Summary
En este estudio, una novedosa plataforma para investigar firmas moleculares intraneuronales de la respuesta al tratamiento en el trastorno bipolar (TB) fue desarrollado y validado. Epitelio olfativo de pacientes con TB se obtuvo a través de biopsias nasales. Entonces láser captura microdissection se combinó con Real Time RT PCR para investigar la firma molecular de la respuesta de litio en BD.
Abstract
El trastorno bipolar (BD) es un trastorno neuropsiquiátrico grave con fisiopatología mal entendida y típicamente tratado con el estabilizador del humor, carbonato de litio. Los estudios en animales así como estudios genéticos humanos indican que el litio afecta a dianas moleculares que están implicados en el crecimiento neuronal, la supervivencia y maduración, y en particular las moléculas que participan en la señalización de Wnt. Dado el desafío ético para la obtención de biopsias cerebrales para la investigación de cambios moleculares dinámicas asociadas con litio-respuesta en el sistema nervioso central (CNS), se puede considerar el uso de las neuronas olfativas obtenidas de tejidos para lograr este goal.The epitelio olfativo contiene neuronas receptoras olfativas en diferentes etapas de desarrollo y glial-como células de soporte. Esto proporciona una oportunidad única para estudiar los cambios dinámicos en el sistema nervioso central de los pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas, utilizando tejido olfativo obtenido con seguridad a partir de biopsias nasales. Para superar el inconveniente planteado por substcontaminación antial de tejido olfativo biopsia con las células no neuronales, un enfoque novedoso para obtener poblaciones celulares enriquecidas neuronal fue desarrollado mediante la combinación de biopsias nasales con láser de microdisección de captura. En este estudio, un sistema para la investigación de tratamiento asociada a los cambios moleculares dinámicas en el tejido neuronal fue desarrollado y validado, utilizando una pequeña muestra piloto de pacientes BD reclutados para el estudio de los mecanismos moleculares de la respuesta al tratamiento de litio.
Introduction
El trastorno bipolar (BD) es un trastorno neuropsiquiátrico grave, caracterizada por cambios patológicos en el estado de ánimo, la unidad 1 y la cognición. El litio se utiliza para el tratamiento de BD se ha demostrado que altera los niveles de estado estacionario de ARNm de un gran número de genes en estudios con animales 2, pero se desconoce si alguna de estas moléculas se asocia con la respuesta clínica en los seres humanos 2. Entender el mecanismo de respuesta de litio requeriría investigar cambios moleculares inducida por litio en los tejidos neuronales. Desafortunadamente, no es práctico para obtener biopsias cerebrales de los pacientes BD pre y post-tratamiento de litio para identificar firmas moleculares de respuesta de litio. Los tejidos del cerebro post mortem se han utilizado para estudiar biomarcadores en BD, sin embargo, no pueden ser utilizados para evaluar marcadores moleculares asociados con cambios dinámicos en las emociones, la cognición y la unidad; y la validez de la respuesta al tratamiento de litio retrospectivamente comprobada puede ser problemático 4. Los linfocitos y otras células sanguíneas podrían ser útiles, pero los cambios moleculares en las células sanguíneas pueden no reflejar alteraciones neuronales 3-5. El líquido cefalorraquídeo puede ser insuficiente para obtener información sobre las moléculas intracelulares que pueden reflejar cambios intrínsecos asociados a la enfermedad y la medicación reversible.
El epitelio olfatorio (OE) es una parte única del sistema nervioso central (SNC), relacionado embrionarias a las estructuras límbicas 6; y es fácilmente accesible a través de biopsias nasales. Consiste en la glía como células de soporte células (es decir, sustentaculares), basales proliferantes, y las neuronas olfativas del receptor en diferentes etapas de desarrollo 7.9. Por lo tanto, la OE ofrece una oportunidad única para estudiar accesible cambios dinámicos en el sistema nervioso central de los pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas 7. Los estudios están demostrando la utilidad de la OE como un tejido sustituto para la investigación de los casos de enfermedad asociada que reflejan esos occurring en las neuronas cerebrales 8,9. Por ejemplo, los estudios han utilizado OE para investigar los perfiles moleculares asociados con trastornos psiquiátricos 10-14. Sistema olfativo también sirve para identificar endophenoytpes clínicos tales como déficits olor que están asociados con síntomas negativos de la esquizofrenia 15. Además, los procesos de desarrollo neurológico continúan en el entorno operativo durante toda la vida, proporcionando una vía útil para modelar la fisiopatología subyacente de condiciones psiquiátricas 8,9.
