Summary
Musen tilbehør luktelappen (AOB) har vært vanskelig å studere i sammenheng med sensorisk koding. Her viser vi en disseksjon som produserer en ex vivo-preparat hvor AOB nevroner forbli funksjonelt koblet til deres perifere innganger, tilrettelegging forskning på informasjonsbehandling av mus feromoner og kairomones.
Abstract
Musen tilbehør luktsystemet (AOS) er et spesialisert sanse vei for å oppdage ikke-flyktige sosiale lukt, feromoner, og kairomones. Den første nevrale krets i AOS veien, kalt tilbehøret luktelappen (AOB), spiller en viktig rolle i å etablere kjønnstypisk atferd som territorial aggresjon og parring. Denne liten (<1 mm 3) krets besitter evnen til å skille unike atferds stater, for eksempel sex, press og stress fra chemosensory signaler i sekreter og ekskreter av conspecifics. Mens den kompakte organiseringen av dette systemet gir unike muligheter for opptak fra store deler av kretsen samtidig, undersøkelse av sensorisk prosessering i AOB er fortsatt utfordrende, hovedsakelig på grunn av sin eksperimentelt ufordelaktig plassering i hjernen. Her viser vi en flertrinns disseksjon som fjerner intakt AOB i én halvkule av fremre muse skallen, forlater kobleionene til både perifer vomeronasal sensoriske nevroner (VSNs) og lokale nevronale kretser intakt. Framgangsmåten utsetter AOB overflaten til direkte visuell inspeksjon, tilrettelegging elektrofysiologisk og optiske opptak fra AOB kretselementer i fravær av bedøvelse. Ved å sette inn en tynn kanyle inn VNO (VNO), som huser VSNs, kan man direkte utsett periferien til sosiale lukt og feromoner mens opptak nedstrøms aktivitet i AOB. Denne fremgangsmåten gjør at kontrollerte undersøkelser i AOS informasjonsbehandling, noe som kan kaste lys over mekanismene som knytter feromon eksponering mot endringer i atferd.
Introduction
Sensorisk prosessering i pattedyrhjernen typisk spenner over flere innbyrdes-forbundet neuronal kretser, hvor hver av disse trekker ut bestemte egenskaper fra sanseinntrykk. I sensoriske baner, er tidlig informasjonsbehandling avgjørende for normal oppfatning og adferd. I tilbehøret luktsystemet (AOS), er tilbehøret luktelappen (AOB) rektor nevrale krets knytte den sensoriske periferien til nedstrøms strukturer som styrer hormonbalansen 1,2, aggresjon tre, og opphisselse fire. Som sådan er informasjonsbehandling innenfor dette kretsen sterkt knyttet til forandringer i dyrs adferd.
Tilbehøret luktelappen ligger hos mus og rotter ved dorsal / hale / posterior aspekter av hovedluktelappen (MOB) under den tette, vascularized rhinal sinus. Den AOB mottar afferent innervasjon fra axons av perifer vomeronasal sensoriske nevroner (VSNs) som bor i VNO (VNO), en small blind-ended rør i fremre snute like over den bløte ganen. Disse axons traversere delikat ark av septal vev på den mediale grensen av nesegangene. Flere studier har undersøkt AOB nevrale responser til kilder av AOS lukt (for eksempel mus urin) in vivo ved hjelp av bedøvede mus 5-7 eller fritt-utforske dyr åtte. Den heroiske bedøvet in vivo studier som er involvert (a) tracheotomies for å sikre dyp anestesi og hindre aspirasjon av væske stimuli 5-7, (b) stimulering av det sympatiske cervical ganglion 6 eller direkte kanylering av vomeronasal organ 5,7 for å innføre ikke-flyktige lukt og (c) craniotomies med eller uten frontallappsfunksjoner ablations for å tillate elektroden avansement inn i AOB 6.. Awake / oppfører studier 8-10 involvert kirurgisk implantasjon av en Microdrive. I sum er disse eksperimentelle paradigmer er kraftige, men svært vanskelig og krever ofte anestesi.
