Summary
I denna studie, en ny plattform utreda intraneuronala molekylära signaturer behandlingssvar vid bipolär sjukdom (BD) har utvecklats och validerats. Luktepitel från BD patienter erhölls genom nasala biopsier. Sedan laser-capture microdissection kombinerades med realtid RT-PCR för att undersöka den molekylära tecknandet av litium svar i BD.
Abstract
Bipolär sjukdom (BD) är en allvarlig neuropsykiatrisk sjukdom med dåligt förstått patofysiologi och typiskt behandlas med stämningsstabiliserande, litiumkarbonat. Djurstudier samt genetiska studier visar att litium påverkar molekylära mål som är involverade i neuronal tillväxt, överlevnad och mognad, och särskilt molekyler som är involverade i Wnt signalering. Med tanke på den etiska utmaningen att få hjärn biopsier för att undersöka dynamiska molekylära förändringar i samband med litium-respons i det centrala nervsystemet (CNS), kan man överväga att använda nervceller som erhållits från doft vävnader för att uppnå detta goal.The luktepitel innehåller luktreceptor nervceller i olika stadier av utveckling och gliaceller liknande stödjande celler. Detta ger en unik möjlighet att studera dynamiska förändringar i CNS hos patienter med neuropsykiatriska sjukdomar, med hjälp av lukt vävnad säkert erhållas från nasala biopsier. För att övervinna nackdelen utgörs av substantial kontamination av biopsier lukt vävnad med icke-neuronala celler, var en ny metod för att erhålla anrikade neuronala cellpopulationer som utvecklats genom att kombinera nasala biopsier med laser capture mikrodissektion. I denna studie var ett system för att utreda behandlingsassocierade dynamiska molekylära förändringar i nervvävnad utvecklats och validerats, med hjälp av en liten pilotprov BD patienter rekryteras för att studera de molekylära mekanismerna för litium behandlingssvar.
Introduction
Bipolär sjukdom (BD) är en allvarlig neuropsykiatrisk störning, som kännetecknas av sjukliga förändringar i humör, kör och kognition 1. Litium används för behandling av BD har visats påverka steady state mRNA nivåer av ett stort antal gener i djurstudier 2, men det är fortfarande okänt om någon av dessa molekyler är förknippad med kliniskt svar hos människor 2. Förstå mekanismen av litium svar skulle kräva utreda litium-inducerad molekylära förändringar i neuronala vävnader. Tyvärr är det inte praktiskt att få hjärn biopsier av BD patienter före och efter litiumbehandling för att identifiera molekylära signaturer av litium svar. Postmortala hjärnvävnader har använts för att studera biomarkörer i BD, men de kan inte användas för att bedöma molekylära markörer associerade med dynamiska förändringar i känslor, kognition och kör; och giltigheten av efterhand konstaterat litium behandlingssvar kan vara problematiskt 4. Lymfocyter och andra blodkroppar kan vara användbar, men molekylära förändringar i blodceller kanske därför inte speglar neuronala förändringar 3-5. Cerebrospinalvätska kan vara otillräckligt för att få information om intracellulära molekyler som kan reflektera sjukdomsassocierade och medicinering-reversibel inneboende förändringar.
Den luktepitel (OE) är en unik del av det centrala nervsystemet (CNS), embryologiskt relaterade till limbiska strukturer 6; och det är lätt att nå via nasala biopsier. Den består av gliaceller liknande stöd (dvs sustentacular) celler, basala prolifererande celler och luktreceptor nervceller i olika stadier av utveckling 7-9. Därför ger OE en unik möjlighet att accessibly studera dynamiska förändringar i CNS hos patienter med neuropsykiatriska sjukdomar 7. Studier visar nyttan av OE som surrogat vävnad för undersökning av sjukdomar förknippade händelser som speglar dessa occurring i hjärnans nervceller 8,9. Till exempel har studier utnyttjas OE för att undersöka molekylära profiler associerade med psykiatriska tillstånd 10-14. Luktsinnet tjänar också till att identifiera kliniska endophenoytpes såsom lukt underskott som är förknippade med negativa symptom på schizofreni 15. Dessutom nervsystemets processer fortsätta i OE hela livet, vilket ger en användbar väg för att modellera det underliggande patofysiologin för psykiatriska tillstånd 8,9.
