Høy gjennomstrømming Titrering av Luciferase-uttrykke rekombinante virus

Protocol

1. Prøvepreparering

1. Innhent prøver som inneholdt luciferase-uttrykkende virus (heri VSVΔ51-Fluc som et eksempel) for titrering og overføring til 96-brønners plater. Alternativt utføre infeksjoner i 96-brønns vevskulturplater og anvender supernatanter direkte.
2. La to kolonner ubehandlede for inkludering av standardkurver. For eksperimenter gjort direkte i 96-brønners plater, titer på slutten av forsøket (40 timer post-infeksjon) eller lagres ved -80 ° C og titer på et senere tidspunkt.

2. Utarbeidelse av Tillatte Cells for Virus Titrering

1. 24 timer før titering, forberede en suspensjon av Vero-celler ved en konsentrasjon på 2,5 x 10 ⁵ celler / ml i Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 30 mM HEPES og 1% penicillin / streptomycin. MERK: Selv om denne protokollen bruker Vero celler, kan en hvilken som helst egnet givende cellelinje for VSV infeksjon be brukes.
2. Seed 2,5 x 10 ⁴ celler (100 ul) i 96-brønn flat-hvite faste bunnplatene ved hjelp av en mikrodispenser.
   1. Forbered 12 ml cellesuspensjon per plate pluss 5 ml for grunning.
   2. Ren mikroplatekassettbeholderen ved spyling av rør med 50 ml sterilt vann.
   3. Fyll mikrodispenser linjer med cellesuspensjonen, og la 5 ml av cellesuspensjonen strømme gjennom.
   4. Velg et program som vil påføre 100 mL i hver brønn av en hvit vegger 96-brønns plate. Dispensere, og gjenta ved behov for flere plater. Også frø noen brønner i en 96-brønns flatbunnet klar plate hvis ugjennomsiktige hvite bunn-vegger plater brukes for kontroll av celle helse og tetthet.
   5. Når du er ferdig, skyll cellene tilbake i originalemballasje. Rens kassetten ved å kjøre 50 ml 70% etanol etterfulgt av 50 ml varmt sterilt vann gjennom slangen.
   6. Sørg for at kassett og slangen er appropriately rengjort mellom hver bruk.
3. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 ° C i en fuktet 5% _{CO2-inkubator.}

3. Utarbeidelse av Viral Standard Curve

1. Tilbered en standardkurve for VSVΔ51-Fluc i serumfritt DMEM slik at sluttkonsentrasjonen av plakkdannende enheter (pfu) per ml etter overføring til Vero-celler er som følger: 10 ⁸ pfu / ml, 10 ⁷ pfu / ml, 10 ^6. pfu / ml, 10 ⁵ pfu / ml, 10 ⁴ pfu / ml, 10 ³ pfu / ml, 10 ² pfu / ml, og 10 ¹ pfu / ml. Forbered 50 mL av hver konsentrasjon per plate av Vero celler pluss en ekstra 10%.
   MERK: Titer av luciferase viruslager må bli vurdert i en klassisk måte ¹⁰ for å generere en standardkurve som vil gi rom for absolutt mengdebestemmelse. Ellers relativ kvantifisering kan oppnås uten presis titer informasjon ved vilkårlig sette viral titer basertom fortynning trinn. For eksempel den første fortynning av standardkurven kan settes til 10 ⁸ virale enheter og følgende fortynning 1/10 til 10 ^7, og så videre. I denne sammenheng bør man uttrykke verdier som en fold-endring i forhold til en forhåndsbestemt prøven som absolutt kvantifisering vil ikke være nøyaktig.

4. Overføring av Sample Supernatanter på Tillatte Cells

1. Kontroller Vero celler belagt i den klare bunn 96-brønns plate under et lysmikroskop for å bekrefte at monolag er minst 95% sammenflytende.
2. Overfør 25 mL av prøven supernatant på Vero-celler seeded i hvite vegger plater. Ikke overfør Supernatantene inn i to kolonner utpekt for standardkurver. MERK: Dette kan gjøres samtidig for alle brønnene på en enkelt plate ved hjelp av en 96-kanals væske behandleren.
3. Ved hjelp av en 8 eller 12 multi-kanals-kanal pipette, tilsett 25 pl av hver fortynning av standard kurve fremstilt i trinn 3 til Vero-celler ide to utpekte kolonner.
4. Sentrifuger platene i 5 min ved 430 x g ved romtemperatur.
5. Inkuber i 5 timer ved 37 ° C i en fuktet 5% _{CO2-inkubator.}

