Summary
הנורה עכבר חוש הריח אבזר (AOB) כבר קשה ללמוד בהקשר של קידוד חושי. הנה, אנחנו מדגימים נתיחה שמייצרת vivo הכנה לשעבר שבו נוירונים AOB יישארו תפקודי מחוברים לתשומות ההיקפית שלהם, ומקלים על מחקרים בתחום עיבוד מידע של פרומונים העכבר וkairomones.
Abstract
מערכת עכבר חוש הריח אבזר (AOS) היא מסלול חושי מיוחד לאיתור ריחות בלתי נדיף חברתיים, פרומונים, וkairomones. המעגל העצבי הראשון במסלול AOS, הנקרא הנורה חוש הריח האבזר (AOB), ממלא תפקיד חשוב בקביעת התנהגויות מיניות אופיינית כמו תוקפנות והזדווגות טריטוריאליות. מעגל זה קטן (<1 מ"מ 3) הוא בעל היכולת להבחין מדינות התנהגותיים ייחודיות, כגון מין, מתח, ולחץ מרמזי chemosensory בהפרשות והפרשות של בני מין. בעוד הארגון הקומפקטי של מערכת זו מציג הזדמנויות ייחודיות להקלטה מחלקים גדולים של המעגל בו זמנית, החקירה של עיבוד חושי בAOB נותרת מאתגרת, בעיקר בשל המיקום בניסוי הנחות שלו במוח. הנה, אנחנו מדגימים נתיחה רב שלבים שמסירה את AOB ללא פגע בתוך אונה אחת של גולגולת העכבר הקדמית, והשאיר להתחבריונים לשני נוירונים vomeronasal ההיקפי חושיים (VSNs) ומעגלים עצביים המקומיים בשלמותה. ההליך חושף את פני השטח AOB לכוון בדיקה חזותית, בהנחיית אלקטרו והקלטות אופטיות מרכיבי מעגל AOB בהיעדר חומרי הרדמה. עם החדרת צינורית דקה לתוך איבר vomeronasal (VNO), אשר בתי VSNs, אפשר ישירות לחשוף את הפריפריה לריחות חברתיים ופרומונים בעת הקלטת פעילות במורד הזרם בAOB. הליך זה מאפשר לבירורים מבוקרים לעיבוד מידע AOS, אשר יכול לשפוך אור על מנגנונים המקשרים חשיפת פרומון לשינויים בהתנהגות.
Introduction
עיבוד חושי במוח היונקים בדרך כלל משתרע על פני מעגלים עצביים הדדי המחובר מרובים, כל אחד מהם תמציות תכונות מסוימות מקלט חושי. במסלולים חושיים, עיבוד מידע מוקדם הוא חיוני לתפיסה והתנהגות נורמליות. במערכת ההרחה האבזר (AOS), הנורה חוש הריח האבזר (AOB) היא המעגל העצבי העיקרי המקשר את הפריפריה החושית למבנים במורד הזרם שמכתיבים את איזון ההורמונלי 1,2, תוקפנות 3, ועורר 4. ככזה, עיבוד מידע בתוך מעגל זה קשור מאוד לשינויים בהתנהגות בעלי חיים.
הנורה חוש הריח האבזר ממוקמת בעכברים וחולדות בהיבט גב / הזנב / האחורי של הנורה העיקרית חוש הריח (MOB) מתחת הצפוף, vascularized סינוס rhinal. AOB מקבל עצבוב מביא מהאקסונים של תאי עצב ההיקפי vomeronasal החושי (VSNs) שמתגוררים באיבר vomeronasal (VNO), smal צינור עיוור הסתיים ליטר בחוטם הקדמי בדיוק מעל החיך הרך. אקסונים אלה חוצים את הסדין העדין של רקמה במחיצה בגבול המדיאלי של מעברי האף. מספר מחקרים בחנו תגובות עצביות AOB למקורות של ריחות AOS (כגון שתן עכבר) in vivo באמצעות עכברים מורדמים 5-7 או בעלי חיים באופן חופשי, לחקור 8. הגבורה הרדימה במחקרי vivo המעורבים (א) tracheotomies כדי להבטיח הרדמה עמוקה ולמנוע את השאיפה של גירויים נוזליים 5-7, (ב) גירוי של גנגליון האוהד צוואר הרחם 6 או cannulation הישיר של איבר vomeronasal 5,7 להציג את ריחות בלתי נדיף ו (ג) craniotomies עם או בלי כריתת אונה קדמית כדי לאפשר קידום אלקטרודה לתוך AOB 6. ער / מתנהג מחקרים 8-10 השתלה כירורגית מעורבת של דיסק קשיח זעירה. לסיכום, פרדיגמות ניסוי אלה הן רבות עוצמה, אבל קשות מאוד ולעתים קרובות דורשות הרדמה.