Emellertid är en nackdel med användningen av denna vävnad är den betydande kontaminering av lukt biopsier med icke-neuronala celler 16. Till exempel, total-RNA används för genuttryck studier i tidigare OE studier innehöll RNA extraherat från hela nasala biopsier vävnad inklusive RNA från icke-neuronala celler 17. Därför har tidigare tillvägagångssätt varit begränsad av kvaliteten på celler. För att lösa detta problem, att en ny metod få anrikade neuronala cellpopulationer genom att kombinera nasala biopsier med laser-capture microdissection (LCM) har utvecklats 18.
LCM är en teknik som gör det möjligt för selektiv isolering av celler genom att använda UV laserskärning i kombination med infraröd laser 19-21. Kombinera LCM med OE tillvägagångssätt minimerar betydande förorening av OE av icke-neuronala celler, och därigenom öka anrikning av neuronala celler 18. Dessutom kan den neuronala skiktet särskiljas från submucosa skiktet under ett mikroskop, vilket därigenom eliminerar behovet av färgning. Neuronala celltyper kan vidare skiljas från andra cellpopulationer med användning av primära antikroppar som uttrycks av celltypen av intresse 7. Därför denna procedur upprättar en enklare metod för anrikning av nästan rent neuronala cellpopulation som kan användas för genuttryck studier, immunohistokemi och andra morfologiska undersökningar.
ve_content "> Denna studie syftar till att etablera en experimentplattform för att undersöka molekylära förändringar i lukt nervceller i samband med sjukdomstillstånd och behandlingssvar. För att åtgärda detta, en liten uppsättning rökfria patienter som uppfyllde DSM-IV diagnostiska kriterier för BD baserat på Diagnostik intervju för genetiska studier (DIG) 22 rekryterades genomgå två nasala biopsier: en biopsi förbehandling med litium och andra biopsi, efter 6 veckors daglig oral litiumterapi Dessutom måste berättigade BD patienter vara. symptomatisk för depression , baserat på scoring ≥10 av 60 i klinikern administrerade Montgomery-Åsberg Rating Scale (MADRS) 23; symptomatisk för hypomani eller mani, baseras på en värdering ≥10 av 56 om läkaren administrerade Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24,. eller ≥10 på båda MADRS och YMRS Rater-Inter-Rater koefficient överenskommelse mellan kliniker för båda skalorna är> 0,96 Efter biopsier, nervceller var Enri.rikas från OE av LCM. Efter ytterligare åtgärder för kvalitetskontroll, för att säkerställa utvinning av hög kvalitet RNA från vävnaden och neuronal anrikning, blev Real Time RT-PCR för att undersöka för- och efterbehandling expressionsnivåer av gener av intresse. De därpå följande avsnitten innehåller en beskrivning av validering av detta tillvägagångssätt, med fokus på optimering av protokollet och de strategier som tillämpades för felsökning protokollet.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: All forskning volontärer i denna studie administrerades informerade samtycke ska godkänts av Institutional Review Board of Howard University och Johns Hopkins University. Endast deltagare som samtyckt genom att underteckna informerat samtycke dokument inkluderades i studien. Studien bas för denna analys bestod av: 20 personer (12 BD och 10 kontroller, 30% män) och medelålder (sd) på 38,2 (14,1) år.
OBS: Spraya alla ytor med RNas Zap att avlägsna RNas föroreningar från glas- och plastytor.
1. Biopsi Procedur
- Spray topisk lidokain (Xylocain) vätska 4% och oximetazolin HCI 0,05% i näshålan av studien deltagaren och tillåta 15 minuter av bedövande tid.
- Blöt ½ x 3 tum kirurgiska cottonoids i en blandning av lidokain och oxymetazolin och lägg in i näshålan längs övre partiet av nässkiljeväggen och låt stå i 15 min.
- Med hjälp av en 30 ° stelnasal endoskop för att lokalisera den övre delen av näshålan, ta bort nässlemhinnan med upp bitande nasala pincett från överlägsna del av nässkiljeväggen, med flera små exemplar.
2. Beredning av Tissue Blocks
- Omedelbart före biopsi, fylla normalstor cryomolds med vävnadsfrysmedium.
- Använda autoklaveras pincett, montera färsk vävnad i frysmedium och frysa på torris. Fyll återstoden av cryoblock med frysmedium, fryst cryoblock på torris, och lagra block vid -80ºC.