Sin embargo, un inconveniente del uso de este tejido es la contaminación sustancial de biopsias olfativas con células no neuronales 16. Por ejemplo, el ARN total se utiliza para estudios de expresión génica en estudios previos OE contenía ARN extraído de la totalidad de la biopsia de tejido nasal incluyendo ARN de las células no neuronales 17. Por lo tanto, los enfoques anteriores se han limitado por la calidad de las células. Para superar este problema, un enfoque novedoso para obtener poblaciones de células neuronales enriquecidos mediante la combinación de las biopsias nasales con láser captura microdissection (LCM) se ha desarrollado 18.
LCM es una técnica que permite el aislamiento selectivo de células por medio de corte por láser UV en combinación con láser de infrarrojos 19-21. La combinación de LCM con el enfoque OE minimiza la contaminación sustancial de OE por las células no neuronales, mejorando así el enriquecimiento de las células neuronales 18. Además, la capa neuronal se puede distinguir de la capa submucosa bajo un microscopio, eliminando así la necesidad de tinción. Tipos de células neuronales además se pueden distinguir de otras poblaciones de células utilizando anticuerpos primarios que se expresan por el tipo de célula de interés 7. Por lo tanto, este procedimiento establece un método más fácil para el enriquecimiento de la población de células casi puramente neuronal que se puede utilizar para estudios de expresión génica, inmunohistoquímica y otras investigaciones morfológicas.
ve_content "> Este estudio tiene como objetivo establecer una plataforma experimental para investigar los cambios moleculares en las neuronas olfativas asociadas con estados de enfermedad y la respuesta al tratamiento. Para hacer frente a esto, un pequeño grupo de pacientes no fumadores que cumplían los criterios diagnósticos del DSM-IV para el BD basa en la Entrevista Diagnóstica para Estudios Genéticos (DIG) 22 fue reclutado para someterse a dos biopsias nasales: una biopsia pre-tratamiento con litio y la segunda biopsia, tras 6 semanas de tratamiento con litio oral diaria Además, los pacientes BD elegibles deben ser:. sintomático para la depresión , basado en anotar ≥10 de 60 en el clínico administrado Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; sintomático de hipomanía o manía, basado en una puntuación ≥10 de 56 en el clínico administrado Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. o ≥10 en ambos MADRS y YMRS coeficiente Evaluador-inter-evaluador de acuerdo entre los clínicos para ambas escalas es> 0,96 Después de biopsias, las neuronas eran enri.ched de OE por LCM. Tras las medidas adicionales de control de calidad, para garantizar la extracción de ARN de alta calidad de los tejidos y el enriquecimiento neuronal, en tiempo real RT PCR se llevó a cabo para investigar los niveles de pre y post-tratamiento de expresión de genes de interés. Las secciones siguientes contienen una descripción de la validación de este enfoque, destacando la optimización del protocolo y las estrategias que se aplicaron para solución de problemas del protocolo.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos los voluntarios de la investigación en este estudio se administraron los documentos de consentimiento informado aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Howard y la Universidad Johns Hopkins. Sólo los participantes que dieron su consentimiento mediante la firma de los documentos de consentimiento informado se inscribieron en el estudio. La base de estudio para este análisis consistió en: 20 sujetos (12 BD y 10 controles, 30% varones) y edad (sd) de 38,2 (14,1) años significa.
NOTA: Rocíe todas las superficies con RNasa Zap para eliminar la contaminación RNasa de las superficies de vidrio y plástico.
1. Procedimiento Biopsia
- Aerosol tópico lidocaína (Xylocaine) líquido 4% y oximetazolina HCl 0,05% en la cavidad nasal de la participante en el estudio y permitir 15 minutos de tiempo adormecedor.
- Remoje cottonoids quirúrgicos ½ x 3 pulgadas en una mezcla de lidocaína y oximetazolina e inserte en la cavidad nasal a lo largo de la parte superior del tabique nasal y deje reposar durante 15 minutos.
- El uso de un rígido 30 °endoscopio nasal para localizar la sección superior de la cavidad nasal, eliminar la mucosa nasal utilizando-up morder pinzas nasales desde la parte superior del tabique nasal, tomando varias muestras pequeñas.
2. Preparación de bloques de tejido
- Inmediatamente antes de la biopsia, llenar criomoldes de tamaño estándar con tejido medio de congelación.
- Con ayuda de pinzas autoclave, montar tejido fresco en el medio de congelación y congelar en hielo seco. Rellene resto de cryoblock con el medio de congelación, congelación cryoblock en hielo seco, y los bloques de tiendas a -80ºC.