ss = "jove_content"> מעניין לציין, כי מספר מחקרים ניסו לשמור על מבנים חושיים ומעגלים עצביים במורד הזרם בחיים מחוץ לגוף (ex vivo) בהצלחה מסוימת 11-15. בגלל הקשרים בין VNO וAOB יישארו ipsilateral, ובגלל הרקמה במחיצה קו האמצע יכולה להיות חשופה לsuperfusate מחומצן בחצי כדור בודד, בקשנו לפתח vivo לשעבר גישה כזו חד אונה לבודד מבנים אלה תוך שמירה על הקישוריות התפקודית שלהם. הצלחנו לאחרונה בהשגת מטרה זו 16. הכנה זו שומרת VNO וAOB החיים ותפקודיים מחובר לפחות 4 שניהם - 6 שעות, כי שניהם אקסונים (יחד הרקמות רכות במחיצה קו האמצע) וAOB הם רדודים יחסית <600 מיקרומטר תכונות שאינן נגישים לsuperfused מלאכותי נוזל השדרתי מחומצן ( aCSF). vivo לשעבר הכנת VNO-AOB זה מאפשרת כניסתה של גירויים מבוקרים לתוך VNO באמצעות צינורית דקה, וגישה ויזואלית ישירה לAOB הקטן למיקום האלקטרודה ממוקד ו / או מיקרוסקופ פלואורסצנטי החי. בשיטה זו יש יתרון אם אחד רצונות ללמוד מעגלים אלה בהיעדר חומרי הרדמה. בגלל גישה זו מנתקת קשרי צנטריפוגלי, הוא לא מתאים גם לפניות לאפנון צנטריפוגלי של תפקוד AOB. Vivo לשעבר הכנת VNO-AOB קשה ללמוד, אבל השיג פעם אחת מייצר פלטפורמה אמינה שעליו לחקור את הארגון במעגל, עיבוד מידע, ופלסטיות עצבית במעגל החושי רב עוצמה הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית Southwestern UT הטיפול בבעלי חיים ושימוש, ונבחרו על מנת למזער את הלחץ, אי נוחות וכאב שחווה בניסויים בעכברים.
1. Dissection קאמרי
חדר נתיחה מותאמת אישית וקרש פלסטיק קטן, דק נדרשים לקבלת התוצאות הטובות ביותר (איור 1). לבנות או להשיג חדר כזה מראש של ניסיון בפרוטוקול זה.
2. פתרונות Dissection
- הכן 1 ליטר של נוזל השדרתי מלאכותי סטנדרטי (aCSF) לשימוש בשלבי 3.22-5.4. להוסיף NaCl 125 מ"מ, KCl 2.5 מ"מ, CaCl 2 2 מ"מ, 2 מ"מ MgCl 1, NaHCO 3 25 מ"מ, לאא 2 PO 4 1.25 מ"מ, מיו-אינוסיטול 3 מ"מ, פירובט נתרן 2 מ"מ, נתרן ascorbate 0.4 מ"מ, וגלוקוז 25 מ"מ עד 1 ליטר של מים pyrogen בחינם.
- הכן את aCSF הראשונית לנתיחה (200 מיליליטר) עבורלהשתמש בצעדי 3.3-3.22. קח 200 מיליליטר של תקן aCSF ולהעלות את ריכוז MgCl 2 על ידי 9 מ"מ על ידי הוספת 0.366 גרם של MgCl 2 hexahydrate.
- הכן את הפתרון של רינגר הסטנדרטי לבצע גירויים לVNO דרך הצינורית לשימוש ב4.11-5.4 צעדים המכילים NaCl 115 מ"מ, KCl 5 מ"מ, CaCl 2, 2 מ"מ, MgCl 2, 2 מ"מ, NaHCO 3 25 מ"מ, HEPES 10 מ"מ, גלוקוז 10 מ"מ.
- בועת L 0.8 של aCSF סטנדרטית ו0.5 L של רינגר עם 95% O 2, גז CO 2 של 5% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך מינימום של 15 דקות עד לשימוש.
