Protocol
1. Prøvefremstilling
- Opnå prøver indeholdende luciferase-udtrykkende virus (heri VSVΔ51-Fluc som eksempel) for titrering og overførsel til 96-brønds plader. Alternativt udføre infektioner i 96-brønds vævskulturplader og betjene supernatanter direkte.
- Efterlad to kolonner ubehandlede for medtagelse af standardkurver. Til forsøg udført direkte i 96-brønds plader, titer ved slutningen af forsøget (40 timer efter infektion) eller opbevares ved -80 ° C og titer på et senere tidspunkt.
2. Udarbejdelse af vejledende Celler til virustitrering
- 24 timer før titrering, at fremstille en suspension af Vero-celler ved en koncentration på 2,5 x 10 5 celler / ml i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 30 mM HEPES og 1% penicillin / streptomycin. BEMÆRK: Selvom dette protokollen bruger Vero-celler, kan enhver egnet tolerant cellelinje til VSV-infektion be anvendes.
- Seed 2,5 x 10 4 celler (100 ul) i 96-brønds hvide faste fladbundede plader under anvendelse af en mikroplade dispenser.
- Forbered 12 ml cellesuspension pr plade plus 5 ml til priming.
- Ren mikroplade dispenser kassette ved at skylle slangen med 50 ml sterilt vand.
- Fyld mikroplade dispenser linjer med cellesuspensionen og lad 5 ml cellesuspension flyde igennem.
- Vælg et program, der vil dispensere 100 ul i hver brønd i en hvid-walled plade med 96 brønde. Dispensere og gentages efter behov for yderligere plader. Frø også et par brønde i en 96-brønds klar flad bundplade, hvis der anvendes uigennemsigtige bund hvide vægge plader til verifikation af celle sundhed og tæthed.
- Når du er færdig flush celler tilbage i den originale beholder. Rengør kassetten ved at køre 50 ml 70% ethanol efterfulgt af 50 ml varmt sterilt vand gennem slangen.
- Sørg kassette og slanger er apmæssigt rengøres mellem anvendelser.
- Cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-inkubator.
3. Forberedelse af Viral standardkurve
- Der fremstilles en standardkurve for VSVΔ51-Fluc i serumfrit DMEM, således at den endelige koncentration af plakdannende enheder (pfu) per ml efter overførsel på Vero-celler er som følger: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 pfu / ml, og 10 1 pfu / ml. Forbered 50 pi af hver koncentration pr plade af Vero-celler plus en ekstra 10%.
BEMÆRK: titer af luciferase virus bestanden vil være nødvendigt at vurdere i en klassisk måde 10 for at danne en standardkurve, der vil give mulighed for absolut kvantificering. Ellers kan opnås relativ kvantificering uden præcise titer oplysninger ved vilkårligt at fastsætte virale titer baseretved fortynding trin. For eksempel den første fortynding af standardkurven kan sættes til 10 8 virale enheder og følgende 1/10 fortynding til 10 7 og så videre. I denne forbindelse bør man udtrykke værdier som en fold-ændring i forhold til en forudbestemt prøve som absolut kvantificering vil ikke være præcis.
4. Overførsel af Sample Supernatanter på Tilladende Celler
- Check Vero celler udpladet i klar bund 96-brønds plade under et lysmikroskop for at bekræfte, at monolag er mindst 95% sammenflydende.
- Overfør 25 ul prøve supernatant på Vero-celler podet i hvide vægge plader. Overfør ikke supernatanter ind i de 2 kolonner, der er udpeget til standard kurver. BEMÆRK: Dette kan gøres samtidigt til alle brønde på en enkelt plade ved anvendelse af en 96-kanals væskehåndteringsudstyr.
- Ved anvendelse af en 8 eller 12-kanals multikanals pipette, tilsættes 25 pi af hver fortynding af standardkurven fremstillet i trin 3 til Vero-celler ide to udpegede kolonner.
- Centrifuger plader i 5 minutter ved 430 xg ved stuetemperatur.
- Der inkuberes i 5 timer ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-inkubator.
