Summary
本研究では、双極性障害（BD）で治療反応のニューロン内の分子の署名を調査する新たなプラットフォームを開発し、検証した。 BD患者から嗅上皮は、鼻の生検によって得られた。その後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、BDにおけるリチウム応答の分子署名を調査するために、リアルタイムRT PCRと組み合わせた。
Abstract
双極性障害（BD）は、あまり理解さ病態生理を伴う重度の神経精神障害であり、典型的には、気分安定剤、炭酸リチウムで処理した。動物実験ならびにヒト遺伝子研究は、リチウムがニューロンの増殖、生存および成熟に関与している分子標的に影響を与え、特にWntシグナル伝達に関与する分子ことを示している。中枢神経系（CNS）におけるリチウム応答に関連する動的な分子変化を調査するため、脳生検を得るための倫理的課題を考えると、1はこのgoal.The嗅上皮は嗅覚受容ニューロンが含まれている達成するために嗅覚組織から得られた神経細胞の使用を考慮してもよい開発およびグリア様細胞を支持する異なる段階で。これが安全に鼻の生検から得られた嗅覚組織を用い、神経精神疾患の患者のCNS中の動的な変化を研究するユニークな機会を提供します。にsubstによってもたらされる欠点を克服するために非神経細胞との生検嗅覚組織のantial汚染は、濃縮された神経細胞集団を得るための新たなアプローチは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションと鼻の生検を組み合わせることによって開発されました。本研究では、神経組織における治療関連の動的分子の変化を調査するためのシステムは、リチウム治療応答の分子機構の研究のために募集BD患者の小さなパイロットサンプルを使用し、開発し、検証した。
Introduction
双極性障害（BD）は、気分、ドライブおよび認知1における病理学的変化によって特徴付けられる深刻な神経精神障害である。 BDの治療のために使用されるリチウムは、動物試験2における多数の遺伝子の定常状態mRNAレベルを変化させることが示されているが、これらの分子のいずれかは、ヒト2における臨床応答に関連付けられている場合、それは未知のままである。リチウム応答のメカニズムを理解することは、神経組織におけるリチウム誘発性分子の変化を調査して必要になります。残念ながら、BD患者の脳生検を得るためにリチウム応答の分子シグネチャーを同定するための前および後のリチウム治療は実用的ではない。死後の脳組織はBDバイオマーカーを研究するために使用されてきたが、それらは感情、認知およびドライブの動的変化に関連する分子マーカーを評価するために使用することができない。遡及的に確認リチウム処置応答の妥当性が問題となる可能性がある4。リンパ球および他の血液細胞が有用かもしれないが、血液細胞中の分子の変化は、神経細胞の変化は3-5とは異なる場合があります。脳脊髄液は、疾患関連および投薬可逆固有の変更を反映することができる細胞内分子の情報を取得するには不十分であり得る。
嗅上皮（OE）は、大脳辺縁系の構造6に発生学的に関連した、中枢神経系（CNS）の固有の部分である。そしてそれは、鼻の生検を通じて簡単にアクセスできます。これは、で構成されていグリアのような開発7-9の異なる段階で（ すなわち、sustentacular）細胞は、基底増殖細胞、および嗅覚受容ニューロンを支援する。したがって、OEはアクセス可能に神経精神疾患7の患者のCNS 中の動的な変化を研究するユニークな機会を提供します。研究では、それらのOCCを反映疾患に関連するイベントを調査するための代用組織としてOEの有用性を実証している脳の神経細胞8,9にurring。例えば、研究は、精神状態10〜14に関連する分子のプロファイルを調査するためにOEを利用している。嗅覚系はまた、統合失調症15症の陰性症状に関連付けられている匂い赤字などの臨床endophenoytpesを識別するのに役立つ。さらに、神経発達のプロセスは、精神状態8,9の根底にある病態生理をモデル化するための有用な手段を提供し、生涯を通じてOEで続ける。
