Summary
In dieser Studie wurde eine neue Plattform, um intran molekulare Signaturen der Behandlungserfolg bei bipolaren Störungen (BD) zu untersuchen, wurde entwickelt und validiert. Riechepithel von BD Patienten wurde durch nasale Biopsien erhalten. Dann wurde Laser-Mikrodissektion mit Echtzeit-RT-PCR kombiniert, um die molekulare Signatur von Lithium-Antwort in BD zu untersuchen.
Abstract
Bipolare Störung (BD) ist eine schwere neuropsychiatrische Störung mit wenig verstanden Pathophysiologie und in der Regel mit der Stimmung Stabilisator, Lithiumcarbonat behandelt. Tierstudien sowie humangenetischen Studien zeigen, dass Lithium betrifft molekulare Ziele, die in neuronalen Wachstum, Überleben und die Reifung und insbesondere Moleküle im Wnt-Signalweg beteiligt beteiligt sind. Angesichts der ethischen Herausforderung Erhalt Gehirnbiopsie zur Untersuchung dynamischer molekularen Veränderungen mit Lithium-Antwort in dem Zentralnervensystem (ZNS) verbunden sind, kann man die Verwendung von Neuronen aus olfaktorischen Geweben gewonnen betrachten dies zu erreichen goal.The Riechepithel enthält olfaktorischen Rezeptorneuronen in verschiedenen Stadien der Entwicklung und glialen artigen Stützzellen. Dies bietet eine einzigartige Gelegenheit, um dynamische Veränderungen im ZNS von Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen zu studieren, mit Riechgewebe sicher von Nasen Biopsien erhalten. Um den Nachteil von subst gestellt überwindenantial Kontamination biopsiert olfaktorischen Gewebe mit nicht-neuronalen Zellen, wurde ein neuer Ansatz, um angereicherte neuronalen Zellpopulationen zu erhalten, durch Kombinieren Nasen Biopsien mit Laser-Mikrodissektion entwickelt. In dieser Studie wurde ein System zur Untersuchung der Behandlung assoziierte dynamische molekularen Veränderungen in neuronalem Gewebe entwickelt und validiert, unter Verwendung einer kleinen Pilot Probe BD Patienten für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Lithiumbehandlung Reaktion beteiligt.
Introduction
Bipolare Störung (BD) ist eine schwere neuropsychiatrische Störung, gekennzeichnet durch pathologische Veränderungen in der Stimmung, Antriebs- und Kognition 1. Lithium zur Behandlung von BD verwendet wurde gezeigt stationären mRNA-Spiegel aus einer großen Anzahl von Genen, die im Tierversuch 2 zu verändern, aber es ist nicht bekannt, wenn dieser Moleküle mit klinische Reaktion bei Menschen 2 verbunden. Verständnis des Mechanismus von Lithium Reaktion erfordern würde untersuchen Lithium-induzierten molekularen Veränderungen in neuronalen Geweben. Unglücklicherweise ist es nicht praktikabel, zu erhalten Gehirn Biopsien BD-Patienten vor und nach einer Lithiumtherapie zur molekularen Klassifizierung Lithiumantwort zu identifizieren. Post-mortem-Hirngewebe verwendet wurden, um Biomarker in BD studieren, können sie jedoch nicht verwendet werden, um molekulare Marker mit dynamischen Veränderungen der Emotionen, Kognition und fahren damit verbundenen bewerten; und die Wirksamkeit der im Nachhinein festgestellt Lithium Ansprechen auf die Behandlung kann problematisch sein 4. Lymphozyten und anderen Blutzellen nützlich sein könnte, aber molekulare Veränderungen der Blutzellen kann nicht neuronalen Veränderungen 3-5 reflektieren. Liquor kann nicht aus, um Informationen über die intrazelluläre Moleküle, die krankheitsassoziierten und Medikamente reversibel intrinsische Änderungen spiegeln kann zu erhalten.