5. Vurdering af celle levedygtighed
- BEMÆRK: Når du starter fra supernatanter opnået fra infektion eksperimenter udført i klare plader med 96 brønde, kan levedygtighed prøve vurderes, før kvantificering med en celleviabilitet indikatorfarvestof såsom resazurin.
- Tilføj resazurin i en mængde svarende til 10% af mængden i hver brønd af 96-brønds plade af prøver indeholdende virus og celler. Medtag celle kun kontrollerer samt medie-kun kontrol for at bestemme værdier for 100% og 0% levedygtighed hhv.
- Efter 2-4 timer (inkubationstid vil variere afhængigt af celletypen og af koncentrationen af kommercielt tilgængelige eller rekonstituerede pulver af farvestoffet), læse og registrere signalet under anvendelse af en fluorescens-pladelæser (530-560 excitation, 590 emission). Rapport celle viability til en prøve ifølge formlen Relativ metaboliske aktivitet = ((Test prøvesignal - negativ styresignal) / (Cell kun styresignalet - negativ kontrol-signal)) x 100%
6. Fremstilling af Luciferin Substrat
- 30 minutter før afslutningen af den 5 timers inkubation, forberede luciferin at opnå en opløsning / ml 2 mg i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Forbered 2,5 ml per plade plus en ekstra 2 ml. Beskyt løsning fra lys. BEMÆRK: luciferin kan også fremstilles tidligere på dagen og opbevaret ved 4 ° C indtil brug.
7. Reading Bioluminescens
- Efter 5 timers inkubationsperiode tilsættes 25 ul luciferin til hver brønd af Vero-celler i det hvide faste plader. Tilføj luciferin manuelt eller med en automatiseret dispenser integreret i luminometeret. BEMÆRK: Brugen af et instrument med kun enkelt og slutpunkt læser kan kræve tilsætning af en luciferase kompatibel lysis bufFer før tilsætning af luciferin substrat for at forbedre sammenhængen.
- Læs plader med de følgende parametre:
- Der rystes i 5 sek.
- Vent 30 sek.
- Læs luminescens ved en passende fast følsomhed / eksponeringsværdien. Hvis indstillingen er tilgængelig på instrumentet, skal du bruge multi-point læser (fx 3 x 3 matrix) for at forbedre nøjagtigheden.
- Optag og gem kvantificerede bioluminiscerende intensitet.
- Hvis en automatiseret dispenser blev brugt til at tilføje luciferin udrense luciferinet og prime linjerne med varmt sterilt vand.
8. Dataanalyse
- Til nøjagtige resultater, løse ikke-lineær regression til at generere en Hill-ligning fra standardkurverne. Anvend denne ligning til titrerede prøver at beregne virale ekspressionssystemer enheder. Nogle vira eller situationer kan frembringe en standardkurve med en lineær sammenhæng; i dette tilfælde løse for en lineær ligning.
Representative Results
Et resumé af arbejdsgangen beskriver high-throughput metode er illustreret i figur 1. Figur 2 viser resultaterne af en typisk standardkurve ofVSVΔ51-Fluc. Fire parametre ikke-lineær regressionsanalyse genereret en Hill-plot, ukendt input pfu (estimat af virustiter) kan interpoleres. Disse estimerede titere betegnes virale ekspressionsenheder (VEU). Figur 3A viser VEUs og titere opnået ved at udføre et standard plaque-assay med de samme prøver 10. Prøver kom fra et eksperiment, hvor forskellige kemikalier blev anvendt til at øge replikation og spredning af VSVΔ51-Fluc i 786-0 celler. VEUs interpoleret fra standardkurven skal ganges med en faktor, der er baseret på fortynding af prøven supernatanter overføres på Vero-celler (i dette tilfælde, fortyndingsfaktoren er 5). Den lineære korrelation mellem titere og VEU er vist i figur 3B R2 på 0,8083 og en Pearsons r score på 0,899 (p <0,0001). I figur 4 er typiske cellecytotoksicitet data fra en metabolisk analyse vist for 786-0 celler behandlet med kemikalier før infektion med VSVΔ51-Fluc. Endelig viser figur 5 typiske standardkurver fremstillet med forskellige vira (Herpes simplex virus (HSV), vaccinia-virus og adeno-associeret virus (AAV), der alle udtrykker Firefly luciferase) og beskriver inkubationstider og fryse-tø-cykler, som det kræves.