しかし、この組織の使用の欠点は、非神経細胞16と嗅覚検の実質的な汚染である。例えば、以前のOE研究において遺伝子発現研究のために使用された全RNAは、非神経細胞17からのRNAを含む全体の鼻生検組織から抽出したRNAを含有した。したがって、従来のアプローチは、細胞の品質によって制限されている。この問題を克服するために、新規なアプローチが取得するレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）で鼻生検を組み合わせることにより、神経細胞集団を富化18が開発されている。
LCMは、赤外線レーザー19-21と組み合わせるUVレーザー切断を用いて細胞を選択的に単離を可能にする技術である。 OEのアプローチでLCMを組み合わせることで、それによって神経細胞18の濃縮を強化する、非神経細胞によるOEのかなりの汚染を最小限に抑えることができます。また、ニューロンの層がそれによって染色する必要がなくなり、顕微鏡下粘膜下組織層から区別することができる。神経細胞型は、さらに関心7の細胞型により発現される一次抗体を使用して、他の細胞集団と区別することができる。したがって、この手順は、遺伝子発現研究、免疫組織化学および他の形態学的調査のために使用することができる、ほぼ純粋な神経細胞集団の濃縮のための容易にする方法を確立する。
ve_content ">この研究では、疾患状態および治療反応に関連した嗅覚ニューロンにおける分子変化を調査する実験プラットフォームを確立することを目指しています。この、に基づいて、BD用のDSM-IV診断基準を満たした禁煙の患者の小さなセットに対処するために遺伝学的研究のための診断面接（DIG）22が 2鼻の生検を受けることが募集されました：リチウム及び第二の生検で1生検前処理、毎日の経口リチウム療法の6週間後にまた、適格BD患者でなければなりません：。うつ病の症状を示す、モンゴメリー·アスベルグ評価尺度（MADRS）23投与臨床医に60の外≥10をスコアに基づいて、（YMRS）軽躁やマニアのための症候、ヤング·マニア評価尺度投与臨床医に56のうち、スコア≥10に基づく24;またはMADRSとYMRS両方で≥10両方のスケールの臨床医の間の合意の評価者·評価者間係数は> 0.96である生検の後、ニューロンは電子航法研究所だった。。LCMによってOEからCHED。組織及び神経富化から高品質のRNAの抽出を確実にするために、以下の追加の品質管理対策、リアルタイムRT PCRは、関心のある遺伝子の前および治療後の発現レベルを調べるために行った。その後のセクションでは、このアプローチの妥当性についての説明、プロトコルの最適化を強調し、トラブルシューティングのプロトコルを適用した戦略が含まれている。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：この研究ではすべての研究のボランティアは、ハワード大学とジョンズ·ホプキンス大学の治験審査委員会によって承認されたインフォームドコンセント文書を投与した。インフォームドコンセント文書に署名することにより同意のみの参加者は研究に登録した。この分析のための研究基盤の内訳は：20科目（12 BDと10のコントロール、30％の男性）と38.2（14.1）歳（SD）を意味する。
注：ガラスやプラスチック表面からRNaseの混入を除去するためのRNアーゼザップとすべての面をスプレー。
1.生検手順
- 調査参加者の鼻腔内に局所リドカイン（キシロカイン）液体4％、オキシメタゾリン塩酸0.05％スプレーと時間を麻痺の15分を許可する。
- リドカインとオキシメタゾリンの混合物に½×3インチの外科cottonoidsソークと鼻中隔の優れた部分に沿って鼻腔内に挿入し、15分間座ってすることができます。
- 剛性の30°の使い方鼻内視鏡は、鼻腔の上部のセクションを見つけるいくつかの小さな標本を取って、鼻中隔の優れた部分からのアップかむ鼻鉗子を使用して鼻粘膜を除去します。
組織ブロックの調製
- 生検の直前に、組織の凍結媒体と標準サイズのcryomoldsを埋める。
- オートクレーブ処理ピンセットを用いて、凍結培地中で新鮮な組織をマウントして、ドライアイスで凍結。 -80℃で凍結培地でcryoblockの残りの部分を塗りつぶし、ドライアイスでcryoblockを凍結し、店舗をブロックします。
3.凍結切片化
- 凍結切片の直前にポリエチレンナフタレート（PEN）膜のガラススライドを準備します。 5分間のRNaseザップ溶液でスライドをスプレーします。その後、ジエチル（DEPC）水にスライドをすすぎ、30分間空気乾燥してみましょう。 30分間UV光の下で乾燥したスライドをアクティブにします。
