織（ 例えば 、多光子イメージングと光遺伝学）への光アクセスを必要とする特にそれらのために有用であろう。このアプローチの利点は、生体内のアプローチのものを補完する、など鋤鼻媒介の神経機構を調査するための私たちのツールキットを改善金融および生殖行動。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight Scissors	Fine Science Tools	14002-14
Fine Scissors-Straight	Fine Science Tools	14060-10
Fine Scissors-Curved	Fine Science Tools	14061-10
Adson Forceps	Fine Science Tools	11006-12
#3 Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
#11 Scalpel Blades	Fisher Scientific	3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades	Fisher Scientific	12-640
35 mm Petri Dish	Fisher Scientific	08-772-21
Dissection Chamber	Custom	N/A	See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm	Custom	N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease	Fisher Scientific	146355D
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip	Fine Science Tools	11295-10
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08
1/16" Male Luer	Cole-Parmer	EW-45505-00
1/16" Tubing	Fisher Scientific	14-171-129
Two ton epoxy	Grainger	5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit	AutoMate Scientific	09-16
ValveLink digital/manual controller	AutoMate Scientific	01-18
NaCl	Sigma-Aldrich	various
KCl	Sigma-Aldrich	various
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	various
MgCl2 hexahydrate	Sigma-Aldrich	various
NaHCO3	Sigma-Aldrich	various
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	various
myo-inositol	Sigma-Aldrich	various
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	various
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	various
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	various
Glucose	Sigma-Aldrich	various