Summary
Мышь аксессуар обонятельная луковица (АОВ) было трудно изучать в контексте сенсорной кодирования. Здесь мы демонстрируем рассечение, который производит Экс Vivo препарат, в котором AOB нейроны остаются функционально связан с их периферийных входов, содействия научным исследованиям в обработке информации феромонов мыши и kairomones.
Abstract
Мышь аксессуар обонятельная система (АОС) является специализированным сенсорная тропа для обнаружения энергонезависимые социальные запахи, феромоны и kairomones. Первый нейронной цепи в пути AOS, называется аксессуар обонятельная луковица (АОВ), играет важную роль в установлении секс-типичный поведения, такие как территориальной агрессии и спаривания. Этот небольшой (<1 мм 3) схема обладает способностью различать уникальные поведенческие состояния, такие как секс, процедить, и стресс от хемосенсорных киев в выделениями и экскрементами из сородичей. В то время как компактный организация этой системы представляет уникальные возможности для записи с большими участками цепи одновременно, исследование сенсорной обработки в АОБ остается сложной, во многом благодаря его экспериментально невыгодное расположение в мозгу. Здесь мы демонстрируем многоступенчатую рассечение, которое удаляет нетронутыми AOB в пределах одного полушария переднего черепа мыши, оставляя подключенияионы в обеих периферической вомероназальных сенсорных нейронов (VSNs) и местного нейронной цепи нетронутыми. Процедура предоставляет поверхность AOB направить визуальный осмотр, облегчая электрофизиологических и оптические записи из элементов АОБ цепи в отсутствие анестетиков. После вставки тонкий канюли в вомероназального органа (ВНО), в котором находится VSNs, можно непосредственно подвергать периферию к социальным запахов и феромонов время записи вниз по течению активность в АОБ. Эта процедура позволяет контролируемых расследований AOS обработки информации, которые могут пролить свет на механизмы, связывающие феромона рисков в случае изменения поведения.
Introduction
Сенсорная обработка в мозге млекопитающих обычно занимает несколько взаимно соединенных-нейрональные цепи, каждая из которых извлекает особенности от сенсорного ввода. В сенсорных путей, рано обработки информации является жизненно важным для нормального восприятия и поведения. В принадлежностей обонятельной системы (AOS), аксессуар обонятельная луковица (АОВ) является основным нейронной цепи увязки сенсорную периферию для последующих структур, которые диктуют гормональный баланс 1,2, агрессию 3 и возбуждение 4. Таким образом, обработка информации в рамках этой схемы, тесно связана с изменениями в поведении животных.
Аксессуар обонятельная луковица находится у мышей и крыс в спинной / хвостовой / задней поверхности основного обонятельной луковице (MOB) под плотным, васкуляризации носовой пазухи. АОВ получает афферентный иннервации от аксонов периферических вомероназальных сенсорных нейронов (VSNs), которые находятся в вомероназального органа (ВНО), маленькийл слепой состава трубки в передней морды чуть выше мягкого неба. Эти аксоны пересекают тонкий лист перегородки ткани на медиальной границе носовые проходы. Несколько исследований исследовали AOB нервные реакции к источникам AOS запахов (например, мыши мочи) в естественных условиях с использованием анестезированных мышей 5-7 или свободно-исследуя животных 8. Героическая наркозом в естественных условиях исследования, участвующих (а) tracheotomies для обеспечения глубокого наркоза и предотвращения аспирации жидкости стимулов 5-7, (б) стимуляции симпатической шейного ганглия 6 или прямой катетеризации вомероназального органа 5,7 ввести энергонезависимые запахи и (с) краниотомии с или без лобных абляции лепестков, чтобы электрода продвижение в АОБ 6. Пробудитесь / себя исследования 8-10 участвующие хирургической имплантации микродисков. В целом, эти экспериментальные парадигмы являются мощным, но крайне сложно и часто требует анестезии.