Das Riechepithel (OE) ist ein einzigartiges Teil des zentralen Nervensystems (ZNS), um limbischen Strukturen 6 embryologically gerichtet; und es ist durch nasale Biopsien leicht zugänglich. Es besteht aus glialen artigen Stütz (dh Sustentaculum) -Zellen basalen proliferierenden Zellen und olfaktorischen Rezeptorneuronen zu verschiedenen Entwicklungsstufen 7-9. Daher sieht OE eine einzigartige Gelegenheit, zugänglich zu studieren dynamischen Veränderungen im ZNS von Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen 7. Studien zur Untersuchung der Krankheit assoziiert Ereignisse, die diese occ reflektieren demonstriert den Nutzen der OE als Ersatzgewebeurring in Gehirnneuronen 8,9. Beispielsweise haben Studien OE verwendet, um molekularen Profile psychiatrischen Erkrankung 10-14 zugeordnet untersuchen. Geruchssystem dient auch dazu, die klinische endophenoytpes wie Geruch Defiziten, die mit negativen Symptomen von Schizophrenie 15 assoziiert sind, zu identifizieren. Zusätzlich neurologische Entwicklungsprozesse in der OE weiterhin während des gesamten Lebens und stellt einen nützlichen Weg, um die zugrunde liegende Pathophysiologie von psychiatrischen Erkrankungen 8,9 modellieren.
Ein Nachteil der Verwendung dieses Gewebes ist jedoch die erhebliche Kontamination des olfaktorischen Biopsien mit nicht-neuronalen Zellen 16. Zum Beispiel werden die Gesamt-RNA für Genexpressionsuntersuchungen in früheren Studien verwendet OE enthaltenen RNA aus dem gesamten Nasen biopsierten Gewebe einschließlich RNA von nicht-neuronalen Zellen 17 extrahiert. Daher haben die bisherigen Ansätze durch die Qualität der Zellen begrenzt. Um dieses Problem zu überwinden, um einen neuen Ansatz zu erhalten angereicherten neuronalen Zellpopulationen durch Kombinieren Nasen Biopsien mit laser Mikrodissektion (LCM) entwickelt worden 18.
LCM ist eine Technik, die für die selektive Isolierung von Zellen unter Verwendung von UV-Laserschneiden in Kombination mit Infrarotlaser 19-21 ermöglicht. Kombinieren LCM mit OE Ansatz minimiert erhebliche Kontamination OE von nicht-neuronalen Zellen, wodurch die Anreicherung von neuronalen Zellen 18. Darüber hinaus kann das neuronale Schicht von der Submukosa-Schicht unter einem Mikroskop zu unterscheiden, wodurch die Notwendigkeit für die Färbung eliminiert. Neuronale Zelltypen weiter von anderen Zellpopulationen unter Verwendung von primären Antikörpern, die von der interessierenden Zelltyp exprimiert 7 unterschieden werden. Daher wird in diesem Verfahren eine einfachere Methode zur Anreicherung von fast rein neuronalen Zellpopulation, die für Genexpressionsstudien, Immunhistochemie und andere morphologische Untersuchungen verwendet werden kann.
ve_content "> Diese Studie zielt darauf ab, eine experimentelle Plattform zu molekularen Veränderungen in Riechzellen mit Krankheitszuständen und Ansprechen auf die Behandlung verbunden untersuchen zu schaffen. Zur Lösung dieses Problems eine kleine Gruppe von Nichtraucher-Patienten, die die DSM-IV Diagnosekriterien für BD erfüllt, basierend auf die Diagnostic Interview für genetische Studien (DIG) 22 wurde eingestellt, um zwei nasale Biopsien unterziehen: eine Biopsie vor der Behandlung mit Lithium und das zweite Biopsie, nach 6 Wochen täglich oral Lithium-Therapie Darüber hinaus muss der Berechtigte BD Patienten sein. Symptome für Depressionen , auf Basis von Scoring ≥10 Stelle von 60 in den Kliniker verabreicht Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; symptomatisch für Hypomanie oder Manie, auf der Grundlage einer Partitur ≥10 von 56 auf der Kliniker verabreicht Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. oder ≥10 auf beiden MADRS und YMRS Rater-Inter-Rater Koeffizient der Vereinbarung zwischen Klinikern für beide Skalen ist> 0,96 nach Biopsien waren Neuronen enri.CHED von OE von LCM. Folgende zusätzliche Maßnahmen zur Qualitätskontrolle, zur Gewinnung hochwertiger RNA aus dem Gewebe und neuronalen Bereicherung sicherzustellen, Echtzeit RT-PCR durchgeführt, um vor und nach der Behandlung Expression von Genen von Interesse zu untersuchen. Die folgenden Abschnitte enthalten eine Beschreibung der Validierung dieses Ansatzes, Hervorhebung der Optimierung des Protokolls und die Strategien, die zur Fehlersuche das Protokoll angewendet wurden.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Alle Teilnehmerinnen und Teilnehmer in dieser Studie wurden Einwilligung Dokumente des Institutional Review Board der Howard University und der Johns Hopkins University zugelassen verabreicht. Nur Teilnehmer, die mit der Unterzeichnung der Einverständniserklärung eingewilligt Dokumente wurden in die Studie aufgenommen. Die Studie Basis dieser Analyse bestand aus: 20 Probanden (12 BD und 10 Kontrollen, 30% Männer) und Durchschnittsalter (sd) von 38,2 (14,1) Jahre.