5. Vurdering av celleviabilitet

1. MERK: Når du starter fra supernatants hentet fra smitteforsøk utført i klare 96-brønners plater, kan prøve levedyktighet vurderes før kvantifisering med en celle levedyktighet indikator fargestoff som resazurin.
2. Legg resazurin i en mengde lik 10% av volumet i hver brønn av 96-brønns plate av prøver som inneholdt virus og celler. Inkludere celle-bare kontroller, så vel som medie-bare kontroll for å bestemme verdiene for 100% og 0% levedyktighet henholdsvis.
3. Etter 2-4 timer (inkubasjonstid vil variere avhengig av celletype og av konsentrasjonen av kommersielt tilgjengelige eller rekonstituerte pulver av fargestoff), lese og registrere signalet ved bruk av en fluorescens plateleser (530-560 eksitasjon, 590 emisjon). Rapporter celle viability for en prøve i henhold til formelen Relativ Metabolsk aktivitet = ((testprøvesignal - negative styresignal) / (Cell bare styre-signal - negative styresignal)) x 100%

6. Tilberedning av Luciferin substrat

1. 30 minutter før slutten av 5 timers inkubasjon, forberede luciferin for å oppnå en 2 mg / ml oppløsning i sterilt fosfatbufret saltvann (PBS). Forbered 2,5 ml per plate pluss en ekstra 2 ml. Beskytt løsning mot lys. MERK: luciferin kan også fremstilles tidligere på dagen og lagret ved 4 ° C før bruk.

7. Reading Bioluminescence

1. Etter 5 timers inkuberingsperiode, tilsett 25 pl av luciferin til hver brønn av Vero-celler i den hvite faste plater. Legg luciferin manuelt eller med en automatisk dispenser som er integrert i luminometeret. MERK: Bruk av et instrument med bare singel og sluttpunkt leser kan kreve tillegg av en luciferase kompatibel lyse buffer før tilsetning av luciferin substrat for å forbedre konsistens.
2. Les platene med følgende parametre:
   1. Rist i 5 sek.
   2. Vent 30 sek.
   3. Les luminescens ved en passende fast følsomhet / eksponeringsverdi. Hvis alternativet er tilgjengelig på instrumentet, bruke multi-point leser (f.eks 3 x 3 matrise) for å forbedre nøyaktigheten.
3. Ta opp og lagre kvantifisert bioluminescent intensitet.
4. Hvis en automatisert dispenser ble brukt til å legge luciferin rense luciferin og prime linjene med varmt sterilt vann.

8. Data Analysis

1. For å oppnå nøyaktige resultater, løser den ikke-lineære regresjon for å generere en Hill ligning fra standardkurver. Bruk denne ligningen til de titered prøver å beregne viral uttrykk enheter. Noen virus eller situasjoner kan frembringe en standardkurve med et lineært forhold; i dette tilfellet for å løse en lineær ligning.

Representative Results

Et sammendrag av arbeidsflyten som beskriver high-throughput-metoden er vist i figur 1. Figur 2 viser resultatene av en typisk standardkurve ofVSVΔ51-Fluc. Fire-parameter ikke-lineær regresjonsanalyse ga en Hill plottet som ukjente inngangs pfu (estimat av viral titer) kan interpoleres. Disse estimerte titere er betegnet virale ekspresjonssystemer heter (VEU). Figur 3A viser VeUS og titere oppnådd ved å utføre en standard plaque-analyse med de samme prøver ^10. Prøvene stammer fra et eksperiment hvor ulike kjemikalier ble brukt til å øke replikering og spredning av VSVΔ51-Fluc i 786-0 celler. VeUS interpoleres fra standardkurven må multipliseres med en faktor som er basert på fortynning av prøven supernatanter blir overført videre til Vero-celler (i dette tilfellet, er fortynningsfaktoren 5). Den lineære korrelasjonen mellom titere og VEU er vist i Figur 3B 2 av 0,8083 og en Pearsons r score på 0,899 (p <0,0001). I figur 4, er typisk celle cytotoksisitet data oppnådd fra et metabolsk assay vist 786-0 for celler behandlet med kjemikalier før infeksjon med VSVΔ51-Fluc. Til slutt, Figur 5 viser typiske standardkurver oppnådd med forskjellige virus (herpes simplex-virus (HSV), Vaccinia-virus, og adenoassosiert virus (AAV), som alle uttrykker ildflueluciferase) og beskriver inkubasjonstider og fryse-tine-sykluser, slik det kreves.

