Summary
Kanker stamcellen (CSC) betrokken zijn bij tumor recidief vanwege chemoresistentie. Wij hebben een protocol voor selectie en uitbreiding van CSC van eierstokkanker cellijnen geoptimaliseerd. Door het behandelen van cellen met het chemotherapeutische cisplatine en kweken in een stamcel bevorderen media we verrijken voor niet-hechtende CSC kweken.
Abstract
Kanker stamcellen (CSC) worden gedefinieerd als een deelverzameling van trage fietsen en ongedifferentieerde cellen die asymmetrisch verdelen om zeer proliferatieve, invasieve genereren, en chemoresistent tumorcellen. Daarom CSC een aantrekkelijk populatie van cellen voor het therapeutisch. CSC wordt voorspeld bijdragen aan een aantal typen maligniteiten waaronder die in het bloed, hersenen, longen, maagdarmkanaal, prostaat en ovarium. Isoleren en verrijken van een tumorcel populatie voor CSC zal onderzoekers in staat om de eigenschappen, genetica, en de therapeutische respons van CSC te bestuderen. We genereerden een protocol dat reproduceerbaar verrijkt voor eierstokkanker CSC van eierstokkanker cellijnen (SKOV3 en OVCA429). Cellijnen behandeld met 20 uM cisplatine voor 3 dagen. Overlevende cellen worden geïsoleerd en gekweekt in een serumvrij medium dat stamcellen cytokines en groeifactoren. We demonstreren een verrijking van deze gezuiverde CSC door het analyseren van de geïsoleerde cellen voor known stamcel markers Oct4, NANOG en Prom1 (CD133) en celoppervlak expressie van CD177 en CD133. De CSC vertonen verhoogde chemoresistance. Deze methode voor het isoleren van CSC is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van de rol van CSCs in chemoresistance en tumor recidief.
Protocol
1 Cel Cultuur en Fluorescerende Labeling van ovariumkanker cellijnen
- Bereid SKOV3 media: McCoy medium aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS), 0,1 mM L-glutamine, 50 U / ml penicilline, en 50 ug / ml streptomycine. Aanvullen OVCA429 cellen in minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 10% FBS, 1 mM natriumpyruvaat, 0,1 mM L-glutamine, 50 U / ml penicilline, en 50 ug / ml streptomycine.
- Herhaald SKOV3 en OVCA429 cellijnen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2. Kweek cellen 40-50% confluentie.
- Genereer cellen die rood fluorescent eiwit (RFP) voor het toezicht levensvatbaarheid in vitro en in vivo.
- Om SKOV3 cellen die RFP genereren commentaar lentivirale deeltjes expressie RFP en 10 ug / ml polybreen te SKOV3 media in de afwezigheid van penicilline en streptomycine gedurende 72 uur.
- Na 72 uur, selecteert voor RFP-positieve cellen door Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) als volgt: Trypsinize RFP en non-RFP expressie brengende cellen gecentrifugeerd bij 125 g gedurende 5 min, resuspendeer cellen op 10 7 cellen / ml in PBS dat 0,1% BSA. Op een cel sorter, gebruik maken van niet-RFP cellen om de sortering parameters bepalen. Verzamel vervolgens cellen die hoge RFP met een 561 nm laser drukken.
- Indien daarentegen het lentivirale plasmide brengt een antibioticaresistentie cassette selecteren op RFP expressie brengende cellen door kweken in de juiste antibioticum (bijvoorbeeld 10 mg / ml blasticidine). OPMERKING: De hoeveelheid lentivirale deeltjes die moet worden gebruikt kan variëren per partij en per cel. Proper lentivirale titer moeten worden bepaald voor elk celtype.
2 Verrijking van kankerstamcellen
- Behandel SKOV3, SKOV3-RFP of OVCA429 cellijnen met 20 uM van cisplatine gedurende 72 uur. LET OP: Cisplatine is giftig. Gebruik beschermende kleding / handschoenen en aanraking met de huid en slijmvliezen te vermijden. Gooi cisplatine in afvalwater.
- Bereid CSC media: serumvrij DMEM / F12 medium aangevuld met 5 ug / ml insuline, 10 ng / ml humaan recombinant epidermale groeifactor (EGF), 10 ng / ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF), 12 ng / ml leukemie remmende factor , en 0,4% bovine serum albumine (BSA).
- Trypsinize cellen. Cultuur overlevende cellen in CSC media.
OPMERKING: Na 2 dagen in de cultuur niet hechtende bolletjes zal vormen. - Wijzig media elke 2 dagen door het verzamelen medium dat cellen en centrifugeren bij 125 g gedurende 5 minuten. Dan resuspendeer de pellet in vers CSC media. Controleer cellen levensvatbaarheid elke 2 dagen door het tellen cellen en het uitvoeren trypan blauw exclusie.
- Dan verzamelt CSC voor verdere experimenten door centrifugeren 129 xg gedurende 5 min en resuspenderen de pellet in fenolbevattende guanidinium thiocynate (RNA), fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl en 11,9 mM fosfaatbuffer, pH 7,4) met 0,1% BSA (voor flowcytometrie) of CSC media verderkweken van de cellen.