HINWEIS: Sprühen Sie alle Oberflächen mit RNase Zap RNase Kontamination von Glas- und Kunststoffoberflächen zu entfernen.
1. Biopsie
- Spray aktuelle Lidocain (Xylocain) Flüssigkeit 4% und Oxymetazolin HCl 0,05% in der Nasenhöhle der Studienteilnehmer und lassen 15 Minuten von betäubenden Zeit.
- Genießen ½ x 3-Zoll-chirurgische cottonoids in einer Mischung aus Lidocain und Oxymetazolin und legen Sie in der Nasenhöhle sowie überlegene Teil der Nasenscheidewand und lassen Sie sie für 15 Minuten sitzen.
- Mit einem 30 ° HartNasen Endoskop, um den oberen Abschnitt der Nasenhöhle zu finden, zu entfernen Nasenschleimhaut mit bis Kauen Nasenzange von der überlegenen Teil der Nasenscheidewand, wobei mehrere kleine Proben.
2. Herstellung von Gewebeblöcke
- Unmittelbar vor der Biopsie, füllen Standardgröße cryomolds mit Gewebe Gefriermedium.
- Mit autoklaviert Pinzette, Montage frischem Gewebe im Einfriermedium einzufrieren und auf Trockeneis. Füllen Rest cryoblock mit dem Gefriermedium, Gefriert cryoblock auf Trockeneis, und speichern Blöcke bei -80 ° C.
3. Kryoschneiden
- Bereiten Polyethylennaphthalat (PEN) Membranglasobjektträger unmittelbar vor Kryoschneiden. Spray Folien mit RNase Zap-Lösung für 5 min. Dann spülen Sie Folien in Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser und der Luft trocknen lassen für 30 Minuten. Aktivieren getrockneten Folien unter UV-Licht für 30 Minuten.
- Kryoschnitt jedem Block vollständig auf 30 um. Halten Sie Folien auf trockenen ice und Abschnitte so weit wie möglich eingefroren. Objektträger bei -80 ° C nach Abschluss.
4. Laser-Mikrodissektion
- Beginnen Sie mit der Dehydratisierung Folien unmittelbar vor der Mikrodissektion. Lassen Sie gefrorene Dias Auftauen für 10 Sekunden, und dann die folgenden Ethanolreihe auf jedes Bild: 60% (2 ml, 15 sec), 80% (2 ml, 15 sec), 95% (3 ml, 25 sec), 100 % (7 ml, 60 sec).
- Schalten photoLokalisationsMikroskopie (PALM) Mikroskop auf und stellen Sie den folgenden Bedingungen: Für die 10-facher Vergrößerung setzen die Energie, um 82, konzentrieren sich auf 74, und die Geschwindigkeit auf 25 - 30 zu 20-facher Vergrößerung, stellen Sie die Energie, um 63, konzentrieren, um 67, und die Geschwindigkeit bis 5 - 6. Stellen Sie nach Bedarf, um optimale Schnittergebnisse zu erhalten.
- Visuell zu identifizieren Nervenzellen mit 20X oder 10X Vergrößerung. Unterscheiden die dünne Oberflächen olfaktorischen Neuronen Schicht aus Basisteil Schleimhaut unter einem Mikroskop ohne die Verwendung von Färbeverfahren. Neuronen beobachten, als dichte säulen Aussehen 18.
- Mit dem Stift-Funktion in der oben erwähnten Mikroskop in Schritt 4.2, Spurenelemente um die neuronale Schicht. Spuren geringfügig von Neuronen Verbrennung von Neuronen aus dem Laser zu vermeiden. Dies ist wichtig, um eine hohe Qualität RNA. Dann initiieren lasergesteuerte Schneid.