(ex vivo) med en viss suksess 11-15. Fordi forbindelser mellom VNO og AOB forbli ipsilaterale, og fordi midtlinjen septal vev kan bli utsatt for oksygenrikt superfusate i en enkelt halvkule, forsøkte vi å utvikle en slik enkelt halvkule ex vivo tilnærming for å isolere disse strukturene og samtidig opprettholde sin funksjonelle tilkoblingsmuligheter. Vi har nylig lyktes i å oppnå dette målet 16. Dette preparatet holder både VNO og AOB levende og funksjonelt forbundet i minst 4-6 timer fordi begge axons (langs midtlinjen myk septal vev) og AOB er relativt grunt <600 mikrometer funksjoner som er tilgjengelige for superfuseres oksygenrikt kunstig cerebrospinalvæsken ( ACSF). Dette VNO-AOB ex vivo forberedelse gjør at innføring av kontrollerte stimuli inn i VNO via en tynn kanyle, ogdirekte visuell tilgang til den lille AOB for målrettet plassering av elektrodene og / eller levende fluorescens mikroskopi. Denne fremgangsmåten er fordelaktig hvis man ønsker å studere disse kretser i fravær av bedøvelse. Fordi denne tilnærmingen kutter sentrifugale tilkoblinger, er det ikke godt egnet til undersøkelser i sentrifugal modulering av AOB funksjon. VNO-AOB ex vivo forberedelse er vanskelig å lære, men når oppnådd produserer en pålitelig plattform hvorpå å undersøke krets organisasjon, informasjonsbehandling, og nevrale plastisitet i denne kraftige sanse krets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøk ble utført i henhold til protokollene som er godkjent av Institutional UT South Animal Care and bruk Committee, og ble valgt for å minimalisere stress, ubehag og smerte som oppleves av de eksperimentelle dyr.
En. Dissection Chamber
En tilpasset disseksjon kammer og liten, tynn plast planke er nødvendig for best resultat (figur 1). Konstruer eller få et slikt kammer i forkant av prøver denne protokollen.
2. Disseksjonsverktøyer Solutions
- Tilbered en L av standard kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for bruk i trinn 3,22 til 5,4. Legg NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl 2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 25 mM, NaH 2 PO 4 1.25 mM, myo-inositol 3 mM natrium pyruvat 2 mM, natriumaskorbat 0,4 mM, og glukose 25 mM til 1 liter pyrogenfritt vann.
- Forbered den første disseksjon ACSF (200 ml) forbruker i trinn 03.03 til 03.22. Ta 200 ml Standard ACSF og heve MgCl 2 konsentrasjonen av 9 mm ved å legge til 0,366 g MgCl 2 hexahydrat.
- Forbered standard Ringers oppløsning for å bære stimuli til VNO gjennom kanylen for bruk i trinn 4,11 til 5,4 inneholdende NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM MgCl2, 2 mM, NaHCO3 25 mM, HEPES 10 mM, glukose 10 mM.
- Boble den 0,8 L av standard ACSF og 0,5 L av Ringers med 95% O-2, 5% CO 2-gass i et 37 ° C vannbad i minst 15 min før bruk.
- Boble de 200 ml initial disseksjon ACSF med 95% O-2, 5% CO2 gass på is i 15-20 minutter inntil det når 4 ° C.
Tre. Primær Dissection
- Klargjør disseksjon området. Plasser tre 35 mm petriskåler, oksygenrikt ACSF, halshogging saks, buede dissekere saks, rett dissekere saks, Adson tang, en # 11 skalpel blad og håndtak og et barberblad på is.
- Etter oksygenrikt ACSF er nedkjølt til 4 ° C, dypt bedøve dyret i en uttørking kammer ved hjelp av 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluorane). Utfør hale og fot klype tester for å sikre at dyret er dypt bedøvet.
- Når dyp anestesi er bekreftet, decapitate dyret og umiddelbart plassere et innlegg i en petriskål fylt med den kjølte disseksjon ACSF. MERK: Fordyp vevet i kjølt disseksjon ACSF å holde den kjølig gjennom hele prosedyren når den ikke er i bruk.
- Fjern den nedre del (ventral svelg, underkjeven, og tunge) med en buet saks.