3. cryosectioning
- Förbered polyetennaftalat (PEN) membranglas omedelbart före cryosectioning. Spray glasen med RNas Zap lösning för 5 min. Skölj sedan glasen i dietylpyrokarbonat (DEPC) vatten och låt lufttorka i 30 min. Aktivera torkade diabilder under UV-ljus i 30 minuter.
- Kryosektion varje block helt på 30 um. Håll glasen på torrt ice, och avsnitt fryst så mycket som möjligt. Förvara diabilder på -80 ºC vid färdig.
4. Laser-Capture Microdissection
- Börja med uttorkande diabilder omedelbart före microdissection. Låt frysta diabilder tina i 10 sek, och sedan tillämpa följande etanolserie till varje bild: 60% (2 ml, 15 sek), 80% (2 ml, 15 sek), 95% (3 ml, 25 sek), 100 % (7 ml, 60 sek).
- Vänd photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) mikroskop och inställd på följande villkor: För 10X förstoring inställd energin till 82, fokus till 74, och hastigheten till 25 - 30. För 20X förstoring, ställ in energin till 63, fokus till 67, och hastigheten till 5 - 6. Justera vid behov för att uppnå optimala klippresultat.
- Identifiera visuellt nervceller som använder 20X eller 10X förstoring. Skilj den tunna ytan lukt neuron lagret från underliggande under slemhinna under ett mikroskop utan användning av färgningsproceduren. Observera nervceller som en tät columnar utseende 18.
- Använda blyerts funktion i det tidigare nämnda mikroskop i steg 4,2, spåra runt det neuronala skiktet. Trace aning bort från nervceller att förhindra bränning av nervceller från laser. Detta är nödvändigt för att erhålla hög kvalitet RNA. Då initiera laserstyrda skärning.
- Plocka upp dissekerade sektioner med hjälp fin spets microdissection pincett och sätta vävnad i ett mikrorör innehållande 100 pl lysbuffert på is. Upprepa för alla neuronala sektioner som erhållits från ett enda prov. Total dissektion tiden per prov inte överstiga 50 minuter.
- När dissektion är kompletta, omedelbart virvelprov lysat och hålla på torris. Förvara proverna vid -80ºC för total RNA isolering.
5. Isolering av Total RNA och kvalitetskontroll Analys
- Tina prov lysat på is. Utför total RNA isolering med RNAqueous Micro Kit med DNas-I inaktive genom att följa tillverkarens protokoll utan modifikationer (se <strong> Figur 1). Den totala elueringsvolymen är cirka 20 l.
- Mät RNA-koncentrationen och utvärdera RNA kvalitet med RNA Integrity Number (RIN) med användning Bioanalyzer. Prover som uppfyller kvalitetskontroll kriterier i figur 2 kan användas för cDNA-syntes.
6. cDNA-syntes
- Syntetisera cDNA med en validerad kommersiellt kit (se tabell av reagenser). Utför glödgningssteget genom att kombinera 0,1 till 1,0 ng RNA (beroende på tillgänglighet) och RNas-fritt vatten till en total volym av 8 pl per rör. Tillsätt sedan en pl av oligo-d (T) 20 primer och ett pl av 10 mM dNTP-blandning per rör, för en total volym av 10 | il.
- Försiktigt virvel och centrifugera prover och härdnings prover vid 65 ° C i 5 min. Efter det att reaktionen är fullbordad omedelbart kyler prover på is.
- Bered Master Mix lösning enligt specifikationerna i tabell 1. Tillsätt sedan 9,5 μl Master Mix och 0,5 l av kommersiellt beredd omvänt transkriptas (RT) till varje rör. Tillsätt 0,5 l RNas-fritt vatten för att styra röret istället för RT.
- Kör en RT-reaktion med den första inkubation vid 50 ° C i 50 minuter, därefter 85 ° C under 5 min och en slutlig 4 ° C hold, med ingen reglering.
- Späd alla prover av 5x med vatten och delprov. Förvara proverna vid -80 ºC.
7. Real Time PCR - Bekräfta Neuronal Anrikning
- Förbered Master Mix lösningen enligt specifikationerna i tabell 2. Använd en intern kontroll som GAPDH. Jämför luktmarkörprotein (OMP) uttryck i microdissected vävnad med OMP uttryck i undissected vävnad för att bestämma neuronal anrikning.
OBS: OMP är en markör för lukt nervceller.
OMP sekvens: framåt, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
omvänd, 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
GAPDH sekvens: framåt, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
omvänd, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '. - Ställ in PCR plattan genom att lägga 7 pl huvudblandning i varje brunn och 3 pl cDNA.