- בועה 200 מיליליטר של aCSF נתיחה הראשונית עם 95% O 2, CO 2 גז 5% על קרח למשך 15-20 דקות עד שהוא מגיע 4 ° C.
3. Dissection הראשי
- הכן את השטח לנתיחה. הנח שלוש מנות 35 מ"מ פטרי, מחומצן aCSF, מספריים עריפת ראש, מעוקלים לנתח מספריים, ישר לנתח מספריים, מלקחיים Adson, קרקפת # 11להב אל וידית וסכין גילוח על קרח.
- לאחר aCSF חומצן התקררה עד 4 ° C, עמוק להרדים את החיה בחדר התייבשות באמצעות 2-5 מיליליטר Isothesia (isofluorane 99.9%). לבצע בדיקות קמצוץ זנב ורגל על מנת להבטיח את החיה בהרדמה עמוקה.
- ברגע שהרדמה עמוקה הוא אישר, לערוף את בעלי החיים ואת המקום באופן מיידי את הראש בצלחת פטרי מלא aCSF הנתיחה צוננת. הערה: לטבול את הרקמה בנתיחה מצוננת aCSF לשמור את זה מגניב לאורך כל ההליך כאשר אינו בשימוש.
- הסר את ההיבט הנמוך (לוע הגחון, לסת תחתונה, ולשון) עם מספריים מעוגלים.
- שימוש deglove Adson מלקחיים (קליפה) עור השטחי וקבצים מצורפים שרירים מהגולגולת. מקלפים את עור הקרקפת מזנב למקורי עד לאתר רק של קובץ מצורף היא מעל השיניים הקדמיות. חותכים את הרקמה בנקודת הקובץ המצורף באמצעות מספריים מעוקלים. הסר את העיניים ידי אחיזתו עם מלקחיים ומשכו אותה מההכנה. Nאוזן סוף הליך degloving, להימנע מכוח עודף על סחוס האף העדין על ידי שימוש במלקחי Adson לקבצים מצורפים שרירים ללא עצמות לסת העליונות. הערה: ניתוק הקרקפת מהיבט הזנב של הגולגולת עם מספריים ישרים.
- עם המספריים הישרים, לחתוך את קו האמצע של הגולגולת מזנב למקורי ועד לטיפים המספריים כמה מ"מ לתוך העצמות הקדמיות (רק לפני סינוס rhinal).
- הסר את הקודקודית ועצמות קדמיות של הגולגולת באמצעות מלקחיים Adson. הערה: חתיכות של העצם הפרונטלית לעתים קרובות נשארות צמודות לעצמות האף הזנב לסינוס rhinal. הסר את החתיכות האלה בזהירות נלקחו שלא ליצור קשר עם נורות חוש הריח.
- השתמש באזמל כדי לעשות חתך העטרה דרך הזנב מ"מ הקדמי של אונת 2 להסינוסים ולאחר מכן להסיר את הזנב המוח כדי לחתוך. ודא את קצה קשר אזמל הגובה הגרמי של גולגולת הגחון לנתק את הרקמה האחורית לחלוטין. הערה: זה מאפשרהסרת רוב המוח בלי לשים לחץ מכאני על שטחי חוש הריח לרוחב או נורות חוש הריח.
- הסר את היבטי הזנב החשופים של גולגולת הגחון עם מספריים ישרים. השאר את הסינוסים ורקמת עצבים שנותרה.
- הסר את קשת הזיגומטית ואת שרירי פנים בצד ימין אנטומי של הגולגולת באמצעות מספריים ישר
- סובב את החוטם מעלה (צד גחון) כדי לחשוף את הגג של הפה.
- לחתוך ולהסיר את החיך באופן מיידי הזנב לשיניים החותכות. עושה זאת על ידי החדרת קצה להב סכין המנתחים תחת מקביל חיך לגג של הפה ולאחר מכן להעביר את הלהב לכיוון השיניים החותכים.
- לתפוס את הקצה המשוחרר (מקורי) של החיך עם מלקחיים Adson ולהסיר על ידי משיכת caudally.
- בצד השמאל אנטומי של הגולגולת, השתמש בלהב סכין המנתחים להאריך את נקב פפאלץ caudally, החל מהנקב הקטן ליד השיניים הטוחנות. להשיג זאת על ידי החדרת קצה בלה האזמלדה לתוך הריק ליד השיניים הטוחנות וסיבוב פרק כף היד. הערה: השתמש בזהירות רבה כדי להשתמש רק בקצה הלהב - חתך עמוק יכול לגרום נזק לרקמות במחיצה.