Figur 1. Arbeidsflyt av høy gjennomstrømming virus titering og Cvtotoksisitetsmålinq bruker VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 ⁴ Vero-celler per brønn (100 ul) og inkuberes ved 37 ° C (B). 24.time senere overføring 25 pl av standard kurve for å Vero-celler (2 kolonner pr plate.) (C) Overfør 25 pl av prøvene som skal målt med hensyn på gjenværende Vero-celler. Sentrifuger plater og inkuberes ved 37 ° C. (D) i en mengde lik 10% av volumet i brønnen, tilsett resazurin reagens til plate inneholdende de opprinnelige prøver. Inkuber platene ved 37 ° C. (E) Etter 3 timer, lese og registrere fluorescens og vurdere cytotoksisitet. (F) Etter 5 timer, tilsett 25 pl av 2 mg / ml løsning av luciferin til hver brønn av Vero-celler. Les luminescens og beregne Viral Expression Units.

Figur 2. Forventet standardkurve for VSV Δ 51-Fluc. Luciferase uttrykk var megasured 5 timers innlegg supernatant overføring på fem forskjellige punkter i en brønn med luminometer og bioluminescens ble uttrykt i gjennomsnittlig relative lysenheter (RLU). Midlere RLU ble plottet mot kjente inngangs pfu / ml for å løse ikke-lineær regresjon, og generere en Hill ligningen. Gjennomsnittet av to replikere kurver og standard feilfelt er vist (r ² = 0,9993).

Figur 3. Sammenligning av standard plaque analyse titere med de som oppnås ved high-throughput-metoden. (A) Viral titere i pfu / ml, oppnådd ved standard plaque analyse på Vero-celler ble sammenlignet med beregnede virale titere (VEU / ml) fra de samme prøvene titrert ved hjelp av high-throughput luciferase-assay. (B) lineært forhold mellom VEU / ml og titer innhentet via standard plaque assay. Lineær regresjon kurve og koeffisienten (R ²⁾ er vist.

Figur 4. Eksempel på levedyktighet. Prøve levedyktighet før supernatant overføring på Vero-celler ble bestemt ved å vurdere cellulær metabolsk aktivitet ved bruk av en kommersielt tilgjengelig løsning resazurin. Rå fluorescens-verdier ble normalisert til ubehandlede, infiserte brønner.

Figur 5. Forventet standardkurver med HSV, Vaccinia, og AAV virus. Luciferase uttrykk ble målt ved fem forskjellige punkter i en brønn med luminometer og bioluminescens ble uttrykt i gjennomsnittlig slektnitive lysenheter (RLU). (A) HSV standardkurve ble tilsatt til Vero-celler belagt 24 timer tidligere med en tetthet på 2,5 x 10 ⁴ celler pr brønn (100 ul), og luciferase måling ble gjort 17 timer etter supernantant overføring (R ² = 0,9489, n = 1). En Hill ligning ble generert ved å løse den ikke-lineære regresjon (B). Vaccinia standardkurve ble tilsatt til Vero-celler belagt 24 timer tidligere en tetthet på 2,5 x 10 ⁴ celler pr brønn (100 ul) og inkubert i 2,5 timer ved 37 ° C, hvoretter luciferase målinger ble tatt ^(R2 = 0,9892). En lineær ligning ble generert ved å løse for den lineære regresjon. (C) AAV standardkurve ble lagt inn på humane lunge-karsinom-celler (A549) belagt 24 timer tidligere med en tetthet på 2,5 x 10 ⁴ celler pr brønn (100 ul), og luciferase måling ble gjort 24-timers etter infeksjon. En Hill ligning ble generert ved å løse den ikke-lineære regresjon. Den gjennomsnittligeav fem replikere kurver og standard feilfelt er vist (R ² = 0,9926).

Discussion

Luciferase basert tilnærming beskrevet her gir en rekke fordeler i forhold til andre eksisterende metoder herunder dets brukervennlighet, hurtighet, minimal utstyr behov, og relativt lave kostnader. En viktig bidragsyter til dette er unngåelse av en seriell fortynning trinn. Likevel, seriell fortynning baserte derivater av denne protokollen er absolutt gjennomførbart, og ble nylig brukt til å vurdere luciferase-uttrykke Ebola titerne i en høy gjennomstrømming antiviral skjerm på ¹¹ tommer. Mens iboende mer tidskrevende og dyrere, kan slike tilpasninger gir større dynamisk område for viral kvantifisering når det er nødvendig. I tillegg til å være spesielt godt egnet for evaluering av virale titere i sammenheng med high-throughput-skjermer, genererer vår ett-trinns luciferase basert viral kvantifisering metode nøyaktige estimater av smittsomme virioner i tilfelle av replikerende virus. Videre er avlesninger av luminescens sammen med cytotoksisitet data fra det samme eksperiment gi et merfullstendig bilde av virkningen av de eksperimentelle betingelser på målceller, noe som er spesielt nyttig i forbindelse med onkolytiske virus og narkotika-skjermer.