(экс естественных условиях) с некоторым успехом 11-15. Поскольку связи между ВНО и АОБ остаются на той же стороне, и потому, что по средней линии перегородки ткань может подвергаться воздействию кислородом superfusate в одном полушарии, мы стремились разработать такую одного полушария Экс Vivo подход, чтобы изолировать эти структуры при сохранении их функциональную связь. Недавно мы преуспели в достижении этой цели 16. Этот препарат сохраняет обе VNO и АОВ в живых и функционально соединен, по крайней мере 4 - 6 ч, так как оба аксоны (вдоль средней линии мягкой ткани перегородки АОВ) и сравнительно мелкой <600 мкм особенности, которые доступны для орошали кислородом искусственную спинномозговую жидкость ( ACSF). Это ВНО-АОВ экс естественных подготовка позволяет введение контролируемой стимулы в ВНО через тонкий катетер, ипрямого визуального доступа к небольшой АОБ для целенаправленной размещения электродов и / или живой флуоресцентной микроскопии. Этот способ является предпочтительным, если кто-то желает изучать эти схемы в отсутствие анестезии. Поскольку такой подход разрывает центробежные связи, он не очень хорошо подходит для расследований центробежной модуляции функции АОБ. ВНО-АОВ экс естественных подготовка трудно учиться, но как только достигнут производит надежную платформу, на которой по расследованию организации цепи, обработки информации и нейронной пластичности в этой мощной сенсорной цепи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Юго-Западного институционального комитета UT уходу и использованию животных на, и были выбраны таким образом, чтобы свести к минимуму стресс, дискомфорт и боли, испытываемой экспериментальных животных.
1. Вскрытие палата
Пользовательский рассечение камера и небольшой, тонкий пластик доска необходимы для достижения наилучших результатов (рис. 1). Построить или получить такую камеру заранее пытается этот протокол.
2. Препарирование Решения
- Подготовка 1 л стандартной искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) для использования в шагах 3.22-5.4. Добавить NaCl 125 мм, KCl 2,5 мм, CaCl 2 2 мм, MgCl 2 1 мм, NaHCO 3 25 мм, NaH 2 PO 4 1,25 мм, мио-инозитол 3 мм, пируват натрия 2 мм, аскорбат натрия 0,4 мм, и глюкозы 25 мМ до 1 л пирогенов воды.
- Подготовка начальное рассечение ACSF (200 мл) в течениеиспользовать в шагах 3.3-3.22. Возьмите 200 мл Standard ACSF и повысить концентрацию MgCl 2 по 9 мм, добавив 0,366 г MgCl 2 гексагидратом.
- Приготовьте раствор стандартного Рингера нести стимулы к ВНО через канюли для использования на этапах 4.11-5.4 содержащей NaCl 115 мм, KCl, 5 мм, CaCl 2, 2 мм, MgCl 2, 2 мм, NaHCO 3 25 мм, HEPES 10 мм, глюкоза 10 мм.
- Пузырь 0.8 л стандартной ACSF и 0,5 л Рингера с 95% О 2, 5% СО 2 газа в бане 37 ° С на водяной течение как минимум 15 мин до использования.
- Пузырь в 200 мл исходной рассечение ACSF с 95% O 2, 5% СО 2 газ на льду в течение 15-20 мин, пока не достигнет 4 ° С.
3. Первичная Рассечение
- Подготовьте область рассечение. Поместите три блюда 35 мм Петри, кислородом ACSF, обезглавливающий ножницы, изогнутые рассекает ножницы, прямые рассечения ножницы, Adson щипцы, с # 11 головыэль лезвие и ручка и лезвие на льду.
- После кислородом ACSF остынет до 4 ° С, глубоко обезболить животное в высыхания камеры, используя 2-5 мл Isothesia (99,9% изофлуораном). Выполните хвост и ноги тесты прижимные для обеспечения животное глубоко под наркозом.
- После того, как глубоко анестезия подтвердил, обезглавить животное и немедленно поместить голову в чашке Петри, заполненной охлажденной рассечение ACSF. ПРИМЕЧАНИЕ: Погрузите ткань в охлажденной рассечение ACSF чтобы держать его прохладным на протяжении всей процедуры, когда он не используется.
- Снимите нижнюю аспект (вентральной глотки, нижней челюсти и языка) с изогнутыми ножницами.