- באמצעות הקצה של להב סכין המנתחים, לחתוך מנקב פפאלץ באמצעות השיניים החותכות, החל מקורי לאיבר vomeronasal שמאל אנטומיים. השתמש קיצוצי ניקוד מרובים. לא לגרום נזק לרקמות במחיצה ועצבי vomeronasal ידי החדרת הלהב עמוק מדי.
- הפעל את הרקמה כך הגולגולת הגבי פונה כלפי מעלה ולאחר מכן לכוון את הלהב ישר תער אנכי (במקביל לקו האמצע) בקצה הזנב של ההכנה.
- בקצה הגחון של הרקמות, לגעת בחוד החנית של סכין הגילוח מייד בצד השמאל של קו האמצע. נער בעדינות את הלהב ולנוע לאורך נקב פפאלץ שמאל (לחתוך אזור הציג בשלב 3.14).
- בקצה הגב של הרקמה, הנח את חוד החנית של התער מייד בצד השמאל של קו האמצע (מ"מ פחות מ 1).
- שמירההלהב מקביל לקו האמצע, לטלטל את סכין הגילוח באיטיות עם לחץ לכיוון הקדמי של הרקמה. שים לב התנגדות בצלחת cribriform. להפסיק מייד לאחר איבוד כדור התנגדות זו. הערה: בשלב זה, האונה הימנית היא משוחררת מהאונה השמאלית. החיבור היחיד שנותר הוא בין האונות קדמית לאורך חוטם הגב לצלחת cribriform.
- הפרד את ההמיספרות ידי אחיזתם בסמוך הצדדים הזנב עם אצבעות בכפפות ובעדינות מסתובבת להם רוחבי וanteriorly. הערה: שלב זה הוא מקור של השתנות ניסיוניות, במיוחד בעכברים בעלי זרבובית סוטה או שבירה (למשל, עכברים מבוגרים). כמו כן, בעת שניסה לסובב את ההמיספרות אחד מהשני, אם התנגדות חזקה הוא נתקל להבקיע חוטם הגבי (קדמי לצלחת cribriform) כדי להחליש את רקמות חיבור. תוך כדי כך, לקחת בזהירות רבה שלא להכניס את האזמל עמוק, אשר עלול לגרום נזק ti המחיצהssue ועצבי vomeronasal.
- למרוח כמות קטנה (50-100 μl) של דבק רקמות לקרש ומניח בעדינות את הקצה הלטרלי של האונה הימנית על הדבק באמצעות המלקחיים Adson. הסרת לחות עודפת מהצד הלטרלי של ההכנה באמצעות מגבת נייר כדי למנוע פילמור המוקדם דבק והדבקה רופפת לקרש. הערה: למרוח כמה טיפות של aCSF הנתיחה צוננת על המדגם כדי להאיץ את פילמור הדבק לאחר הרקמה ממוקמת על הדבק. הדבר מבטיח כי הרקמה נשארת בחוזקה מוחזקת לקרש.
- מניחים כמות קטנה (3-5 בקוטר מ"מ, 2 מ"מ עמוק) של שומן ואקום באמצע חדר הנתיחה המשני ומניח בצד של הקרש מול הרקמות בתקיפות נגד השומן. מייד למלא את התא לנתיחה עם aCSF נתיחה צוננת, להעביר לאזור הנתיחה בסדר ולהתחיל זלוף עם aCSF סטנדרטית מחומצן. לכוון את הקרש כך שנורת חוש הריח היא ישירותזרם של aCSF סטנדרטית טרי מחומצן.
4. Dissection המשני
- הסר את כל (משמאל) הנורה גלויה נגדי חוש הריח או רקמה בקליפת המוח מההכנה באמצעות מלקחיים בסדר. לצבוט יחד מלקחיים בסדר (ויצרו נקודה בוטה למחצה), ולאחר מכן למקם אותו בגב וחלק הזנב של הרקמות בסמוך לקו האמצע. בעדינות אריץ את המלקחיים צבטו לאורך קו האמצע, קילוף הרקמה מהאונה הימנית באיטיות בתנועה קדמית. להסיר את כל הרקמה הנגדית, כולל רקמת הנורה חוש הריח הנגדית. תשמור על עצמך קיצוני לא לדקור דרך הרקמות, אשר יכול לגרום נזק לAOB או עצב vomeronasal.