3. cryosectioning
- Preparar naftalato de polietileno (PEN) portaobjetos de vidrio membrana inmediatamente antes de cryosectioning. Pulverizar portaobjetos con solución de RNasa Zap durante 5 min. Luego enjuague diapositivas en dietilpirocarbonato (DEPC) de agua y dejar secar al aire durante 30 minutos. Activar diapositivas secas bajo luz UV durante 30 minutos.
- Cryosection cada bloque enteramente a 30 micras. Mantenga diapositivas sobre i secoCE y secciones congeladas tanto como sea posible. Diapositivas Almacenar a -80 ºC al finalizar.
Microdissection 4. Laser-Capture
- Comience por deshidratación de diapositivas inmediatamente antes de microdisección. Deje diapositivas congelados descongelar durante 10 segundos y, a continuación, aplicar la siguiente serie de etanol a cada diapositiva: 60% (2 ml, 15 seg), el 80% (2 ml, 15 seg), el 95% (3 ml, 25 seg), 100 % (7 ml, 60 sec).
- Gire la microscopía de localización fotoactivado (PALM) microscopio y ajuste a las siguientes condiciones: Para 10X establecer la energía a 82, se centran a 74, y la velocidad a 25 - 30. Por 20 aumentos, ajuste la energía a 63, se centran a 67, y la velocidad a 5 - 6. Realice los ajustes necesarios para obtener resultados óptimos de corte.
- Visualmente identificar neuronas usando 20X o 10X. Distinguir la capa de neurona olfativa superficie delgada de subyacente submucosa bajo un microscopio sin el uso de procedimiento de tinción. Observar las neuronas como un aspecto columnar densa 18.
- Uso de la función de lápiz en el microscopio antes mencionado en el paso 4.2, trace alrededor de la capa neuronal. Traza un poco lejos de las neuronas para evitar la quema de las neuronas de láser. Esto es esencial para la obtención de ARN de alta calidad. A continuación, inicie láser guiada de corte.
- Recoge secciones disecados utilizando fórceps microdisección de punta fina y poner los tejidos en un microtubo que contiene 100 l de tampón de lisis en hielo. Repita para todas las secciones neuronales obtenidas de una sola muestra. Tiempo disección total por muestra no debe exceder de 50 min.
- Una vez que la disección es completos, inmediatamente lisados vórtice y mantener en hielo seco. Almacene las muestras a -80 ° C para el aislamiento de ARN total.
5. Aislamiento de ARN total y Análisis de Control de Calidad
- Lisados Descongele en el hielo. Llevar a cabo el aislamiento de ARN total con el Kit RNAqueous Micro con DNasa-I inactivación siguiendo el protocolo del fabricante sin modificaciones (véase <strong> Figura 1). El volumen de elución total es de aproximadamente 20 l.
- Medir la concentración de ARN y evaluar la calidad del ARN con número de integridad del ARN (RIN) usando Bioanalyzer. Las muestras que cumplen los criterios de control de calidad en la Figura 2 se pueden utilizar para la síntesis de cDNA.
6. Síntesis de ADNc
- Sintetizar ADNc usando un kit comercial validado (véase la Tabla de los reactivos). Realizar la etapa de recocido mediante la combinación de 0,1 a 1,0 ng de ARN (dependiendo de la disponibilidad) y RNasa libre de agua hasta un volumen total de 8 l por tubo. A continuación, añadir 1 l de oligo d (T) 20 primer y 1 l de dNTP 10 mM de la mezcla por tubo, para un volumen total de 10 l.
- Gently muestras vórtice y centrífuga y muestras de recocido a 65 ° C durante 5 min. Una vez completada la reacción, las muestras inmediatamente frescas en hielo.
- Prepare la solución de mezcla maestra de acuerdo a lo especificado en la Tabla 1. A continuación, añadir 9,5 μl mezcla maestra y 0,5 l de la transcriptasa inversa preparados comercialmente (RT) a cada tubo. Añadir 0,5 RNasa libre de agua l para controlar tubo en lugar de RT.
- Ejecutar una reacción RT con la primera incubación a 50 ºC durante 50 min, a continuación, 85 ºC durante 5 min y una retención final de 4 ºC, sin montar en bicicleta.
- Diluir todas las muestras de 5x con agua y alícuota. Almacene las muestras a -80 ºC.