- Centrifugera plattan under 5 min vid 300 xg (1300 rpm). Kör Real Time-PCR-reaktion med standard termiska cykel villkoren för kommersiell Supermix t.ex. SYBR GRÖNARE qPCR.
- Analysera data (se figur 2 för specifikationer).
8. Real Time PCR - uttryck av gener av intresse
- Utför på prover som visar neuronal anrikning av 2 gånger eller mer.
- Förbered Master Mix på is för varje sond (FAM-märkt sond av intresse och VIC-märkt GAPDH) i separata rör enligt specifikationerna i tabell 3.
- Inrätta en PCR platta med 8 pl Master Mix i varje brunn och 2 pl cDNA.
- Centrifugera plattan under 5 min vid 300 xg (1300 rpm). Kör Real Time-PCR-reaktion med hjälp av defAult termiska cyklingsförhållanden enligt det genuttryck Master Mix-protokoll som tillhandahålls av tillverkaren. Analysera uttrycks resultat (se figur 2 för specifikationer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet och felsökningsstrategi i studiet av molekylära signaturer framgångsrikt optimeras. RNA kvalitet och neuronala kriterier anriknings för prover som ska användas i längre nedströms realtid-PCR-analys var standardiserade. RIN och RNA-koncentrationen undersöktes som confoundingfaktorer till upptäckta uttrycksnivåer. Baserat på en analys av flera prover med Rins sträcker 1-10, bestämdes det att en minimi RIN på ~ 3.0 och uppåt är tillräcklig för nedströms analys i denna studie. Som ett resultat, blev RNA kvantitet för cDNA-syntes standardiserad till 1,0 ng. Således högkvalitativa prover med RIN ovanför ~ 3.0 och RNA mängden 1,0 ng omvandlades till cDNA. Prover med 0,1-1,0 ng RNA kan användas om en adekvat urvalsstorleken är svårt att få.
Neuronal anrikning bekräftades med hjälp realtid-PCR-analys. OMP genuttryck nivåer i microdissected prover jämfördes med de i undissected provs för att bestämma om den neuronala skiktet berikas. Microdissected prover med två gånger eller större OMP uttryck jämfört med icke-dissekeras vävnad används.
Därför genom att tillämpa dessa kriterier, genomförbarheten av den föreslagna metoden för att studera molekylära förändringar i OE neuroner validerade. Figur 3 illustrerar att uttrycksnivåer av GSK-3β påverkas av litium snarare än av icke-specifika yttre faktorer, vilket indikerar att denna metod är tillräckligt för att påvisa specifika molekylära förändringar före och efter litiumbehandling. Mer specifikt, kan förändringar av molekylära signaturer i samband med litiumbehandling svar i BD åtgärdas genom att kombinera denna molekylära data med kliniska data.
Figur 1. RNA-extraktion och DNas Inaktive protokoll. Den flowchart illustrerar förfarandet för att extrahera RNA från prover efter LCM. Total RNA elueras två gånger för att ge en maximal RNA volym på cirka 20 l. Eluerade prover genomgår sedan DNas behandling för DNas inaktive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Protokoll Sammanfattning. Denna siffra sammanfattar hela protokollet för studieexperiment. Nasal vävnad först biopsier och frysas så cryoblocks. Efter sektione av vävnaden, är de neuronala skikten dissekeras med hjälp LCM. RNA-extraktion och DNas inaktive utförs med tillverkarens anvisningar (se figur 1). Prover som uppfyller kriterierna för kvalitetskontroll (RIN och RNA kvantitet) används för att syntetisera cDNA och ossed för neuronal analys anrikning. Berikade prover används i realtid-PCR-analys med de önskade målen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. GSK-3β Uttryck i BD och kontrollprover. Denna figur illustrerar förändringarna i GSK-3β uttrycksnivåer i BD prover före och efter litiumbehandling och konsekvens i GSK-3β uttrycksnivåer i kontrollprover mellan den första och andra biopsi. Sammantaget visar dessa data att GSK-3β uttryck påverkas av litium snarare än icke-specifika yttre faktorer.
| Reagens | Volym |
| 10 x RT-buffert | 2 | il |
| 25 mM MgCb | 4 il |
| 0,1 M DDT | 2 | il |
| RNas Out | 0,5 | il |
| Superscript III | 0,5 | il |
| RNas fritt vatten | 1 il |
Tabell 1. cDNA Synthesis Master Mix Solution.