- Bruke Adson tang deglove (skall) overfladiske hud og muskel vedlegg fra skallen. Skrell skalp fra hale til rostral inntil eneste stedet av vedlegget er over fortennene. Kutt vevet på festepunktet ved hjelp av en buet saks. Fjern øynene ved å gripe den med pinsett og dra den bort fra forberedelse. Nøre enden av degloving fremgangsmåte, unngår overskytende kraft på den skjøre nese brusk ved å bruke Adson tang til frie muskel vedlegg fra den øvre kjeve bein. MERK: Ta av hodebunnen fra hale aspektet av skallen med rette saks.
- Med de rette saks, klippe ned midtlinjen av skallen fra hale til rostral inntil sakse tips er noen mm inn i frontal bein (like før den rhinal sinus).
- Fjern parietal og frontale bein av skallen hjelp Adson tang. MERK: Deler av frontal bein vil ofte være festet til nasal bein caudal til rhinal sinus. Fjern disse brikkene med omtanke for ikke å kontakte olfactory pærer.
- Bruk skalpell til å lage en koronale kutt gjennom frontallappen 2 mm caudal til bihulene og deretter fjerne hjernen caudal til kuttet. Sørg tuppen av skalpell kontakter den benete kontur av ventral skallen å fullstendig kutte posterior vev. MERK: Dette gjør det muligfjerning av flertallet av hjernen uten å sette mekanisk stress på side olfactory traktater eller olfactory pærer.
- Fjern de utsatte caudal aspekter av ventral skallen med rette saks. La bihulene og rester nervevev.
- Fjern kinnbuen og ansiktsmusklene på den anatomiske høyre side av skallen å bruke rette saks
- Snu snute løpet (ventral side opp) for å avsløre taket av munnen.
- Kutte og fjerne ganen umiddelbart caudal til fortennene. Gjør dette ved å stikke spissen av skalpell blad under ganen parallelt med taket av munnen og deretter flytte bladet mot fortennene.
- Ta tak i frigjort (rostral) kanten av ganen med Adson pinsett og fjerne ved å trekke caudally.
- På den anatomiske venstre side av hodeskallen, bruke skalpell blad å utvide Palatine foramen caudally, fra de små foramen nærheten jekslene. Oppnå dette ved å stikke spissen av skalpell blautelatt inn i tomrommet nær jekslene og rotere håndleddet. MERK: Vær ekstremt forsiktig å bare bruke tuppen av bladet - et dypt kutt kan skade septal vev.
- Ved hjelp av tuppen av skalpell blad, kuttet fra Palatine foramen gjennom fortenner, som starter rostral til anatomiske venstre vomeronasal organ. Bruk flere scorings kutt. Ikke skad septal vev og vomeronasal nerver ved å sette kniven for dypt.
- Slå vevet slik at rygg skallen vender opp og deretter orientere rett barberblad vertikalt (parallelt med midtlinjen) på hale kanten av preparatet.
- På den ventrale kant av vevet, berører skjærekanten av knivbladet umiddelbart til venstre for midtlinjen. Rist bladet og bevege seg langs venstre Palatine foramen (kutte region innført i trinn 3.14).
- Ved ryggkanten av vev, plassere skjærekanten av kniv umiddelbart til venstre for midtlinjen (mindre enn 1 mm).
- Keepingskiven er parallell med midtlinjen, rock barberblad langsomt med press mot det fremre av vevet. Legg merke til motstanden ved cribriform plate. Stopp umiddelbart etter å bryte gjennom denne motstanden. MERK: På dette punktet, er den høyre hjernehalvdelen løsnet fra venstre halvkule. Den eneste gjenværende forbindelsen er mellom halvkuler langs rygg snute anterior til cribriform plate.
- Separer halvkuler ved å gripe dem nær hale sider med hansker på hendene og forsiktig rotere dem sidelengs og anteriorly. MERK: Dette trinnet er en kilde til eksperimentell variasjon, spesielt i mus med merkelig eller sprø snuter (f.eks eldre mus). Også, mens du forsøker å rotere halvkulene vekk fra hverandre, hvis sterk motstand merkes scorer dorsal snute (anterior til cribriform plate) for å svekke bindevev. Mens du gjør det, ta ekstrem forsiktighet for ikke å sette inn skalpell dypt, noe som kan skade septal tissue og vomeronasal nerver.