- שים לב מאטר הדורה הלבן על פני השטח הגבי / המדיאלי של הנורה חוש הריח. לקרוע מאטר הדורה זה לאורך קצה הגב / הזנב של הנורה חוש הריח ידי אחיזה בחלק הלבן ביותר של הדורה עם שני זוגות מלקחיים עדינים ולמשוך אותם משם מנקודה זו. הדורה היא בחוזקהעוטף את נורות חוש הריח, בקלות ובעצמו יכול לחתוך דרך רקמות בזמן שהוא הוסר. הימנע מניזק למשטח המדיאלי של הנורה חוש הריח וAOB עצמו. שים לב: אם הדורה מתנגדת לקרוע בקלות בשלב זה, להציג את החתך קטן במספריים לנתיחה טיפ האביב נאה כדי להקל על הפרדה.
- לאט ובזהירות לקלף את קליפת המוח הקדמית עם מלקחיים עדינים מבלי לפגוע בנורות חוש הריח הבסיסית. שים לב לאוסף של כלי דם המופיעים כמו רשת שקופה למחצה באופן מיידי הזנב לAOB. הסר נטו זה עם מלקחיים עדינים כדי להקל על חדירת האלקטרודה בניסויי אלקטרו. לתפוס את הרשת עם מלקחיים כמו שהוא מפריד מAOB במהלך נסיגת קליפת המוח קדמית והסר אותו על ידי משיכת caudally ומדיאלית, נזהר שלא לגעת בAOB. ברגע שקליפת המוח הקדמי הופרדה מנורות חוש הריח, הסר אותו על ידי חיתוך עם מלקחיים הגחון והאחוריים לAOB. הערה: קח לשעברTreme טיפול בהסרה נטו, אם היא נעשית בגסות מדי שכבת גלומרולרי יכול להיות פגומה.
- בחלל האף הנגדי החשוף, להסיר את כל רקמה שנותרה נגדי במחיצה (גיליון דקיק צהבהב המכיל כלי דם) באמצעות המלקחיים בסדר. לתפוס את הרקמות באזור הזנב / גב (ליד העצם במחיצה) ולאחר מכן למשוך / להרים את הרקמה לכיוון הצד הקדמי. הערה: הרקמה במחיצה הנגדית ניתן להסיר בטעות במהלך שלב hemisection (שלב 3.20). במקרה כזה, להתבונן, סחוס לבן avascular במחיצה ואת העצם במחיצה שקוף מעט, vascularized. אם זה המקרה, ניתן לדלג שלב 4.4.
- להסיר את VNO הנגדי בקפידה על ידי הפעלת נקודת המלקחיים העדינים בין סחוס המחיצה ואת "הכנף" VNO (פיסה דקה של רקמה גרמית המשתרעת לאורך קצה הגב של שניהם VNOs אחת.
- בעקבות ניתוק הכנף מהסחוס, להזיז את הקצה של מלקחיים ventrallyלVNO הנגדי ליד קו האמצע. חזור על שלב זה בכמה מקומות לאורך הציר מקורי / הזנב של VNO הנגדי כדי לשחרר אותו, מה שמאפשר לה להיות הוסר על ידי אחיזה עם מלקחיים והרמה משם.
- הכן כדי להסיר את הסחוס במחיצה על ידי ביצוע חתך בקצה הגחון / הזנב (שבו הוא הולך וצר לריצת רצועת avascular לבנה לאורך קצה הגחון של העצם במחיצה) עם מלקחיים בסדר.
- הסר את הסחוס במחיצה על ידי צובט יחד מלקחיים בסדר כדי להבהיר נקודה בוטה למחצה. זהה את החתך שנעשה בשלב 4.6, הכנס את המלקחיים צבטו מאחור (לרוחב) כדי לחתוך את זה, ואז לאט להרים את הסחוס מן הרקמה במחיצה ושימשיך rostrally. הערה: אין לשבש את הרקמה במחיצה הבסיסית. כסחוס הרים, לבחון את הגיליון הבסיסי של מתיחת רקמות במחיצה עקב הידבקויות רופפות לסחוס. תנועה מחזורית, עדינה, ויציבה של המלקחיים בסדר צבטו לאורך אתר זה של רופףdhesion יכול מאוד להקל הפרדה מוצלחת של שני מבנים.