Figur 1. Arbejdsgang af high-throughput virus titrering og cytotoksicitetsassay hjælp VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 4 Vero-celler per brønd (100 ul) og inkuberes ved 37 ° C. (B) 24hr senere overførsel 25 ul standardkurve om til Vero-celler (2 kolonner per plade). (C) Overførsel 25 ul prøver, der skal titreres til de resterende Veroceller. Centrifuge plader og inkuberes ved 37 ° C. (D) et beløb svarende til 10% af volumen i brønden, tilføjer resazurin reagens til pladen, der indeholder de oprindelige prøver. Pladerne inkuberes ved 37 ° C. (E) Efter 3 timer, læse og optage fluorescens og vurdere cytotoksicitet. (F) Efter 5 timer, tilsættes 25 ul opløsning af luciferin 2 mg / ml til hver brønd i Vero-celler. Læs luminescens og beregne Viral ekspressionsenheder.
Figur 2. Forventet standardkurve af VSV Δ 51-Fluc. Luciferaseekspression var migasured 5 timer efter supernatant overførsel på fem forskellige punkter inden for en brønd med en luminometer og bioluminescens blev udtrykt i middel relative lysenheder (RLU). Middel RLU blev afbildet mod kendt input pfu / ml til at løse ikke-lineær regression og generere en Hill-ligningen. Gennemsnittet af to replikater kurver og standard fejlsøjler er vist (R2 = 0,9993).
Figur 3. Sammenligning af standard plaque assay titere med dem, der opnås ved high-throughput metode. (A) Viral titre i pfu / ml opnået ved standard plaque-assay på Vero-celler blev sammenlignet med beregnede virale titere (VEU / ml) fra de samme prøver titrerede hjælp af high-throughput luciferaseassayet. (B) lineær sammenhæng mellem VEU / ml og titer opnået via standard plaque assay. Lineær regression kurve og determinationskoefficienten (R2) er vist.
Figur 4. Eksempel på levedygtighed. Prøve levedygtighed forud for supernatant overførsel på Vero-celler blev bestemt ved at vurdere cellulær metabolisk aktivitet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig resazurin løsning. Rå fluorescens værdier blev normaliseret til det ubehandlede, uinficerede brønde.
Figur 5. forventede standard kurver med HSV, Vaccinia, og AAV virus. Luciferaseekspression blev målt ved fem forskellige punkter inden for en brønd med en luminometer og bioluminescens blev udtrykt i middel relative lysenheder (RLU). (A) HSV standardkurve blev tilføjet på Vero-celler udpladet 24 timer tidligere med en tæthed på 2,5 x 10 4 celler per brønd (100 ul) og luciferase måling blev foretaget 17 timer efter supernantant overførsel (R2 = 0,9489, n = 1). En Hill-ligningen blev genereret ved at løse ikke-lineær regression. (B) Vaccinia standardkurve blev tilføjet på Vero-celler udpladet 24 timer tidligere en densitet på 2,5 x 10 4 celler per brønd (100 ul) og inkuberes i 2,5 timer ved 37 ° C C, hvorefter luciferase målinger blev taget (R2 = 0,9892). En lineær ligning blev genereret ved at løse for lineær regression. (C) AAV-standardkurve blev tilsat på humane lunge-carcinomceller (A549) udpladet 24 timer tidligere med en tæthed på 2,5 x 10 4 celler per brønd (100 ul) og luciferase måling blev foretaget 24 timer efter infektion. En Hill-ligningen blev genereret ved at løse ikke-lineær regression. Den gennemsnitligefem replikat kurver og standard fejlsøjler er vist (R2 = 0,9926).