- Påfør en liten mengde (50-100 mL) av vev lim til planken og forsiktig plasserer den laterale kanten av den høyre hjernehalvdelen på limet ved hjelp av Adson tang. Fjerne overskudd av fuktighet fra den laterale side av preparatet ved hjelp av et papirhåndkle for å forhindre for tidlig polymerisasjon lim og løs adhesjon til planken. MERK: Bruk noen få dråper av den kjølte disseksjon ACSF på prøven for å akselerere polymerisasjonen limet etter at vevet er plassert på limet. Dette sikrer at vevet forblir tett holdt mot planken.
- Plasser en liten mengde (3-5 mm diameter, 2 mm dype) i vakuumfett i midten av den sekundære disseksjon kammeret og plassere den side av planken på motsatt side av vevet fast mot fett. Umiddelbart fylle disseksjon kammer med kjølt disseksjon ACSF, overføre til den fine disseksjon området og begynne perfusjon med oksygenrikt standard ACSF. Orientere planken slik at luktelappen er direkte istrøm av friskt og oksygenrikt standard ACSF.
4. Sekundær Dissection
- Fjern eventuelle synlige kontralaterale (til venstre) luktelappen eller kortikale vev fra utarbeidelse hjelp fin pinsett. Knip sammen de fine tang (som danner et semi sløv punkt), og deretter plassere den på rygg-og hale del av vevet nær midtlinjen. Forsiktig kjøre klemt tang langs midtlinjen, peeling vevet bort fra den høyre hjernehalvdelen sakte i fremre bevegelse. Fjern alle de kontralaterale vev, inklusive det kontralaterale olfactory bulb vev. Ta ekstrem forsiktighet for ikke å stikke gjennom vevet, noe som kan føre til skade på AOB eller Vomeronasale nerve.
- Observer den hvite dura mater langs rygg / mediale overflaten av luktelappen. Riv denne dura mater langs rygg / hale kanten av luktelappen ved å ta tak i den hviteste delen av dura med to par fin pinsett og dra dem bort fra det punktet. Dura er tettpakket rundt olfactory pærer, og kan lett selv skjære gjennom vev mens den blir fjernet. Unngå skade på den mediale overflate av luktelappen og AOB selv. MERK: Hvis dura motstår rive lett på dette punktet, introdusere et lite kutt med fine våren tip disseksjon saks for å lette separasjon.
- Sakte og forsiktig skrelle bort frontal cortex med fine tang uten å skade de underliggende olfactory pærer. Observere en samling av blodårer som vises som en semi-transparent netto umiddelbart caudal til AOB. Fjern dette nettet med fin pinsett til rette elektroden penetrasjon i elektrofysiologiske eksperimenter. Ta tak i nettet med tang som det skiller fra AOB under frontal cortex tilbaketrekking og fjerne den ved å trekke caudally og medialt, være forsiktig med å berøre AOB. Når frontal cortex har blitt skilt fra olfactory pærer, fjerner du det ved å kutte med tang ventral og bakre til AOB. MERK: Ta extreme omsorg med netto fjerning, for hvis det er gjort altfor grovt glomerulær laget kan bli skadet.
- I den eksponerte kontralaterale nesehulen, fjerne eventuelle gjenværende kontralateral septal vev (spinkel gulaktig ark som inneholder blodkar) ved hjelp av fine tang. Ta tak i vev ved hale / rygg-området (nær septal bein) og deretter trekke / løfte vev mot fremre side. MERK: contralateral septal vev kan være utilsiktet fjernet under hemisection trinn (trinn 3.20). I et slikt tilfelle, observere en hvit, avascular septal brusk og litt gjennomsiktig, vaskularisert septal bein. Hvis dette er tilfelle, kan Trinn 4,4 hoppes.
- Fjerne den kontralaterale VNO nøye ved å kjøre et enkelt punkt av de fine tang mellom septal brusk og VNO "vinge" (et tynt stykke beinvevet som går langs rygg kanten av både VNOs.
- Etter vingen løsrivelse fra brusk, flytte tuppen av tang ventrallyinn i kontralaterale VNO nær midtlinjen. Gjenta dette trinnet på flere steder langs rostral / kaudal aksen av kontralaterale VNO å løsne den, slik at den kan fjernes ved å ta tak med tang og løfte bort.