- Использование Adson щипцов deglove (корки) поверхностную кожу и мышечные вложения из черепа. Пил кожу головы от хвостового чтобы ростральнее пока единственный месте прикрепления не закончится передних зубов. Разрежьте ткань в точке крепления с помощью изогнутой ножницы. Удалить глаза, держа его пинцетом и вытащить его от подготовки. Nухо конец скальпирующий процедуры избежать избыточного усилие на деликатной носового хряща с помощью щипцов Adson к свободным вложений мускулатуры из верхних челюстных костей. ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите кожу головы от каудальной части черепа с прямыми ножницами.
- С прямыми ножницами, сократить среднюю линию черепа из каудальнее ростральнее пока кончики ножницами не несколько миллиметров в лобных костей (только до начала носовой пазухи).
- Снимите теменной и лобной кости черепа, используя Adson щипцов. ПРИМЕЧАНИЕ: Кусочки лобной кости часто остаются прикрепленными к носовых костей хвостовых к носовой пазухи. Удалить эти куски с осторожностью, принятые не связываться обонятельные луковицы.
- Используйте скальпель, чтобы сделать корональной разрез через лобной доли 2 мм каудально пазух, а затем удалить хвостового мозга, чтобы разреза. Убедитесь, что кончик скальпеля контактов костлявая контурных вентральной черепа, чтобы полностью разорвать заднюю ткани. ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяетудаление большинства мозга, не подвергая механической нагрузки на боковых обонятельных путей или обонятельных луковиц.
- Удалить открытые каудальные аспекты брюшной черепа с прямыми ножницами. Оставьте пазух и оставшиеся нервную ткань.
- Удалить скуловой дуги и мышцы лица на анатомической правой стороне черепа, используя прямые ножницы
- Поверните морду над (вентральной стороной вверх), чтобы выставить на крышу рта.
- Отрежьте неба сразу каудальнее резцов. Сделайте это, вставив кончик лезвие скальпеля под неба параллельно крыше рот, а затем перейти лезвие к резцов.
- Возьмитесь за освобождения (ростральной) край небе с Adson пинцетом и удалить, потянув каудально.
- На анатомической левой стороне черепа, используйте лезвие скальпеля расширить небные отверстия каудально, начиная от небольших отверстия вблизи коренных зубов. Достижение это, вставив кончик скальпеля бладе в пустоту возле моляров и поворачивать запястье руки. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, чтобы использовать только кончик лезвия - глубокий вырез может повредить перегородки ткани.
- Использование кончик лезвие скальпеля, вырезанные из небных отверстия через резцов, начиная ростральнее анатомической левой вомероназального органа. Использование нескольких сокращений скоринга. Не повредите перегородки ткани и вомероназальных нервы, вставив лезвие слишком глубоко.
- Поверните ткань так спинной череп стороной вверх, а затем ориентировать прямой лезвие вертикально (параллельно к средней линии) на хвостовом краю подготовки.
- В брюшного края ткани, прикоснуться режущую кромку лезвия бритвы сразу слева от средней линии. Осторожно покачайте лезвие и двигаться вдоль левого небных отверстия (вырезать область, введенный в шаге 3.14).
- В спинном краю ткани, поместить режущую кромку бритвы непосредственно слева от средней линии (менее 1 мм).
- Хранениелезвие параллельно средней линии, раскачивать лезвие медленно с давлением по направлению к передней части ткани. Обратите внимание, сопротивление на решетчатой пластине. Немедленно прекратите после пробития этого сопротивления. Примечание: В этой точке, правое полушарие ослаблен от левого полушария. Единственный оставшийся связь между полушариями вдоль спинной рыла передней к решетчатой пластине.
- Отделите полушария, держа их рядом каудальных сторон в перчатках пальцы и осторожно вращая их в стороны и вперед. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является источником экспериментальной изменчивости, особенно у мышей с наклонных или хрупких мордами (например, старые мыши). Кроме того, при попытке повернуть полушария друг от друга, если сильное сопротивление встречается забить спинной морду (переднюю к решетчатой пластине), чтобы ослабить соединительной ткани. Делая это, принять крайнюю осторожность, чтобы не вставить скальпель глубоко, что может привести к повреждению перегородки тиСГУП и вомероназальные нервы.