7. PCR en tiempo real - Confirmación Neuronal Enriquecimiento
- Preparar la solución de mezcla maestra de acuerdo a las especificaciones de la Tabla 2. Utilice un control interno como GAPDH. Comparar la expresión olfativa proteína marcadora (OMP) en el tejido microdissected con la expresión de OMP en el tejido no seccionada para determinar el enriquecimiento neuronal.
NOTA: OMP es un marcador de las neuronas olfativas.
OMP secuencia: adelante, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
revertir, 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
Secuencia GAPDH: adelante, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
revertir, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '. - Establecer placa de PCR añadiendo 7 l de mezcla maestra en cada pocillo y 3 l de cDNA.
- Placa Centrifugar durante 5 min a 300 xg (1.300 rpm). Ejecutar reacción en tiempo real-PCR utilizando los ciclos térmicos condiciones predeterminadas especificadas para Supermix comercial como SYBR más verde qPCR.
- Analizar los datos (ver Figura 2 para las especificaciones).
8. PCR en tiempo real - La expresión de genes de interés
- Realizar en muestras que muestran enriquecimiento neuronal de 2 veces o más.
- Prepare la mezcla maestra en hielo para cada sonda (sonda FAM-etiquetados de interés y etiquetados en el CIV GAPDH) en tubos separados de acuerdo a lo especificado en la Tabla 3.
- Configurar una placa de PCR con mezcla maestra 8 l en cada pocillo y 2 l de cDNA.
- Centrifugar la placa durante 5 min a 300 xg (1.300 rpm). Ejecute reacción en tiempo real-PCR utilizando la default ciclos térmicos condiciones como por el protocolo de mezcla maestra de expresión génica proporcionado por el fabricante. Analizar los resultados de expresión (véase la Figura 2 para las especificaciones).
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Representative Results
La estrategia de protocolo y la solución de problemas en el estudio de las firmas moleculares se han optimizado con éxito. ARN de calidad y los criterios de enriquecimiento neuronales para las muestras que se utilizan en un análisis posterior aguas abajo Tiempo real-PCR fueron estandarizados. RIN y la concentración de ARN fueron examinados como factores de confusión a los niveles de expresión detectados. Basándose en el análisis de varias muestras con RINs que van desde 1 - 10, se determinó que un RIN mínimo de ~ 3,0 y por encima es suficiente para el análisis de aguas abajo en este estudio. Como resultado, la cantidad de ARN para la síntesis de ADNc se normalizó a 1,0 ng. Por lo tanto, las muestras de alta calidad con un RIN anteriores ~ 3.0 y ARN cantidad de 1,0 ng se convirtieron en cDNA. Las muestras con 0,1 a 1,0 ng de RNA podrían ser utilizados si un tamaño de muestra adecuado es difícil de obtener.
Enriquecimiento neuronal se confirmó mediante análisis en tiempo real-PCR. OMP niveles de expresión génica en muestras microdissected se compararon con los de la muestra no seccionadas para determinar si la capa neuronal se enriqueció. Se utilizan muestras microdissected con dos veces o más en comparación con la expresión de OMP tejido no diseccionado.
Por lo tanto, mediante la aplicación de estos criterios, la viabilidad de este enfoque propuesto para el estudio de los cambios moleculares en las neuronas de OE fue validado. La Figura 3 ilustra que los niveles de expresión de GSK-3β se ven afectados por el litio en lugar de por factores exógenos no específicos, lo que indica que esta metodología es suficiente para detectar cambios moleculares específicos antes y después del tratamiento de litio. Más específicamente, las alteraciones de firmas moleculares asociados con la respuesta al tratamiento de litio en BD pueden abordarse mediante la combinación de estos datos moleculares con los datos clínicos.
Figura 1. Extracción de ARN y el Protocolo de inactivación ADNasa. El flowchart ilustra el procedimiento para la extracción de ARN a partir de muestras después de LCM. El ARN total se eluye dos veces para producir un volumen máximo de ARN de aproximadamente 20 l. Muestras eluidas luego se someten a tratamiento DNasa I para DNasa inactivación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Protocolo Resumen. Esta cifra resume todo el protocolo para los experimentos de estudio. Tejido nasal primero se realizó una biopsia y se congeló como cryoblocks. Después de la sección del tejido, las capas neuronales se disecan utilizando LCM. La extracción de RNA y DNasa inactivación se realizan utilizando las directrices del fabricante (ver Figura 1). Las muestras que cumplen con los criterios de control de calidad (RIN y la cantidad de ARN) se utilizan para sintetizar cDNA y nosotrosed para el análisis de enriquecimiento neuronal. Muestras enriquecidas se utilizan en el análisis de Time-PCR real con los objetivos deseados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. GSK-3β Expresión en BD y muestras de control. Esta figura ilustra los cambios en los niveles de expresión de GSK-3β en muestras BD antes y después del tratamiento de litio y consistencia en los niveles de expresión de GSK-3β en las muestras de control entre la primera y la segunda biopsia. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la expresión de GSK-3β se ve afectada por el litio en lugar de factores exógenos no específicos.