- Forbered deg på å fjerne septal brusk ved å gjøre et kutt på ventral / hale kanten (der det smalner til en hvit avascular stripe som går langs ventral kanten av septal bein) med fin pinsett.
- Ta av septal brusk ved å knipe sammen de fine tang for å gjøre en semi sløv punkt. Identifiser snitt i trinn 4.6, setter de klemt tang bak (lateral) at kutt, og deretter sakte løfter brusk bort fra septal vev og fortsetter rostrally. MERK: Ikke forstyrre den underliggende septal vev. Som brusken er løftet, observere den underliggende ark med septal vev strekningen på grunn av løse voksn til brusk. Et periodisk, milde, og stabil bevegelse av klemt fine tang langs dette området av løs endhesion kan i stor grad lette vellykket separering av de to strukturer.
- Bruk et par # 3 tang med en bøyd spiss å fjerne septal bein. Approach septal ben i en vinkel tilnærmet parallell med planet til den septale benet. Sett den buede tine mellom septal vev og septal bein. Ta tak i beinet med tang og forsiktig bevege benet frem og tilbake før den sprekker nær cribriform plate. MERK: I enkelte tilfeller vil septal bein motstå bryte nær cribriform plate. I dette tilfellet bruker fin pinsett til forsiktig å score det septal bein langs dorsal / ventral aksen bare anterior til cribriform plate, og deretter gjenta trinn 4.8.
- Fjern det hvite brusk kun rostral til VNO ved å klemme med ett par fin pinsett ved inngangen og trekke rostrally med et annet par av fin pinsett.
- Fest polyimid kanyle til en fast enhet perfusjon og starte strømmen av Ringers oppløsning (0,1-0,3 ml / min) gjennom polyimid kanyle.MERK: Målt mengde med en in-line, lite volum strømningsmåler. Bruk av datastyrte pneumatisk stimulans koblingsenhet reduserer flyten endringer under stimulering. Sammenligne nevrale responser å teste stimuli med svar på en mock stimulus (kontrollere Ringers oppløsning) for å sikre svar er stimulans bestemt.
- Orienter kanylen parallelt med VNO inngang. Når kanylen er tilfredsstillende parallelt med VNO inngang, se som utløpstrykket bevirker at VNO å «blåse», som fører til evakuering av blodkaret. Umiddelbart sette kanylen inn i VNO, holde vinkelen av kanylen konstant, slik at den forblir parallell med VNO åpning. NB: Det kan være nyttig for å holde kanylen med ett par av fin pinsett mot plast planke og bruke et annet par av fin pinsett til vinkelen enden av kanylen svakt oppover. Hvis man ved en feiltakelse legger kanylen bak VNO, kan utstrømningen også føre til at VNO blodåreå evakuere, som fører til en riktig inntrykk kanylering ble utført. Riktig plassering kan bekreftes ved å innlemme et fargestoff i Ringer-løsning. Når kanylen er riktig plassert, bør fargestoffet bare avslutte via VNO inngangen. I tillegg kan man bekrefte korrekt plassering ved å sikre at kanylen er lett synlig gjennom den semi-transparent mediale aspektet av VNO.
- Flytt plast planke langsomt til AOB er i direkte flyten av standard ACSF, være forsiktig med å fjerne kanylen fra VNO. Disseksjon er komplett og vurdering av fysiologisk funksjon kan starte umiddelbart. Trinn 5 kort beskriver en tilnærming for å gjøre en slik vurdering.
5. Evaluering
- Trenge inn i overflaten av AOB med 2-4 MΩ borsilikatglass microelectrode festet til et ekstracellulært forsterker og oscilloskop.
- Sakte videre mikroelektroden til en dybde på 100 til 200 mikrometer fraoverflaten med en hastighet på 50 mikron / min. MERK: På dette vevet dybde, vil man støte på sporadiske spontan handling potensielle bølgeformer eksemplifisert ved skarpe, korte (~ 1-2 msek) nedbøyninger i microelectrode spenning.
- Når man møter på et aksjonspotensial bølgeform, slutte å fremme microelectrode.