- Нанесите небольшое количество (50-100 мкл) ткани клеем к доске и аккуратно разместить боковой край правого полушария на клей с помощью щипцов Adson. Удаление избытка влаги с боковой стороны препарата, используя бумажное полотенце, чтобы предотвратить преждевременное клей полимеризации и свободную адгезию к доске. ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите несколько капель охлажденной рассечение ACSF на образец для ускорения клей полимеризации после ткани помещают на клей. Это гарантирует, что ткань остается плотно, удерживаемые до доски.
- Поместите небольшое количество (диаметр 3-5 мм, глубокий 2 мм) вакуумной смазки в середине вторичного вскрытия камеры и поместить на сторону доски напротив ткани прочно против смазки. Сразу заполнить рассечение камеру с охлажденной рассечение ACSF, трансфер в тонкой области рассечение и начать перфузии с кислородом стандартной ACSF. Расположите доску таким образом, чтобы обонятельная луковица находится непосредственно впоток недавно окисленной стандартной ACSF.
4. Вторичный Рассечение
- Удалите все видимые контралатеральный (слева) обонятельной луковицы или ткани коры от подготовки с использованием тонких щипцов. Зажмите вместе тонкий пинцет (образующие полу тупой точку), а затем поместить его в спинной и хвостовой части ткани вблизи средней линии. Аккуратно запустить ущипнул щипцы вдоль средней линии, пилинг ткани от правого полушария медленно в движении передней. Удалите все противоположной ткани, в том числе противоположной обонятельной луковицы ткани. Проявляйте особую осторожность, чтобы не ударить через ткань, которая может привести к повреждению АОБ или вомероназального нерва.
- Соблюдайте белый твердую мозговую оболочку вдоль спинной / медиальной поверхности обонятельной луковице. Снести этот твердую мозговую оболочку вдоль спинной / хвостового края обонятельной луковице, держа в белоснежной части твердой мозговой оболочки с двумя парами тонких щипцов и тянуть их от этой точки. Твердая мозговая плотнообернутые вокруг обонятельных луковиц, и может легко сам срез ткани во время ее удалить. Избегайте повреждения медиальной поверхности обонятельной луковице и самой АОБ. ПРИМЕЧАНИЕ: Если длительность сопротивляется разрыву легко в этот момент, ввести небольшой разрез с прекрасными подсказка весны рассечение ножницами, чтобы облегчить отделение.
- Медленно и осторожно удаляйте лобной коры с тонким пинцетом, не повреждая основные обонятельные луковицы. Соблюдайте коллекцию кровеносных сосудов, входящих в полупрозрачной сеткой сразу хвостового к АОБ. Удалить эту сеть с тонким пинцетом для облегчения проникновения электрода в электрофизиологических экспериментах. Возьмитесь за вычетом щипцами, как она отделяется от АОБ во фронтальной коре втягивания и снимите ее, потянув каудально и медиально, стараясь не прикасаться к AOB. После того, как лобная кора была отделена от обонятельных луковиц, удалить его, сокращая щипцами вентральной и задней на АОВ. ПРИМЕЧАНИЕ: Примите эксTreme уход с чистой удаления, потому что если это делается слишком грубо клубочковой слой может быть поврежден.
- В открытой противоположной носовой полости, удалите оставшуюся контралатеральный перегородки ткани (надуманные желтовато лист, содержащий кровеносные сосуды), используя тонкий пинцет. Возьмитесь за ткань на области хвостовой / спинной (около перегородки кости), а затем потяните / снять ткань к передней стороне. ПРИМЕЧАНИЕ: контралатеральный перегородки ткань может быть случайно удалены во время стадии гемисекции (этап 3.20). В таком случае, наблюдать белый, аваскулярный перегородки хряща и слегка прозрачный, васкуляризованной перегородки кости. Если это так, шаг 4,4 может быть пропущен.