Det eksempel som er vist her anvender en replikerende negativ enkeltstrenget RNA-virus; Imidlertid kan denne protokollen kan tilpasses til en rekke replikerende og ikke-replikerende virus med noen mindre protokoll justeringer. Dette inkluderer DNA-virus som Vaccinia, HSV, og AAV (se figur 5). Prøver som er infisert med intracellulære virus, slik som Vaccinia virus for eksempel krever en virus-frigjøring trinn forut for kvantifisering (f.eks, minst en fryse-tine syklus). Ved anvendelse av denne teknikken for andre virus, er det nødvendig å optimalisere inkubasjonstid fra overføring av den viral supernatant eller lysat til lesning av platene ved luminometeret. Denne parameteren vil avhenge hovedsakelig på replikasjonssyklus av viruset i permissive cellelinje og styrken av promoter kjører luciferase uttrykk. Dette gjøres best ved hjelp av den fulle standardkurve i optimaliseringstrinn. For å gjøre dette, må man infisere den aktuelle givende cellelinje med ulike duplikater av utarbeidet standardkurve og lese hver replikere på et annet tidspunkt peker post-overføring. Ideelt sett er en inkubasjonstid punkt valgt som fører til et lineært forhold mellom LOG (RLU) og LOG (titer) som strekker seg over den forventede prøve titer område. For VSVΔ51-Fluc, dette er typisk fra 10 ⁴ PFU / ml -10 ⁷ PFU / ml for en 5 timers inkubasjonstid. Dersom det forventes lavere eller høyere titere fra prøver, kan man ganske enkelt å øke eller redusere inkubasjonstiden hhv. Alternativt kan prøver fortynnes til å falle innenfor området mye som gjøres typisk for ELISA.

Som nevnt ovenfor er denne fremgangsmåte vel egnet for å utføre high-throughput narkotika-skjermer ved hjelp av legemiddelbibliotek som de fleste av fremgangsmåten kan automatiseres. Celler kan bli belagt efficiently ved hjelp av en automatisert mikroplate dispenseren, kan medikamentet biblioteket bli lagt ved hjelp av en 96-kanals væskebehandleren, kan viruset bli lagt ved hjelp av en mikroplate-dispenser, og platene leses ved hjelp av en automatisert luminometer. I teorien kan dette også være tilpasset 384-brønn eller mindre formater; imidlertid den begrensning til dette formål er antall celler som kan bli belagt, gitt færre celler fører til et smalere spekter i lineariteten til LOG (RLU) for å LOG (Titer) forholdet. Endelig kan vurdering av cellelevedyktighet ved hjelp av resazurin eller andre metabolske fargestoffer lett innkorporeres i arbeidsflyten, slik at for diskriminering av cytotoksiske forbindelser i antivirale skjermer eller identifisering av forbindelser som fører til synergistisk dreping i kombinasjon med virus ^12. Ikke desto mindre begrensninger av denne metoden inkluderer kravet om en luciferase som uttrykker transgenet viruset, som ikke alltid er mulig, og tilgjengeligheten av et tilstrekkelig ettergivende cellelinje. Det er imidlertid sannsynlig mulig å tilpassefremgangsmåten for bruk med andre rapportørgener (f.eks GFP) tilgjengelig reporteren kvantifisering metoden har en egnet linearitet og signal-til-støy-forhold. Generelt kan den beskrevne høy gjennomstrømming metoden bli endret for å passe mange ulike virus og skreddersydd for ulike bruksområder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
Fetal bovine serum	NorthBio Inc.	NBSF-701
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Prepare a 1 mM solution, pH 7.3
alamarBlue	AbD Serotec	BUF012B
D-Luciferin potassium salt	Biotium	10101-2
96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates	Corning	3917	384-well plates can also be used for higher throughput
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Monochromator microplate reader
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	96 tip manual pipetting system
Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters	Mettler Toledo	LQR-200F	Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate
Microflo	BioTek	111-206-21	Used to plate cells in a 96-well plate
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Microplate fluorometer