- Observere og / eller ta opp handlingen potensielle hastighet når du skifter stimulans levering løsning fra kontroll Ringer til en kjent aktivator av VSN aktivitet (f.eks, Ringers løsning som inneholder 50 mM KCl). Hvis disseksjonen var vellykket, kan en stimulus-avhengig endring i aksjonspotensial sats eller lokale feltet potensial holdes. MERK: Ikke alle AOB nevroner vil svare på enhver stimulus med en økning i skuddtakt (inkludert Ringers løsning som inneholder 50 mM KCl). En stimulus avhengig reduksjon i skuddtakt indikerer også funksjonelle tilkoblingsmuligheter og en vellykket disseksjon. I det tilfelle at to eller flere neuroner som er oppstått somresponderer ikke på VNO stimulering, eller hvis ingen aksjonspotensialer er observert etter flere elektrode gjennomføringer, tyder dette på en mislykket disseksjon. Hvis dette er tilfelle, kan en ny disseksjon initieres på Trinn 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oppnå suksess med dette preparatet tar omfattende praksis, og har flere trinn der det kan mislykkes. Man bør forvente å kreve mange forsøk før oppnå suksess. Skikken disseksjon kammeret er nødvendig for en vellykket gjennomføring av denne protokollen, og bør tas før du starter de senere stadier av disseksjon. Kammeret utformingen vist i figur 1 er tilstrekkelig for dette formål, og kan være laget av forholdsvis billig plast med minimal bearbeiding krav. Hvis man ikke har kapasitet til å produsere et slikt kammer, kan lokale eller online maskineringsbedriftene tas med på råd, og kan konstruere kammeret for et gebyr.
En stor kilde til variasjon på tvers av forberedelsene er tettheten og skjørhet av bein i skallen og snuten av forsøksdyr. Under hemisection trinn (trinn 3.14 til 3.20), er målet å isolere både vomeronasal organer sammen med ipsilaterale septal vev ogipsilaterale tilbehør luktelappen. Det er imidlertid ikke uvanlig at septal vevet til å forbli festet til den kontralaterale hemisfære, særlig i nærheten av festepunkter til de dorsale ben snuten. Figur 2 viser et eksempel på en effektiv og lite effektiv hemisection.
Andre vanlige disseksjon feil oppstår i løpet av fint disseksjon, hvorunder axoner av vomeronasal nerve kan skades i septal vevet nær vomeronasal organ (figurene 3A og 3B) eller nær AOB (figurene 3C og 3D). Disse og lignende hendelser vil resultere i ufullstendige tilkobling mellom VSNs og AOB, rende forberedelsene ubrukelig.
Den siste hindringen til utarbeidelse suksess er VNO cannulation trinn (trinn 4.11). Riktig plassering av VNO kanylen vil resultere i trykksetting av VNO lumen, forårsaker umiddelbar frigivelse av gjenværende blod fra vomeronasal pumpen. Kanylen bør være godt synlig under forholdsvis transparent vomeronasal epitel og utseendet av kanylen skal være jevn langs dens lengde inne i VNO. Etter vellykket gjennomføring av prosedyren, kan man kontrollere funksjonell tilkobling ved hjelp av en fysiologisk analyse som enkelt enhet elektrofysiologiske opptak av nevral aktivitet i respons til VNO stimulering med en kjent kilde til VSN odorants (figur 4).
Figur 1. A) Tekniske tegninger av den egendefinerte disseksjon kammer brukes i trinn 03.22 til 05.04. MERK: Små hull kan bores for å imøtekomme løsning og gassing og utløp som ønsket B) Eksempel fotografi av disseksjon kammer som brukes i denne protokollen.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. A, B) Representative bilder av vellykket (A) og mislykkede (B) preparater etter hemisection trinnet (trinn 3.20). VNO, septal vev, og olfactory pærer (OBS) må alle bli opprettholdt fra ipsilaterale hemisfære (i dette tilfellet, den høyre (nederst) halvkule. Hvis nesemusling er synlige på ipsilaterale halvkule, har disseksjon mislyktes. Kryss merker er 1 mm fra hverandre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
d/51813/51813fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 3.. A, B) Representative bilder av intakt og skadet septal vev mellom VNO og AOB. I B, dissekere tang gjort utilsiktet kontakt med vev, skade VN axon traktater. C, D) intakt og skadet AOBs. I D, fjerning av dura rundt ipsilaterale OB resulterte i severing vomeronasal nerve nær AOB, forårsaker en synlig blob av vev nær mediale AOB. Scale barer er en mm i lengde.