- Monitor CSC cel morfologie met behulp van een lichtmicroscoop bij 20x en 40x vergrotingen.
3 CSC Karakterisering via analyse van genexpressie voor Stem Cell Markers
- Verzamel 3 preparaten van CSC door het verzamelen medium dat cellen centrifugeren bij 129 g gedurende 5 min, en opnieuw suspenderen van de pellet in een oplossing van fenol bevattende guanidinium thiocynate (Andere werkwijzen voor RNA-extractie worden gebruikt).
- Bereid totaal RNA met TRIzol volgens het protocol van de fabrikant. Synthetiseren complementair DNA (cDNA) 0,1-1 ug van RNA met behulp van een commercieel verkrijgbare cDNA reverse transcriptie kit.
- Voer kwantitatieve reverse transcriptie polymerase ketenreactie (QRT-PCR).
- Make up master mix voor elke set van primers die QRT-PCR-mix, primers, en water om een totaal aan 8 ul per monster (primers met verschillende fluoroforen kunnen worden versterkt in het zelfde goed). Bijvoorbeeld, generereneen master mix voor Oct4-FAM, NANOG-Hex, en GAPDH-CY5. Genereer aparte mastermengsels voor Nestin en Prom1. Voeg 2 pi cDNA matrijs per monster.
OPMERKING: Voor deze studie werd QRT-PCR uitgevoerd met de in tabel 1 vermelde primers. - Voer alle QRT-PCR in tweevoud voor elk monster met behulp van een real-time PCR thermocyclusinrichting opsporen van meerdere fluoroforen. Omvatten geen template controles.
- Normaliseren stamcel genexpressie tot GAPDH uitdrukking voor elk monster met behulp van de ΔΔC T-methode.
- Make up master mix voor elke set van primers die QRT-PCR-mix, primers, en water om een totaal aan 8 ul per monster (primers met verschillende fluoroforen kunnen worden versterkt in het zelfde goed). Bijvoorbeeld, generereneen master mix voor Oct4-FAM, NANOG-Hex, en GAPDH-CY5. Genereer aparte mastermengsels voor Nestin en Prom1. Voeg 2 pi cDNA matrijs per monster.
| Oct-4-FAM | Primer 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Primer 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAM sonde: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | Primer 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Primer 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEX sonde: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | Primer 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| CY5 sonde: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| Nestin-FAM | Primer 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAM sonde: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | Primer 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Primer 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| HEX sonde: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Tabel 1 Primers voor CSC karakterisering van QRT-PCR.
e_title "> 4. analyseren van CSC voor celoppervlaktemerkers CD117 en CD133- Harvest CSC door het verzamelen medium dat cellen en centrifugeren bij 125 g gedurende 5 minuten. Voeg 500 ul van een niet-proteolytisch cel onthechting oplossing opbreken cellen. Centrifugeer cellen bij 125 g gedurende 5 min naar cel onthechting oplossing te verwijderen. Was daarna de cellen tweemaal met koud PBS.
- Incubeer bij normale groeimedia 1 uur vóór labeling cellen. Spin down cellen gedurende 5 minuten bij 129 x g. Resuspendeer cellen in PBS met 0,1% BSA met anti-CD133-PE en anti-CD117-FITC.
- Fix cellen overnacht in 1% paraformaldehyde. Let op: Paraformaldehyde is giftig (verdacht carcinogeen). Maak in zuurkast en gebruik binnen een week.
- Voer flowcytometrie op CD117 ervan (met anti-CD117 geconjugeerd aan FITC) en CD133 (met anti-CD133 geconjugeerd aan PE) celoppervlakexpressie op een flowcytometer. Verzamelen van gegevens op cellen in de VT1 (voor FITC) en VT3 (voor PE) kanalen. Genereer poorten voor cellen die zowel het uitenFITC en PE. Genereer een dot plot met 4 kwadranten (FITC en PE-FITC + PE-, FITC + PE en FITC en PE + +) en wordt het aantal cellen in elk kwadrant.
5 Het analyseren van CSC voor therapeutische respons
- Plate 5000 cellen per putje (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3-CSC en SKOV3-RFP CSC) op 96-well platen overnacht.
- Behandel met cisplatine (0, 1, 10, 100, en 1000 uM) of paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1, 10, en 100 uM) gedurende 96 uur.
- Voer MTT (3 (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) cellevensvatbaarheid assay.
- Plaat 5.000 cellen per 100 ul per putje van een 96-well plaat (plaat cellen in tweevoud en omvatten media alleen de controle van putten).
- Na 24 uur, voeg 10 ul van 10 mg / ml MTT. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-4 uur (tot precipitaat vormt).
- Voeg 100 ul van MTT oplosmiddel 4 mM HCl, 0,1% NP-40 in isopropanol. Incubeer gedurende 15 minuten in het donker.