| Reagens | x1 | x (# av prover) |
| Templat-DNA | 3 il | - |
| SYBR Green | 5 pl | |
| Primer Mix | 0,8 | il | |
| Vatten | 1,2 | il | |
| Totalt | 10 | il | - |
Tabell 2. Neuronal Anrikning PCR Master Mix Solution.
| Reagens | x1 | x (# prov / primer) |
| dWater | 2 | il | |
| Master Mix | 5 pl | |
| FAM Märkt Probe | 0,1 | il | |
| VIC märkta proben | 0,5 | il | |
| cDNA | 2 | il | - |
Tabell 3. Mål PCR Master Mix.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ny plattform för att erhålla anrikade lukt neuronala lager genom att kombinera nasal biopsi och LCM presenteras och har validerats i denna studie. Denna teknik kan ha omfattande konsekvenser. Den kan tillämpas mot biomarkörer studier, även sådana för behandlingssvar, och läkemedelsforskning insatser för andra neuropsykiatriska tillstånd, vilket gör en bredare genomslag i fält.
För att få hög kvalitet nervceller mottagliga för tillämpningar efter, måste några kritiska och felsökningssteg noteras. För det första, skaffa 4 - 6 stycken av lukt vävnad per patient att ha en tillräcklig provstorlek. För det andra, eftersom proverna är mottagliga för RNA nedbrytning, hålla vävnaden vid lämpliga temperaturer, arbeta med RNas gratis utrustning och ytor, använd handskar och undvik inandning direkt över prover. Om RNA kvalitet är fortfarande låg, anser slutföra microdissection inom 50 min och utföra RNA-extraktion omedelbart efter dissektion eller vortex prover omedelbart och hålla på torr is tills förvaring vid -80 ° C. För att öka utbytet av RNA, öka antalet sektioner dissekerade under LCM.
En utmaning att studera hjärnrelaterade molekylära förändringar i neuropsykiatriska störningar existerar på grund av bristande tillgänglighet för att studera den mänskliga hjärnan. Alternativa metoder inkluderar studier av perifera blodceller, obducerades hjärnor, och inducerade pluripotenta stam (iPS-celler). Blodceller kan inte representera sjukdomsassocierade neuronala förändringar. Obducerades hjärnor kan inte vara resurs för att studera dynamiska och statliga förändringar i samband med sjukdomsförloppet och reaktion på medicinering. iPS-celler kan inte direkt avspeglar tillståndsförändringar, eftersom sådana spår kan komma att raderas ut under omprogrammering och underhåll av celler. Därför fördelarna med att använda OE vävnader är förmågan att studera både statliga och dynamiska förändringar i neuronala sammanhang. Särskilt iPS härledda neuronal stamceller kan inte korrekt speglar effekten av 6 veckors litium behandling, på grund av odling och omprogrammeringar steg. Metodiken som presenteras i denna uppsats ger oss möjlighet att studera behandlingsassocierade molekylära förändringar och relatera dem till förändringar i kliniska symptom. Det bör noteras att, åtminstone för närvarande, är mängden nervceller erhållits från OE vävnader tillräckliga för studier på molekylär nivå, men kan inte begränsas till att omfatta karakteriseringen av proteiner genom immunohistokemi applikationer. Således är ytterligare tekniska förbättringar förväntas också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga finansiella relationer med kommersiella intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
- Goodwin, F. K., Jamison, K. R. Manic-depressive illness. , Oxford University Press. (1990).
- Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
- Severino, G., et al.
- Beech, R. D., et al. Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS). Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).
- Horiuchi, Y., et al. Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders. Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).
- Dryer, L., Graziadei, P. P. Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon. Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).
- Hahn, C. G., et al. In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).
- Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research. J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).
- Sawa, A., Cascella, N. G. Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia. Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).
- Mor, E., et al. MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients. Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).
- Kano, S., et al. Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia. Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).
- Toritsuka, M., et al. Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).
- Evgrafov, O. V., et al. Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders. Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).
- Fan, Y., et al. Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia. Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).
- Ishizuka, K., et al. Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test. Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).
- Sattler, R., et al. Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development. Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).
- Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations. BMC Genomics. 10, 572 (2009).
- Tajinda, K., et al. Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection. Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Fink, L., et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking. Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Nurnberger, J. I. Jr, et al. Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training. NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).
- Montgomery, S. A., Asberg, M. A new depression scale designed to be sensitive to change. Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).
- Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity. Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).