- Abholung seziert Abschnitte mit feiner Spitze Mikrodissektion Zange und legte Gewebe in einem Mikroröhrchen, die 100 & mgr; l Lysepuffer auf Eis. Wiederholen Sie dies für alle neuronalen Abschnitte aus einer Probe erhalten. Insgesamt Dissektion Zeit pro Probe sollte 50 Minuten nicht überschreiten.
- Nach Präparation abgeschlossen ist, sofort Wirbel Probe-Lysaten und auf Trockeneis zu halten. Proben bei -80 ° C für die gesamte RNA-Isolierung.
5. Isolierung von Gesamt-RNA und Qualitätskontrolle Analyse
- Thaw Probe-Lysaten auf Eis. Führen Sie die Gesamt-RNA-Isolierung mit RNAqueous Micro Kit mit DNase-I-Inaktivierung durch folgenden Herstellerprotokoll ohne Änderungen (siehe <strong> Abbildung 1). Die gesamte Elutionsvolumen beträgt ungefähr 20 & mgr; l.
- RNA-Konzentration zu messen und zu bewerten RNA-Qualität mit RNA Integrity Number (RIN) mit Bioanalyzer. Die Proben, die den Qualitätskontrollkriterien in Abbildung 2 treffen für die cDNA-Synthese verwendet werden.
6. cDNA Synthesis
- Synthetisieren cDNA mit einem validierten kommerziellen Kit (siehe Tabelle der Reagenzien). Führen der Glühschritt durch Kombinieren von 0,1 bis 1,0 ng RNA (je nach Verfügbarkeit) und RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 8 & mgr; l pro Röhrchen. Dann 1 & mgr; l Oligo-d (T) 20-Primers und 1 ul 10 mM dNTP Mix pro Röhrchen, für ein Gesamtvolumen von 10 ul.
- Vorsichtig vortexen und zentrifugieren Proben und Tempern Proben bei 65 ° C für 5 min. Nachdem die Reaktion beendet ist, sofort kühl Proben auf Eis.
- Bereiten Mastermix Lösung entsprechend den Vorgaben in der Tabelle 1. Dann fügen Sie 9,5 μl Master-Mix und 0,5 ul von kommerziell hergestellten Reverse Transkriptase (RT) in jedes Röhrchen. In 0,5 ul RNase-freies Wasser auf Rohr statt RT steuern.
- Führen Sie einen RT-Reaktion mit der ersten Inkubation bei 50 ° C für 50 min, dann 85 ° C für 5 Minuten und einer abschließenden 4 ºC halten, ohne Radfahren.
- Verdünnen Sie alle Proben, die durch 5-fach mit Wasser und aliquoten. Proben bei -80 ° C.
7. Real Time PCR - Bestätigen Neuronale Enrichment
- Bereiten Sie den Master-Mix-Lösung gemäß den Spezifikationen in Tabelle 2. Verwenden Sie eine interne Kontrolle, wie GAPDH. Vergleichen olfaktorischen Markerprotein (OMP) Ausdruck in mikrodissezierten Gewebe mit OMP-Expression in unzer Gewebe zu neuronalen Bereicherung zu bestimmen.
HINWEIS: OMP ist ein Marker für olfaktorische Neuronen.
OMP-Sequenz: vorwärts, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
umkehren, 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
GAPDH-Sequenz: vorwärts, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
umzukehren, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '. - Up PCR-Platte durch Zugabe von 7 ul des Master-Mix in jede Vertiefung und 3 ul cDNA-Set.
- Zentrifugenplatte für 5 Minuten bei 300 g (1300 rpm). Führen Sie Echtzeit-PCR-Reaktion unter Verwendung der für die kommerzielle supermix wie SYBR grüner qPCR angegebenen Standardtemperaturwechselbedingungen.
- Analyse von Daten (siehe Abbildung 2 für Daten).
8. Real Time PCR - Expression von Genen von Interesse
- Führen Sie auf Proben, die neuronale Bereicherung 2-fach oder mehr zeigen.
- Bereiten Master-Mix auf Eis für jede Sonde (FAM-markierten Sonde von Interesse und VIC-markiertem GAPDH) in getrennten Röhren nach den Vorgaben in Tabelle 3.
- Richten Sie ein PCR-Platte mit 8 ul Mastermix in jede Vertiefung und 2 ul cDNA.