| Reactivos | Volumen |
| 10 x RT Buffer | 2 l |
| 25 mM de MgCl | 4 l |
| 0,1 M DDT | 2 l |
| RNasa salida | 0,5 l |
| Superíndice III | 0,5 l |
| RNasa libre de agua | 1 l |
Tabla 1. Síntesis de ADNc Maestro Solución Mix.
| Reactivos | x1 | x (# de muestras) |
| ADN molde | 3 l | - |
| SYBR Green | 5 l | |
| Mix Primer | 0,8 l | |
| Agua | 1,2 l | |
| Total | 10 l | - |
Tabla 2. Neuronal enriquecimiento PCR Master Mix Solution.
| Reactivos | x1 | x (# de muestras / imprimación) |
| dWater | 2 l | |
| Master Mix | 5 l | |
| FAM sonda marcada | 0,1 l | |
| CIV sonda marcada | 0,5 l | |
| cDNA | 2 l | - |
Tabla 3. Objetivo PCR Master Mix.
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Discussion
Una nueva plataforma para la obtención de capas neuronales olfatorios enriquecidos mediante la combinación de la biopsia nasal y LCM se presenta y se ha validado en este estudio. Esta técnica puede tener amplias implicaciones. Puede ser aplicado a los estudios de biomarcadores, incluyendo los de la respuesta al tratamiento, y los esfuerzos de descubrimiento de fármacos para otras condiciones neuropsiquiátricas, haciendo un impacto más amplio en el campo.
Para obtener neuronas de alta calidad susceptibles de aplicaciones posteriores, deben tenerse en cuenta algunos pasos críticos y solución de problemas. En primer lugar, obtener 4 - 6 piezas de tejido olfativo por paciente a tener un tamaño de muestra adecuado. En segundo lugar, ya que las muestras son susceptibles a la degradación del ARN, mantener el tejido a temperaturas adecuadas, trabajar con RNasa equipo y las superficies libres, utilizar guantes y evitar respirar directamente sobre muestras. Si la calidad del ARN es todavía baja, considere completar microdisección dentro de 50 minutos y realizar la extracción de RNA inmediatamente después de la disección o vortex muestras inmediatamente y mantener en hielo seco hasta el almacenamiento a -80 ° C. Para aumentar el rendimiento de ARN, aumentar el número de secciones disecados durante LCM.
Existe un reto de estudiar los cambios moleculares asociados al cerebro, en los trastornos neuropsiquiátricos, debido a la falta de accesibilidad para estudiar el cerebro humano. Enfoques alternativos incluyen el estudio de las células de sangre periférica, cerebros autopsias, y las células madre pluripotentes inducidas (iPS). Las células sanguíneas no pueden representar cambios neuronales asociadas con la enfermedad. Cerebros realizó la autopsia no pueden ser el recurso para estudiar los cambios dinámicos y estatales asociados con la progresión de la enfermedad y la respuesta a la medicación. células iPS pueden no reflejan directamente los cambios de estado, debido a que tales restos son susceptibles de ser borrados a cabo durante el curso de reprogramación y mantenimiento de las células. Por lo tanto, las ventajas de utilizar tejidos OE son la capacidad de estudiar tanto estatales y dinámicos cambios en el contexto neuronal. En particular, las iPS derivadas de células madre neuronalesLas células pueden no reflejar adecuadamente el efecto de 6 semanas de tratamiento con litio, debido a etapas de cultivo y de reprogramación. La metodología presentada en este trabajo nos permite estudiar los cambios moleculares asociados al tratamiento y las relacionamos con cambios en los síntomas clínicos. Debe tenerse en cuenta que, al menos en la actualidad, la cantidad de neuronas obtenidas de tejidos OE es suficiente para estudios a nivel molecular, pero no puede limitarse a la caracterización de proteínas a través de aplicaciones de inmunohistoquímica. De este modo, también se esperan nuevas mejoras técnicas.
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Disclosures
Los autores informan de las relaciones financieras con intereses comerciales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
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