- השתמש זוג # 3 מלקחיים עם קצה מכופף כדי להסיר את העצם במחיצה. מתקרב לעצם במחיצה בזווית כמעט מקביל את המטוס של העצם במחיצה. הכנס את שן העקום בין רקמת העצם במחיצה ומחיצה. לתפוס את העצם עם המלקחיים ובעדינות להזיז את העצם קדימה ואחורה עד שסדקיו ליד צלחת cribriform. הערה: במקרים מסוימים, העצם במחיצה יתנגד לשבור ליד צלחת cribriform. במקרה זה, להשתמש במלקחיים בסדר להבקיע בעדינות את העצם במחיצה לאורך הגב / ציר הגחון רק קדמית לצלחת cribriform, לאחר מכן חזרו על שלב 4.8.
- הסר את הסחוס הלבן מקורי רק VNO ידי צובט עם זוג אחד של מלקחיים בסדר בכניסה ומושך rostrally עם עוד זוג מלקחיים בסדר.
- צרף את צינורית polyimide למכשיר זלוף מהר ולהתחיל את הזרימה של הפתרון של רינגר (.1-.3 מיליליטר / דקה) דרך צינורית polyimide.הערה: קצב זרימת מדוד עם, מד זרימת נפח קטן באופן מקוון. שימוש במכשיר מיתוג גירוי פנאומטי מבוקר מחשב מפחית שינויי קצב הזרימה במהלך גירוי. שקלו את התגובות עצביות כדי לבחון גירויים בתגובות לגירוי דמה (לשלוט בפתרון של רינגר) כדי להבטיח את התגובות ספציפיות גירוי.
- להתמצא במקביל הצינורית לכניסת VNO. כאשר הצינורית באופן משביע רצון במקביל לכניסת VNO, ולראות איך הלחץ לשקע גורם VNO ל" לנפח ", שהוביל לפינוי של כלי הדם. מייד להכניס את הצינורית לתוך VNO, תוך שמירה על הזווית של קבוע הצינורית כך שהוא נשאר במקביל לפתיחת VNO. הערה: זה יכול להיות מועיל כדי להחזיק את הצינורית עם זוג אחד של מלקחיים בסדר כנגד קרש הפלסטיק ולהשתמש בזוג נוסף של מלקחיים בסדר זווית סוף הצינורית מעט כלפי מעלה. אם אחד בטעות מציב את הצינורית מאחורי VNO, יצוא יכול גם הוא לגרום לכלי דם VNOלפינוי, מה שמוביל לרושם cannulation נכון בוצע. מיקום נכון יכול להיות מאושר על ידי שילוב צבע בפתרון של רינגר. כאשר הצינורית ממוקמת כראוי, לצבוע רק צריך יציאה דרך כניסת VNO. בנוסף, אפשר לאשר מיקום נכון על ידי הבטחה כי הצינורית היא לעין בקלות דרך ההיבט המדיאלי השקוף למחצה של VNO.
- הזז את קרש הפלסטיק לאט עד AOB הוא בזרימה הישירה של aCSF הסטנדרטי, נזהר שלא לעקור את הצינורית מVNO. הנתיחה היא מלאה והערכה של תפקוד פיסיולוגי יכולה להתחיל באופן מיידי. שלב 5 מתאר בקצרה גישה אחת לביצוע הערכה זו.
5. הערכה
- לחדור את פני השטח של AOB עם microelectrode זכוכית ורוסיליקט 2-4 MΩ מחוברת למגבר ואוסצילוסקופ תאיים.
- לאט לאט לקדם את microelectrode לעומק של 100-200 מיקרומטר מפני השטח בשיעור של 50 מיקרומטר / min. הערה: בעומק רקמה זו, אחד ייתקל גל מזדמן פעולה ספונטנית פוטנציאל שהודגם על ידי סטיות חדות, קצרות (~ 1-2 אלפיות שני) במתח microelectrode.
- על המפגש עם צורת גל פוטנציאל פעולה, לעצור קידום microelectrode.