- Осторожно снимите контралатеральный ВНО, запустив одну точку из тонких щипцов между перегородки хряща и ВНО "крыло" (тонкий кусок костной ткани, который проходит вдоль верхнего края как ВНО.
- После крыла отрыва от хряща, переместите кончик пинцетом вентральнов противоположную VNO вблизи средней линии. Повторите этот шаг в нескольких местах вдоль ростральной / хвостового оси противоположной ВНО, чтобы ослабить его, что позволяет ему быть удалены путем захвата пинцетом и подъема далеко.
- Подготовка к отключению перегородки хряща, сделав разрез в брюшной / хвостового края (где она сужается до белого аваскулярного работающем полосы вдоль брюшного края перегородки кости) с тонким пинцетом.
- Снимите перегородки хряща, зажимая вместе тонкий пинцет, чтобы сделать полу тупой точку. Определить разрез сделали в шаге 4.6, вставьте ущипнул щипцы позади (боковой) с этой разреза, а затем медленно поднимите хрящ от перегородки ткани и исходя рострально. ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушить основной перегородки ткани. Как хрящ поднимается, наблюдать за основной лист перегородки ткани стрейч из-за сыпучих спаек в хряще. Периодическая, нежный, и стабильный движение ущипнул тонким пинцетом вдоль этого участка потерятьdhesion может значительно облегчить успешное разделение двух структур.
- Используйте пару # 3 пинцетом с загнутым кончиком, чтобы удалить перегородки кости. Подход перегородки кости под углом почти параллельно плоскости перегородки кости. Вставьте изогнутый зуб между перегородки ткани и перегородки кости. Возьмитесь за кость пинцетом и аккуратно переместить кость назад и вперед, пока она трещин вблизи решетчатой пластине. ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, перегородки кости будут сопротивляться нарушая рядом с решетчатой пластиной. В этом случае, используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно забить перегородки кости вдоль спинной / вентральной оси просто впереди на решетчатой пластине, а затем повторите шаг 4,8.
- Удалите белую хрящ просто ростральная к ВНО, зажимая с одной парой тонких щипцов у входа и потянув рострально с другим пинцета.
- Прикрепите полиимидную канюли для быстрой перфузии устройство и запустите поток раствора Рингера (0,1-0,3 мл / мин) через полиимидной канюли.ПРИМЕЧАНИЕ: Расход Мера с в линию, расходомера малого объема. Использование компьютерным управлением переключающего устройства пневматические стимулом уменьшает изменения расхода во время стимуляции. Сравните нервные реакции, чтобы проверить стимулы с ответами на макет стимула (контролировать раствор Рингера) для обеспечения ответы стимул конкретным.
- Сориентируйте канюли параллельно входа ВНО. Когда канюля удовлетворительно параллельно к входу VNO, смотреть, как давление на выходе приводит к VNO "надуть", что приводит к эвакуации кровеносного сосуда. Сразу вставить канюлю в VNO, сохраняя угол постоянной канюли таким образом, что она остается параллельно с открытием VNO. ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно провести канюли с одной парой тонких щипцов против пластиковой доски и использовать другую пару тонких щипцов для угла конец канюли немного вверх. Если случайно помещает канюли за ВНО, отток может также вызвать ВНО кровеносного сосудаэвакуировать, что приводит к впечатлению надлежащий катетеризация была выполнена. Правильное расположение может быть подтверждено путем включения краситель в растворе Рингера. Когда канюля установлена правильно, краситель должен только выход через вход VNO. Кроме того, можно утверждать, правильное размещение, гарантируя, что канюля хорошо просматривается через полупрозрачной медиальной части ВНО.
- Перемещение пластиковую доску медленно, пока АОВ не находится в прямой поток стандартного ACSF, стараясь не выбить канюли от ВНО. Рассечение является полной и оценка физиологической функции может начаться немедленно. Шаг 5 кратко описывает один подход для принятия такой оценки.
5. Оценка
- Проникают в поверхность АОВ с 2-4 МОм боросиликатного стекла микроэлектрода, прикрепленной к внеклеточной усилителя и осциллографа.