- 凍結切片それぞれが30μmの時に完全にブロックする。ドライ私にスライドしてくださいCEの、可能な限り凍結切片。完了時-80ºCで保存するスライド。
4.レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
- 直前に顕微解剖にスライドを脱水することから始めます。凍結したスライドを10秒間解凍した後、各スライドに次の一連のエタノールを適用してみましょう：60％（2ミリリットル、15秒）、80パーセント（2ミリリットル、15秒）、95％（3ミリリットル、25秒）、100 ％（7ミリリットル、60秒）。
- 、30 20X倍率の場合は、63にエネルギーを設定し、67にフォーカス - 10倍の倍率では82にエネルギーを設定し、74に着目し、スピード25：上の光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）顕微鏡を回して、以下の条件に設定とスピードに5 - 6は、最適な切断結果を得るために、必要に応じて調整します。
- 視覚20Xを使用したニューロンまたは10倍の倍率を特定する。染色手順を使用することなく、顕微鏡下で、基礎となるサブ粘膜から薄い表面嗅覚ニューロン層を区別する。密な柱状外観18として神経細胞を観察します。
- ステップ4.2で前述の顕微鏡で鉛筆機能を使用して、神経細胞の層の周囲にトレースします。レーザーからのニューロンの燃焼を防止するために、少し離れたニューロンからのトレース。これは、高品質のRNAを得るために不可欠である。その後、レーザーガイド付きカッティングを開始。
- 細い先端顕微解剖鉗子を使用して解剖セクションをピックアップし、氷上で100μlの溶解バッファーを含むマイクロチューブに組織を置く。単一のサンプルから得られた全てのニューロンのセクションのために繰り返します。サンプルあたりの総解剖時間が50分を超えてはならない。
- 解剖が完了すると、すぐにサンプル溶解物をボルテックスし、ドライアイス上に保つ。全RNA単離のために-80℃で保存するサンプル。
総RNAおよび品質管理分析の5.絶縁
- 氷上で解凍サンプル溶解物。を参照してください（変更なしで、製造業者のプロトコルに従って、DNアーゼIの不活性化とRNAqueousマイクロキット全RNA単離を実施<強い>図1）。総溶出量は約20μlです。
- RNA濃度を測定し、バイオアナライザを用いてRNA完全性番号（RIN）をRNAの品質を評価する。 図2の品質管理基準を満たす試料は、cDNA合成のために使用することができる。
6. cDNA合成
- 検証市販のキットを用いてcDNAを合成する（ 試薬の表を参照）。チューブあたり8μLの全量RNA（可用性に応じて）およびRNaseフリー水1.0 ngの - 0.1を組み合わせることにより、アニールステップを実行します。その後、10μlの総体積のために、チューブごとのミックスオリゴd（T）20プライマー1μlのと10のdNTPの1μlを添加する。
- 5分間65℃で穏やかにボルテックスし、遠心分離機のサンプルおよびアニールサンプル。反応が完了した後、直ちに氷上でサンプルを冷却する。
- 表1の仕様に応じてマスターミックス溶液を調製する。その後、9.5μを追加Lマスターミックスと各チューブに商業的に調製逆転写酵素（RT）の0.5μL。代わりにRTのチューブを制御するために、0.5μlのRNaseフリー水を追加します。
- なしサイクリングで、50分、5分、最終的な4ºCのホールドの後、85ºC、50ºCでの最初のインキュベーションとのRT反応を実行します。
- 水と分量で5回ですべてのサンプルを希釈します。 -80ºCで保存サンプル。
7.リアルタイムPCR - 神経濃縮を確認してください
- 表2の仕様に応じてマスターミックス溶液を調製する。GAPDHなど内部統制を使用してください。嗅覚マーカータンパク質（OMP）ニューロンの濃縮を決定するundissected組織中のOMP発現と顕微解剖組織における発現を比較してください。
注：OMPは嗅覚ニューロンのマーカーである。
OMPシーケンス：フォワード、5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
'、5'- CACCCTCGCCAAAGGTGA-3を逆転
GAPDHシーケンス：フォワード、5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