- שים לב ו / או להקליט את שיעור פוטנציאל הפעולה תוך שינוי פתרון משלוח גירוי מהשליטה רינגר לactivator ידוע של פעילות VSN (למשל, הפתרון של רינגר המכיל 50 מ"מ KCl). אם הנתיחה בוצעה בהצלחה, ניתן להבחין בשינוי גירוי תלוי בשיעור פוטנציאל פעולה או פוטנציאל בתחום מקומי. הערה: לא כל הנוירונים AOB יגיבו לכל גירוי עם עלייה בקצב ירי (כולל הפתרון של רינגר המכיל 50 מ"מ KCl). ירידת גירוי תלוי בקצב ירי גם מציינת קישוריות פונקציונלית ונתיחה מוצלחת. במקרה בו שניים או יותר נוירונים הם נתקלו כיאינם מגיב לגירוי VNO, או אם אין פוטנציאל פעולה הם נצפו לאחר חדירות אלקטרודה מרובות, זה מצביע על נתיחה לא מוצלחת. אם זה המקרה, לנתיחה חדשה יכולה להיות יזם בשלב 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השגת הצלחה עם הכנה זו דורש תרגול רב, ויש לו כמה שלבים שבו היא יכולה להיכשל. יש לצפות לדורשים ניסיונות רבים בעבר להשגת הצלחה. חדר הנתיחה המותאמת אישית נדרש להשלמה מוצלחת של פרוטוקול זה, ויש לקבל לפני תחילת השלבים מאוחר יותר של הניתוח. עיצוב החדר מוצג באיור 1 הוא מספיק לצורך זה, ויכול להיות עשוי מפלסטיק זול יחסית עם דרישות עיבוד מינימליות. אם אחד חסר את היכולת לייצר תאים כאלה, ניתן להתייעץ חברות עיבוד מקומיות או באינטרנט ותוכלנה לבנות את החדר תמורת תשלום.
מקור גדול של השתנות פני הכנות הוא הצפיפות ושבירות של עצמות הגולגולת והחוטם של חיות ניסוי. במהלך שלבי hemisection (שלבי 3.14-3.20), המטרה היא לבודד את שני איברי vomeronasal יחד עם הרקמות במחיצה ipsilateral והנורה חוש הריח אבזר ipsilateral. עם זאת, אין זה נדיר עבור הרקמות במחיצה להישאר מחוברות לאונה הנגדית, נקודות חיבור קרובים במיוחד לעצמות גב של החוטם. איור 2 מראה דוגמא של hemisection יעיל ולא יעיל.
שגיאות נפוצות אחרות לנתיחה להתעורר במהלך הנתיחה בסדר, שבמהלכו האקסונים של עצב vomeronasal עלולים להינזק ברקמות במחיצה קרובה לאיבר vomeronasal (3A דמויות ו3B) או בסמוך לAOB (3C דמויות ו3D). אירועים אלה ודומים לי יגרמו קישוריות שלמה בין VSNs וAOB, טיוח הכנות לבלתי שמישה.
המכשול האחרון להצלחה של ההכנה הוא צעד cannulation VNO (שלב 4.11). מיקום נכון של צינורית VNO יגרום לשמירת לחץ של לומן VNO, גורם לגירוש מיידי של דם שיורית ממשאבת vomeronasal. הצינורית צריכה להיות לעין מתחת לאפיתל vomeronasal השקוף יחסית והמראה של הצינורית צריך להיות אחיד לאורכו בתוך VNO. עם הסיום מוצלח של ההליך, אפשר לבדוק קישוריות תפקודית באמצעות assay פיסיולוגי כגון קלטות אלקטרו יחידה אחת של פעילות עצבית בתגובה לגירוי VNO עם מקור ידוע של ניחוחי VSN (איור 4).
איור 1.) שרטוטים הנדסיים של חדר הנתיחה המותאמת אישית בשימוש בצעדים 3.22-5.4. הערה: חורים קטנים עשויים להיות נקדחו כדי להכיל את פתחי הכניסה ופתרון בגז ושקעים כרצויים) תמונת דוגמא ב 'של קאמרי לנתיחה בשימוש בפרוטוקול זה.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2., ב ') נציג תמונות של מוצלח () ותכשירים לא מוצלחים (ב') לאחר שלב hemisection (שלב 3.20). VNO, רקמות במחיצה, ונורות חוש הריח (צוותות התחקירנים) חייבים להישמר מכל חץ כדור ipsilateral (במקרה זה, בחצי הכדור הימני (התחתון). אם turbinates האף נראה בחצי כדור ipsilateral, הנתיחה נכשלה. סמנו סימנים הם 1 מלבד מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Width =" d/51813/51813fig3highres.jpg 600 "/>
איור 3., ב ') נציג תמונות של רקמות במחיצה שלמות ופגומות בין VNO וAOB. בB, המלקחיים לנתח יצרו קשר בשוגג עם הרקמה, פגיעה בשטחי האקסון VN. C, D) AOBs לא פגוע והפגום. בD, ההסרה של הדורה המקיפה את OB ipsilateral הביאה לניתוק עצב vomeronasal ליד AOB, וגרמה לכתם נראה לעין של רקמה ליד AOB המדיאלי. ברים סולם הם 1 מ"מ האורך.