- Zentrifugieren Sie die Platte für 5 Minuten bei 300 g (1300 rpm). Führen Sie Echtzeit-PCR-Reaktion mit dem defAult thermischen Wechselbedingungen nach dem vom Hersteller bereitgestellten Genexpression Mastermix Protokoll. Analysieren Ausdruck Ergebnisse (siehe Abbildung 2 für Daten).
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Representative Results
Das Protokoll und die Fehlerbehebung Strategie bei der Untersuchung von molekularen Signaturen wurden erfolgreich optimiert. RNA-Qualität und neuronalen Bereicherung Kriterien für Proben in weiter stromabwärts Echtzeit-PCR-Analyse verwendet werden, wurden vereinheitlicht. RIN und RNA-Konzentration wurden als Störfaktoren zu erfassende Expressionsniveaus untersucht. Basierend auf der Analyse von mehreren Proben mit RINs Bereich 1-10 wurde festgestellt, daß eine minimale RIN von ~ 3.0 und höher reicht für nachgeschaltete Analyse in dieser Studie. Als Ergebnis wurde die RNA Menge für die cDNA-Synthese zu 1,0 ng standardisiert. So hochwertigen Proben mit einem RIN über ~ 3,0 und RNA-Menge von 1,0 ng wurden in cDNA umgewandelt. Proben mit 0,1 bis 1,0 ng RNA verwendet werden, wenn eine ausreichende Stichprobengröße ist schwierig zu erhalten.
Neuronale Anreicherung wurde mit Echtzeit-PCR-Analyse bestätigt. OMP-Gen-Expressionsniveaus in microdissected Proben wurden mit denen in unzer Probe verglichens zu bestimmen, ob die neuronale Schicht angereichert war. Mikrodissezierten Proben mit zweifacher oder größerer OMP Expression im Vergleich zu Nicht-Gewebe präpariert werden verwendet.
Daher ist es durch Anwendung dieser Kriterien ist die Durchführbarkeit dieser vorgeschlagenen Vorgehensweise zur Untersuchung der molekularen Veränderungen in OE Neuronen validiert wurde, Fig. 3 zeigt, dass die Expressionsniveaus von GSK-3β von Lithium anstelle von unspezifischen exogenen Faktoren beeinflusst werden, was darauf hinweist, dass diese Methodik ist ausreichend, um spezifische molekulare Veränderungen vor und nach mit Lithium behandelt detektieren. Genauer können Veränderungen der molekularen Signaturen mit Lithium Behandlungserfolg bei BD zugeordnet durch Kombination dieser molekulare Daten mit klinischen Daten adressiert werden.
Abbildung 1: RNA-Extraktion und DNase-Inaktivierung Protokoll. Die flowchart veranschaulicht ein Verfahren zur Extraktion von RNA aus Proben nach LCM. Gesamt-RNA wird zweimal eluiert, um eine maximale RNA Volumen von etwa 20 ul zu ergeben. Die eluierten Proben dann DNase I-Behandlung für DNase-Inaktivierung unterzogen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Protokoll Zusammenfassung. Diese Zahl fasst das gesamte Protokoll für Studien Experimente. Nasengewebe wird zuerst biopsiert und als cryoblocks eingefroren. Nach dem Schneiden des Gewebes werden die neuronalen Schichten zerlegt mit LCM. RNA-Extraktion und DNase-Inaktivierung werden unter Verwendung von Herstellerrichtlinien (siehe Abbildung 1). Die Proben, die die Qualitätskontrolle Kriterien erfüllen (RIN und RNA-Menge) werden verwendet, um cDNA und uns zu synthetisierened für neuronale Bereicherung Analyse. Angereichert Proben werden in Echtzeit-PCR-Analyse mit den gewünschten Ziele. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. GSK-3β Expression in BD und Kontrollproben. Diese Abbildung zeigt die Veränderungen der GSK-3β-Expressionsniveaus in BD-Proben vor und nach der Lithiumbehandlung und Kohärenz in GSK-3β-Expressionsniveaus in den Kontrollproben zwischen der ersten und der zweiten Biopsie. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass GSK-3β-Expression wird durch Lithium anstatt unspezifischen exogenen Faktoren beeinflußt.