リバース、5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '。 - cDNAの各ウェルと3μlのマスターミックスの7μLを追加することによって、PCRプレートを設定します。
- 300 XG（1300 rpm）で5分間遠心プレート。そのようなSYBRグリーンな定量PCRなどの商用スーパーミックスに指定されたデフォルトサーマルサイクリング条件を使用してファイル名を指定して実行リアルタイム-PCR反応。
- （仕様については図2を参照）のデータを分析します。
8.リアルタイムPCR - 目的の遺伝子の発現
- 2倍以上のニューロンの濃縮を示したサンプルに実行します。
- 表3の仕様に応じて別々のチューブに各プローブ（関心のFAM標識プローブおよびVIC標識GAPDH）のために氷上でマスターミックスを調製する。
- cDNAの各ウェルと2μlの8μlのマスターミックスを用いたPCRプレートを設定します。
- 300 XG（1300 rpm）で5分間プレートを遠心。デフを用いた実時間PCR反応を実行製造業者によって提供される遺伝子発現マスターミックスプロトコルに従ってサーマルサイクリング条件をオールト。 （仕様については図2を参照）式の結果を分析します。
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Representative Results
分子サインの研究では、プロトコルおよびトラブルシューティングの戦略が成功して最適化した。 RNAの質およびさらに下流リアルタイム-PCR分析で使用するサンプルについての、ニューロン富化基準は、標準化された。 RIN及びRNA濃度は検出された発現レベルとの交絡因子として試験した。 1の範囲のRINは有するいくつかの試料の分析に基づいて - 10、上記〜3.0の最小RINは、この研究における下流の分析のために十分であることを決定した。結果として、cDNAの合成のためのRNA量は1.0 ngのに標準化した。したがって、上記のRINを有する高品質のサンプルは、〜1.0 ngの3.0およびRNA量を、cDNAに変換した。 0.1とサンプル - 十分なサンプルサイズを得ることが困難である場合、RNAの1.0 ngを使用することができる。
ニューロンの濃縮はリアルタイム-PCR分析を用いて確認した。顕微解剖サンプル中のOMP遺伝子発現レベルはundissectedサンプルのものと比較した神経細胞の層が濃縮されたかどうかを判断するためにね。非解剖組織と比較して2倍以上のOMPの発現を有する顕微解剖サンプルが使用されている。
したがって、これらの基準を適用することにより、OEニューロンにおける分子変化を研究するためのこの提案されたアプローチの実現可能性を検証した。 図3は、GSK-3βの発現レベルは、この方法論を示すリチウムによってではなく、非特異的な外因性因子によって影響されることを示してリチウムの治療前後の特定の分子の変化を検出するのに十分である。より具体的には、BDリチウム処置応答に関連する分子署名の変化は臨床データとこの分子データを組み合わせることによって対処することができる。
図1. RNA抽出およびDNase不活性化プロトコル。flowchartはLCM後のサンプルからRNAを抽出するための手順を示している。全RNAを、約20μlのRNAの最大量を得るために2回溶出される。溶出されたサンプルは、その後のDNase不活性化のためのDNアーゼI処理を受ける。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.プロトコルの概要。この図は、研究の実験のためのプロトコル全体をまとめています。鼻組織は、最初に生検とcryoblocksとして凍結されている。組織の切片の後、神経細胞の層は、LCMを使って解剖されている。 RNA抽出およびDNase不活性化は、製造業者のガイドライン（ 図1参照 ）を用いて実施される。品質管理基準を満たすサンプル（RIN及びRNA量）cDNAを、私たちを合成するために使用されている神経細胞の濃縮解析のためのED。濃縮されたサンプルは、目的のターゲットとリアルタイム-PCR解析に使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