Figur 4. A) Eksempel raster tomt på aksjonspotensialer tatt opp fra en AOB nevron (ekstracellulære enkelt enhet opptak) i en vellykket utarbeidelse. Spor i svart viser ingen endring i avfyring sats når kontroll Ringer løsning ble levert til VNO for 5 sek (grå box). Spor i rødt viser responsen av den samme nervecelle til VNO stimulering med BALB / c hunnmus urin fortynnet 100-fold i Ringers saltvann. B) Peri-stimulus tid histogram av de samme responser i A. Feil søylene representerer standardfeil til gjennomsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VNO-AOB ex vivo forberedelse beskrevet i denne protokollen er et nyttig alternativ til bedøvet in vivo 5-7 og akutt levende skive 17 eksperimenter av AOB funksjon. I motsetning til akutte AOB slice eksperimenter, som også utsetter kretselementer for elektrofysiologiske og optiske opptak, beholder dette preparatet alle sensoriske afferenter og intra-AOB tilkoblinger. Selv om dette kan også sies om bedøvet in vivo tilnærminger, tilstedeværelse av bedøvelse nødvendigvis endrer nevrale funksjon, nemlig stimulerende / hemmende balanse, noe som er avgjørende for informasjonsbehandling i denne og andre lukte kretser 18. Fordi fremstillingen unngår bruk av bedøvelse, og fordi AOB flaten er fullstendig eksponert for superfusate, er det mottagelig for farmakologiske undersøkelser av lokal neural prosessering.
Det er naturligvis noen begrensninger for dette preparatet. Det er evidence for gradvis degenerering av de dypeste AOB lag, nemlig de dype deler av den interne cellelag, som huser mange hemmende granule celler 16. I tillegg er sentrifugal innganger kuttet under disseksjon, eliminere dem fra aktiv deltakelse i AOB funksjon. Kanylering av VNO går utenom den normale virkning av vomeronasal pumpe, og skyller bort de endogene fluider som finnes i VNO lumen.
Kritiske skritt for å oppnå suksess med denne metoden er den delikate hemisection (Step 3.20) og VNO cannulation (trinn 4.11). Man kan forvente å kreve omfattende praksis å pålitelig produsere funksjonelt-tilkoblede ex vivo forberedelser. Den sekundære disseksjon kammer utnyttes her kan brukes til å vurdere funksjonelle tilkobling ved hjelp av enkelt-elektrode-opptak under stimulering av VNO med kilder til mus feromoner (for eksempel fortynnet urin). 13,15 Modifikasjoner av den sekundære disseksjon kammeret kan be tatt som tillater preparatet som roteres for å vinkler egnet for andre formål, for eksempel multiphoton avbildning.
De mange tekniske hindringer for å studere levende AOB har lenge vært en barriere for vår forståelse av sosial lukt og feromon sensorisk prosessering. Ved å dissekere bort de tidligste nevrale komponentene i dette sanse veien i denne disseksjon protokollen, er man i stand til å få eksperimentell tilgang til disse er vanskelige å studere kretser. Vi har benyttet dette preparatet for detaljerte undersøkelser i Vomeronasale sensorisk prosessering 19 og sensoriske kartlegging (Hammen et al., Upublisert). Denne teknikken vil være nyttig for fremtidige studier i sensorisk prosessering i AOB, spesielt de som krever optisk tilgang til vev (f.eks, multiphoton bildebehandling og optogenetics). Fordelene med denne tilnærmingen utfyller de av in vivo tilnærminger, og forbedre vår verktøykasse for å undersøke nevrale mekanismer for Vomeronasale-mediert såelle og reproduktive atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen vesentlige interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av R00 DC011780 (JPM: ninds, NIH), F30 DC011673 (GFH: ninds, NIH) og UT South oppstart midler (JPM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Figure 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