Discussion
Luciferase tilgang beskrevet her giver en række fordele i forhold til andre eksisterende metoder, herunder dets lethed, hurtighed, minimal udstyr behov, og relativt lave omkostninger. En vigtig bidragyder til dette er at undgå en seriel fortynding skridt. Ikke desto mindre seriefortynding-baserede derivater af denne protokol er helt sikkert lade sig gøre, og blev for nylig anvendt til at vurdere luciferase-udtrykkende Ebola titre i en high-throughput antiviral skærm 11. Mens sagens natur mere tidskrævende og dyrere, kan sådanne tilpasninger give større dynamikområde for viral kvantificering når det er nødvendigt. Ud over at være særligt velegnet til evaluering af virale titere i forbindelse med high-throughput skærme vores ettrins-luciferase baseret viral kvantificering metode genererer nøjagtige estimater af infektiøse virioner i tilfælde af replikerende virus. Endvidere udlæsninger af luminescens sammen med cytotoksicitet data fra det samme forsøg give en merekomplet billede af virkningen af de eksperimentelle betingelser på målceller, hvilket er særligt nyttigt i forbindelse med onkolytiske virus og narkotika skærme.
Det illustrerede eksempel her anvender en replikerende negativ enkelt RNA-virus; dog kan denne protokol kan tilpasses til en række replikerende og ikke-replikerende virus med nogle mindre justeringer protokol. Dette omfatter DNA-viruser, såsom vaccinia, HSV og AAV (se figur 5). Prøver inficeret med intracellulære vira, såsom vacciniavirus for eksempel, kræver en virus-release trin forud for kvantificering (fx mindst en fryse-tø-cyklus). Ved anvendelse af denne teknik til andre vira, er det nødvendigt at optimere inkubationstiden fra overførslen af virussupernatanten eller lysatet til læsning af pladerne ved luminometeret. Denne parameter afhænger hovedsageligt af replikationscyklus virus i permissiv cellelinie og styrken af promoter kørsel luciferaseekspression. Dette gøres bedst ved hjælp af den fulde standardkurve i optimering trin. For at gøre dette, må man inficere passende eftergivende cellelinje med forskellige gentagelser af den forberedte standardkurve og læse hver replikere på et andet tidspunkt peger post-overførsel. Ideelt set en inkubationstid punkt vælges, der fører til en lineær sammenhæng mellem LOG (RLU) og log (titer) spænder over forventede prøve titer rækkevidde. For VSVΔ51-Fluc, er typisk fra 10 4 pfu / ml -10 7 pfu / ml for en 5 timers inkubationstid. Hvis lavere eller højere titre forventes fra prøver, kan man blot øge eller reducere inkubationstiden hhv. Alternativt kan prøver fortyndes til at falde inden for området meget, som der gøres typisk til ELISA.
Som nævnt ovenfor er denne fremgangsmåde velegnet til at udføre en høj-throughput drug skærme med narkotika biblioteker, da de fleste af trinene kan automatiseres. Celler kan være belagt efficiently anvendelse af en automatiseret mikroplade dispenser, kan lægemidlet bibliotek tilføjes under anvendelse af en 96-kanals væskehåndteringsudstyr kan virus tilsættes ved hjælp af en mikroplade dispenser og pladerne aflæst ved hjælp af en automatiseret luminometer. I teorien kan dette også tilpasses 384-godt eller mindre formater; Men begrænsningen med henblik herpå er antallet af celler, der kan være belagt, givet færre celler fører til et snævrere område i linearitet LOG (RLU) til at logge (titer) forhold. Endelig kan vurdering af cellelevedygtighed hjælp resazurin eller andre metaboliske farvestoffer nemt indarbejdes i arbejdsgangen, der giver mulighed for forskelsbehandling af cytostatika i antivirale skærme eller identifikation af forbindelser, der fører til synergistisk drab i kombination med virus 12. Ikke desto mindre begrænsninger ved denne metode omfatter kravet om en luciferase transgen udtrykker virus, som ikke altid er muligt, og tilgængeligheden af et tilstrækkeligt tolerant cellelinje. Det er imidlertid sandsynligt, muligt at tilpassemetoden til brug med andre reportergener (fx GFP) billede reporter kvantificeringsfremgangsmåden har en passende linearitet og signal-støj-forholdet. Alt i alt kan den beskrevne high-throughput fremgangsmåde tilpasses til mange forskellige vira og skræddersyet til forskellige anvendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1 mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96-well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J.
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