BDとコントロールサンプル中の図3 GSK-3βの発現。この図は、第一および第二の生検の間の対照試料におけるGSK-3β発現レベルのBD試料中のGSK-3β発現レベルの変化前後のリチウム処理と一貫性を示している。まとめると、これらのデータは、GSK-3βの発現はリチウムではなく、非特異的な外因性因子によって影響されることを示している。
| 試薬 | ボリューム |
| 10×RTバッファー | 2μL |
| 25のMgCl | 4μL |
| 0.1 M DDT | 2μL |
| アーゼアウト | 0.5μL |
| スーパースクリプトIII | 0.5μL |
| RNaseを含まない水 | 1μL |
表1. cDNA合成マスターミックスソリューション。
| 試薬 | X1 | X（サンプルの＃） |
| テンプレートDNA | 3μL | - |
| SYBRグリーン | 5μL | |
| プライマーミックス | 0.8μL | |
| 水 | 1.2μL | |
| 合計 | 10μL | - |
表2.神経濃縮PCRマスターミックスソリューション。
| 試薬 | X1 | X（サンプル/プライマーの＃） |
| dWater | 2μL | |
| マスターミックス | 5μL | |
| FAM標識プローブ | 0.1μL | |
| VIC標識プローブ | 0.5μL | |
| cDNAを | 2μL | - |
表3.ターゲットPCRマスターミックス。
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Discussion
鼻の生検およびLCMを組み合わせることにより、濃縮された嗅覚神経細胞の層を得るための新しいプラットフォームは、提示され、この研究で確認されています。この技術は、広範な意味を持つことができる。これは、フィールド内のより広範な影響を与えて、治療応答を含めたバイオマーカーの研究、および他の神経精神状態のための薬物発見の試みに向けて適用することができる。
下流のアプリケーションに適して高品質のニューロンを得るためには、いくつかの重要およびトラブルシューティングの手順は、注意しなければならない。十分なサンプルサイズを持つ患者あたり嗅覚組織の6個 - まず、4を得る。サンプルはRNA分解を受けやすいので、第二に、適切な温度、RNaseを含まない機器や表面との仕事、使用手袋で組織を維持し、サンプルの上に直接吸入を避ける。 RNA品質がまだ低い場合、50分以内にマイクロダイセクションを完了することとすぐに切開またはvort後にRNA抽出を行うEXサンプルはすぐに、-80℃での保存まで、ドライアイス上に保つ。 RNAの収量を増加させるために、LCM中解剖セクションの数を増加させる。
精神神経疾患で、脳に関連する分子の変化を研究する課題は、人間の脳を研究するために、アクセシビリティの不足のために存在している。別のアプローチは、末梢血細胞の研究、剖検脳、および人工多能性幹（iPS）細胞が挙げられる。血液細胞は、疾患に関連する神経細胞の変化を表していない可能性がある。剖検脳は、疾患の進行および薬物療法に対する応答に関連ダイナミックと状態変化を研究するためのリソースにすることはできません。このようなトレースは、細胞の再プログラミングおよびメンテナンスの過程中に消去される可能性があるため、iPS細胞は、直接、状態変化を反映しないかもしれない。したがって、OE組織を使用する利点は、神経コンテキスト状態と動的変化の両方を研究する能力である。特に、IPSは神経幹を導出細胞が十分に培養および再プログラミングステップによるリチウム治療の6週間、の影響を反映していない場合があります。本論文で提示方法論は、私たちは、治療関連分子変化を研究し、臨床症状の変化にそれらを関連付けることができます。それは、少なくとも現時点では、OEの組織から得られたニューロンの量は、分子レベルでの研究のために十分であるが、免疫組織化学アプリケーションを使用して、タンパク質の特徴付けに限定されるものではないことに留意しなければならない。従って、更なる技術改良も期待されている。
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Disclosures
著者は、商業的利益との金銭的関係を報告しません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
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