- Медленно микроэлектрода на глубину 100-200 мкм отповерхность со скоростью 50 мкм / мин. ПРИМЕЧАНИЕ: На этой глубине ткани, один столкнетесь случайные спонтанные действия потенциальных сигналов, примерами которых острыми, краткие (~ 1-2 мс) отклонений в напряжении микроэлектродной.
- После столкновения потенциал действия сигнала, остановить продвижение микроэлектрод.
- Заметим, и / или записи потенциальную скорость действий при изменении доставки стимул раствора из контроль Рингера к известному активатора VSN активность (например, раствор Рингера, содержащем 50 мМ KCl). Если рассечение было успешным, изменение стимул-зависимой в потенциальной скорости действий или потенциала локального поля можно наблюдать. Примечание: Не все AOB нейроны будет реагировать на любой раздражитель с увеличением скорости стрельбы (включая раствор Рингера, содержащем 50 мМ KCl). Стимул-зависимой снижение скорости стрельбы также указывает функциональную связь и успешный рассечение. В случае, когда два или больше нейронов, которые встречаютсяне реагируют на ВНО стимуляции, или если нет потенциалы действия не наблюдается после нескольких проникновений электродами, это говорит о том неудачную рассечение. Если это так, то новый рассечение может быть инициирована на шаге 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Достижение успеха с этим препаратом занимает обширную практику, и имеет несколько этапов, на которой он может потерпеть неудачу. Следует ожидать, требовать много попыток, прежде чем добиться успеха. Обычай рассечение камера необходима для успешного завершения этого протокола, и должны быть получены до начала более поздние стадии вскрытия. Конструкция камеры представлены на рисунке 1 является достаточным для этой цели, и может быть изготовлена из относительно недорогих пластиков с минимальными требований обработки. Если не хватает потенциала для создания такого камеру, местные или интернет-компаний обрабатывающие можно ознакомиться и можно построить камеру за отдельную плату.
Большая источник изменчивости по подготовке плотность и хрупкость костей черепа и морды подопытных животных. Во время шагов гемисекции (шаги 3,14-3,20), цель изолировать обе вомероназальных органы наряду с ипсилатеральном перегородки ткани иипсилатеральная аксессуар обонятельная луковица. Тем не менее, это не редкость для перегородки ткани остаются прикрепленными к противоположной полушарии, особенно вблизи точки крепления к спинной кости рыла. Рисунок 2 показывает пример эффективной и неэффективной гемисекции.
Другие общие возникать ошибки во время рассечение тонкой диссекции, в течение которого аксоны вомероназального нерва могут быть повреждены в ткани вблизи перегородки вомероназального органа (фиг.3А и 3В) или вблизи АОВ (фиг. 3С и 3D). Эти и подобные мероприятия будут привести к неполному связи между VSNs и АОБ, оказание препараты непригодными для использования.
Последнее препятствие к успеху подготовке является катетеризация шаг ВНО (Шаг 4,11). Правильное размещение канюли VNO приведет к герметизации просвета VNO, в результате чего немедленное изгнание остаточная кровь из вомероназального насоса. Канюли должна быть четко видны под относительно прозрачной вомероназального эпителия и появление канюли должна быть однородной по всей его длине внутри VNO. После успешного завершения процедуры, можно убедиться, функциональную связь с использованием физиологического анализа, таких как единое целое электрофизиологических записей нейронной активности в ответ на ВНО стимуляции с известным источником ВСН пахучих веществ (рис. 4).