איור 4.) עלילת סריקה דוגמא לפוטנציאל פעולה שנרשם מנוירון AOB (הקלטת יחידה אחת תאית) בהכנה מוצלחת. עקבות במופע שחור לא חלה שינוי בשיעור ירי כאשר הפתרון של השליטה רינגר נמסר לVNO במשך 5 שניות (ב אפורשור). עקבות במופע אדום התגובה של אותו נוירון לגירוי VNO עם BALB / ג שתן עכבר נשי מדוללת פי 100 לרינגר מלוח. B) היסטוגרמה זמן פרי-גירוי של אותן התגובות ב. ברים שגיאה מייצגים סטיות תקן של הממוצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vivo לשעבר הכנת VNO-AOB המתואר בפרוטוקול זה היא אלטרנטיבה יעילה להרדמת in vivo 5-7 ופרוסה חיות חריפה 17 ניסויים של תפקוד AOB. בניגוד לניסויי פרוסת AOB חריפים, שגם חושפים את רכיבי מעגל עבור קלטות אלקטרו אופטיות, הכנה זו שומרת על כל afferents החושית וקשרי התוך AOB. למרות שיכול להיות גם אמר את זה בהרדמה בגישות vivo, נוכחותם של חומרי הרדמה בהכרח משנה את התפקוד עצבי, איזון מעכב / כלומר מעורר, שהוא חיוני לעיבוד מידע ובמעגלי ריח אחרים 18. בגלל ההכנה תמנע את השימוש בחומרי ההרדמה, ובגלל משטח AOB חשוף לsuperfusate לחלוטין, ניתן לפניות תרופתי לעיבוד עצבי מקומי.
ישנם, כמובן, כמה מגבלות של הכנה זו. יש EVidence לניוון הדרגתי של שכבות AOB העמוקות ביותר, כלומר את החלקים העמוקים של השכבה הסלולרית הפנימית, שבו בתים רבים תאי גרגיר מעכבים 16. בנוסף, תשומות צנטריפוגלי, נותקו במהלך הניתוח, ומבטלות אותם מהשתתפות פעילה בתפקוד AOB. Cannulation של VNO עוקף את הפעולה הרגילה של משאבת vomeronasal, ושוטף משם את נוזלי אנדוגני ההווה בלומן VNO.
צעדים קריטיים להשגת הצלחה בשיטה זו הם hemisection העדין (שלב 3.20) וcannulation VNO (שלב 4.11). אפשר לצפות דורשים תרגול נרחב כדי לייצר באופן מהימן הכנות לשעבר תפקודי המחובר vivo. חדר הנתיחה המשני מנוצל כאן ניתן להשתמש כדי להעריך את הקישוריות תפקודית באמצעות הקלטות חד אלקטרודה במהלך גירוי של VNO עם מקורות של פרומונים עכבר (כמו שתן מהול). 13,15 שינויים של חדר הנתיחה המשני יכולים bדואר עשה המאפשרים את ההכנה לסובב לזוויות מתאימות למטרות אחרות, כגון הדמיה multiphoton.
המכשולים טכניים הרבים ללימוד AOB מתגורר כבר זמן רב שמציבים מחסום להבנה של ריח חברתי ועיבוד חושי פרומו שלנו. על ידי לנתח משם הרכיבים עצביים המוקדמים של מסלול חושי זה בפרוטוקול זה לנתיחה, אחד הוא מסוגל לקבל גישה ניסיונית למעגלים הקשים ללימוד אלה. יש לנו מנוצלים בתכשיר זה לשאלות מפורטות בעיבוד חושי vomeronasal 19 ומיפוי חושי (Hammen et al., לא פורסם). טכניקה זו תהיה שימושית עבור מחקרים עתידיים לעיבוד חושי בAOB, במיוחד אלה הדורשים גישה אופטית לרקמות (למשל, ההדמיה multiphoton וoptogenetics). היתרונות של גישה זו משלימים את אלה של in vivo גישות, ולשפר את ערכת הכלים שלנו לחקר המנגנונים העצביים של כל כך בתיווך vomeronasalהתנהגויות cial ורבייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש הסופרים אין קונפליקטים משמעותיים של ריבית לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי r00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (בית לוחמי הגטאות: NINDS, NIH) ובקרנות UT Southwestern הפעלה (JPM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Figure 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