| Reagenzien | Volumen |
| 10 x RT Buffer | 2 & mgr; |
| 25 mM MgCl | 4 ul |
| 0,1 M DDT | 2 & mgr; |
| RNase Out | 0,5 ul |
| Superscript III | 0,5 ul |
| RNase-freies Wasser | 1 & mgr; |
Tabelle 1: cDNA Synthesis Master Mix-Lösung.
| Reagenzien | x1 | x (Anzahl der Proben) |
| Templat-DNA | 3 ul | - |
| SYBR Green | 5 & mgr; | |
| Primer Mix | 0,8 & mgr; | |
| Wasser | 1,2 & mgr; | |
| Gesamt | 10 & mgr; | - |
Tabelle 2. Neuronale Enrichment PCR Master Mix-Lösung.
| Reagenzien | x1 | x (Anzahl der Proben / Primer) |
| dWater | 2 & mgr; | |
| Master Mix | 5 & mgr; | |
| FAM markierten Sonde | 0,1 & mgr; | |
| VIC markierten Sonde | 0,5 ul | |
| cDNA | 2 & mgr; | - |
Tabelle 3. Ziel PCR Master Mix.
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Discussion
Eine neue Plattform für den Erhalt von angereichertem olfaktorischen Neuronen Schichten durch die Kombination von Nasen Biopsie und LCM vorgestellt und hat sich in dieser Studie bestätigt. Diese Technik kann weitverbreitete Implikationen haben. Es kann zur Biomarker-Studien, einschließlich der für die Behandlung angesprochen haben, und Arzneimittelforschung für andere neuropsychiatrische Störungen angewendet werden, so dass eine breitere Wirkung auf dem Gebiet.
Um eine hohe Qualität Neuronen zugänglich für Downstream-Anwendungen zu erhalten, muss ein paar kritische und Problembehandlungsschritte zu verzeichnen. Zum einen erhalten 4-6 Stücke von Riechgewebe pro Patient um eine ausreichende Stichprobengröße zu haben. Zweitens, da Proben sind anfällig für RNA-Abbau, halten Gewebe bei geeigneten Temperaturen, arbeiten mit RNase freie Geräte und Flächen, Schutzhandschuhe und Einatmen direkt über Proben. Wenn RNA-Qualität ist immer noch niedrig, betrachten Abschluss Mikrodissektion innerhalb von 50 Minuten, und führen Sie die RNA-Extraktion unmittelbar nach der Sektion oder vortEx Proben sofort und auf Trockeneis zu halten, bis Lagerung bei -80 ° C. Um die Ausbeute an RNA zu erhöhen, erhöhen Sie die Anzahl der Abschnitte im LCM seziert.
Eine Herausforderung des Studierens Gehirn assoziierten molekularen Veränderungen bei neuropsychiatrischen Erkrankungen existiert wegen der fehlenden Zugänglichkeit des menschlichen Gehirns zu untersuchen. Alternative Ansätze umfassen die Untersuchung von peripheren Blutzellen, obduzierter Gehirn und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Blutzellen dürfen nicht krankheitsassoziierten neuronalen Veränderungen darzustellen. Autopsie Gehirn kann nicht die Ressource sein, Dynamik und Zustandsänderungen mit dem Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf Medikamente assoziiert zu studieren. iPS-Zellen nicht direkt reflektieren Zustandsänderungen, weil solche Spuren wahrscheinlich während der Verlauf der Umprogrammierung und Erhalt von Zellen gelöscht werden. Daher sind die Vorteile der Verwendung von OE Geweben sind die Fähigkeit, beide und dynamische Änderungen des neuronalen Kontext studieren. Insbesondere iPS abgeleiteten neuronalen StammZellen nicht angemessen widerspiegeln die Wirkung von 6 Wochen nach der Lithiumbehandlung, durch die Kultivierung und Neuprogrammierung Schritte. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es uns, die Behandlung-assoziierten molekularen Veränderungen zu studieren und beziehen sie auf Veränderungen in der klinischen Symptome. Es ist zu beachten, dass, zumindest derzeit, ist die Menge der Neuronen aus OE Geweben gewonnen ausreichend für Studien auf der molekularen Ebene, kann aber nicht auf die Charakterisierung von Proteinen durch Immunhistochemie Anwendungen beschränken. Daher sind weitere technische Verbesserungen erwartet.
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Disclosures
Die Autoren berichten über keine finanziellen Beziehungen mit kommerziellen Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
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