Рисунок 1. A) Инженерные чертежи на заказ рассечение камере используется на этапах 3.22-5.4. ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие отверстия могут быть просверлены для размещения решения и газообразования входы и выходы как лучшего B) Пример фотографии вскрытия камеры, используемой в этом протоколе.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. A, B) Типичные изображения успешной (а) и неудачные (B) препараты после стадии гемисекции (Шаг 3,20). ВНО, перегородки ткани, и обонятельные луковицы (ОВ) все должны быть сохранены от ипсилатеральном полушарии (в данном случае, право (внизу) полушарии. Если видны на ипсилатеральной полушарии носовых раковин, рассечение не удалось. Деления являются 1 мм друг от друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
d/51813/51813fig3highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 3. A, B) Типичные изображения неповрежденной и поврежденной перегородки ткани между ВНО и АОБ. В В, острый пинцет сделал случайного контакта с тканью, повреждая В.Н. аксонов трактаты. C, D) Интактные и поврежденные AOBS. В D, удаление твердой мозговой оболочки, окружающей ипсилатеральную OB привело отсечения вомероназального нерв возле АОБ, вызывая видимых каплю ткани около медиальной АОБ. Масштабные бары 1 мм в длину.
Рисунок 4.) Пример растровых участок потенциалов действия, записанных от АОВ нейрона (внеклеточный записи единое целое) в успешной подготовки. Следы в черном шоу никаких изменений в скорострельность при контрольного раствора Рингера был доставлен в ВНО в течение 5 сек (серый ббык). Следы в красном шоу ответ того же нейрона к стимуляции VNO линии BALB / C женской моче мышей разводили в 100 раз в солевом растворе. B Рингера) пери-стимул временной гистограммы из тех же самых реакций в. Планки погрешностей представляют стандартные ошибки среднего значения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ВНО-АОВ экс естественных получение описано в данном протоколе является полезной альтернативой наркозом в естественных условиях 5-7 и острой живой срез 17 экспериментов функции АОБ. В отличие от острых опытах АОВ срезов, которые также подвергнуть элементы схемы для электрофизиологических и оптических записей, этот препарат сохраняет все сенсорные афференты и внутри-AOB соединения. Хотя это также можно сказать и о наркозом в естественных подходов, наличие анестетиков обязательно изменяет нейронные функции, а именно возбуждающую / тормозящее баланс, который имеет решающее значение для обработки информации в этой и других обонятельных схем 18. Поскольку препарат позволяет избежать использования анестетиков, а потому, что поверхность АОВ полностью подвержены superfusate, это поддаются фармакологических запросов в локальной нейронной обработки.
Существуют, конечно, некоторые ограничения этого препарата. Существует евidence для постепенного вырождения самых глубоких АОБ слоев, а именно глубоких частях внутреннего слоя клеток, в котором находится много ингибирующие зернистых клеток 16. Кроме того, центробежные входы разорваны во время вскрытия, исключая их из активного участия в функции АОБ. Канюли в VNO обходит нормальный действие вомероназального насоса и смывает эндогенные жидкостей, присутствующих в просвете VNO.
Критические шаги в достижении успеха с помощью этого метода являются деликатный гемисекция (Шаг 3,20) и ВНО катетеризация (Шаг 4.11). Можно ожидать, требовать обширную практику, чтобы надежно производить функционально-связанных Экс Vivo препараты. Вторичный рассечение камера используется здесь, могут быть использованы для оценки функционального соединения с помощью одного электрода записи во время стимуляции VNO с источниками феромонов мыши (например, разбавленной мочи). 13,15 Модификации вторичного вскрытия камеры можно бе отмечено, что позволит подготовка к повернут в углах, пригодных для других целей, таких как визуализации многофотонной.
Многие технические препятствия к изучению живой AOB уже давно поставил барьер для нашего понимания социальной запахом и феромонов сенсорной обработки. По рассечения от самых ранних нервные компоненты этой сенсорной пути в этом протоколе вскрытия, человек способен получить экспериментальную доступ к этим труднодоступных исследования цепей. Мы использовали этот препарат для подробных расследований вомероназального сенсорной обработки 19 и сенсорной отображения (Hammen соавт., Не опубликовано). Эта техника будет полезным для будущих исследований в сенсорной обработки в АОБ, особенно тех, которые требуют оптического доступа к ткани (например, изображений многофотонном и Optogenetics). Преимущества этого подхода дополняют мероприятия естественных условиях подходов в, и улучшить наше инструментарий для исследования нейронных механизмов вомероназального опосредованного таксоциальной и репродуктивное поведение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких существенных конфликтов интересов раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) и запуска средств UT Юго-Западного (JPM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Figure 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