- Lees platen bij 570 nm op een plaat reader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om aan te tonen dat we geïsoleerd CSCs van epitheliale eierstokkanker cellijnen met cisplatine behandeling, we eerst verkregen beelden van de cellijnen voorafgaand aan de behandeling en na selectie. We gebruikten lichtmicroscopie om beelden van hechtende (onbehandeld) SKOV3 en OVCA429 cellen en SKOV3 en OVCA429 CSC (figuur 1) vast te leggen. CSC verschijnen rond en niet aan de weefselkweekplaten (figuren 1 en 2). We tonen verder dat SKOV3 cellen getransduceerd met RFP behouden hun fluorescentie na isolatie van de KSC tonen dat de cellen levensvatbaar zijn (Figuur 2B).
Levensvatbare CSC culturen werden beoordeeld op hun reactie op behandeling met medicijnen. CSC aangetoond van van cisplatina (vooral bij 100 uM) en paclitaxel (10 uM) (figuur 3). CSC worden vaak gekenmerkt door hun expressie van stamcellen genen. Expressie van CD133 (ook bekend als Prom1), Nestin, NANOG en Oct4 werd onderzocht. CD133 was significant geïnduceerd in SKOV3 CSC kweken vergeleken met onbehandelde (controle) cellen (Figuur 4A). CD133 werd geïnduceerd in CSC kweken vergeleken met onbehandelde controles door 16-voudige en 13-voudige in de OVCA429 en OVCA429 RFP-cellen (gegevens niet getoond). In eerste experimenten werden Oct4, nanog en Nestin verhoogd in SKOV3 CSC kweken in vergelijking met onbehandelde, maar de resultaten waren niet statistisch significant (figuur 4A). Bij het herhalen van deze experimenten Oct4 en NANOG toegenomen in SKOV3 CSC's in vergelijking met ouderlijk toezicht cellen (Figuur 4B). Oct4 werd met 4,7-voudig en 8-voudig in de OVCA429 en OVCA429-RFP cellen na CSC verrijking protocol (niet getoond). Tenslotte SKOV3 CSC vertonen verhoogde expressie op het celoppervlak van de CSC marker CD117 (Figuur 5). Samenvattend maakt deze werkwijze voor selectie van levensvatbare sferoïde CSC (expressie stamcel markers) in eierstokkankercellijnen door selectie met cisplatine en groei van stamcellen media.
Figuur 1 Morfologie van SKOV3 en OVCA429 cellen en kanker stamcellen (CSC), gekozen uit SKOV3 en OVCA429 cellen. Fase contrast microscopie toont SKOV3 en OVCA429 cellen (aanhangend) die onbehandeld zijn en zijn geselecteerd voor CSC (bolvormige).
Figuur 2 Verrijking voor CSC levert niet-hechtende sferoïden. (A) SKOV3 cellen onbehandeld en verrijkt CSC (60X vergroting). (B) SKOV3-RFP cellen die onbehandeld zijn (a en b) of verrijkt KSC (c d). Links panelen verbeelden fasecontrastbeelden en rechts panelen verbeelden fluorescentie. Originele vergroting 40X. Schaal bar = 400 micron.
Figuur 3 CSC vertonen verhoogde chemoresistance vergelijking met onbehandelde cellijnen. SKOV3 (A en B) en SKOV3-RFP (C en D), SKOV3 CSC (A en B) en SKOV3-RFP CSC (C en D) werden behandeld met verschillende concentraties cisplatine (A en C) en paclitaxel (Taxol) (B en D). 96 uur na de behandeling MTT assay werd uitgevoerd. Experimenten werden uitgevoerd in n≥3 en statistieken werden berekend met Two Way ANOVA; * P <0,05, *** p < ;. 0,0005 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur celmarker 4 Stem uitdrukking in CSC's in vergelijking met onbehandelde cellen. QRT-PCR-analyse werd uitgevoerd voor SKOV3 (controle) en SKOV3 CSC. (A) CD133 (Prom1), Nestin, NANOG en OCT4 (genormaliseerd voor GAPDH). ( B) Een extra experiment dat aantoont dat de SKOV3-RFP CSC verkregen uit dit protocol opbrengst cellen met verhoogde OCT4 en NANOG vergelijking met onbehandelde cellen. De resultaten werden genormaliseerd met GAPDH uitdrukking. N = 3 en statistieken werden berekend met behulp van studenten T-toets; ** P <0,02, *** p <0.002.
5 "fo: content-width =" 5in "src =" / files / ftp_upload / 51891 / 51891fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 5 Flowcytometrieanalyse stamcellen markers in SKOV3 cellen en SKOV3 CSC alleen of getransduceerd of zonder RFP. CD133, CD117 en CD133 / CD117 expressie in (A) SKOV3 (onbehandeld / controle) cellen (B) SKOV3 CSC, (C) SKOV3-RFP onbehandelde cellen, en (D) SKOV3-RFP CSC. Experimenten werden uitgevoerd in drievoud. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KSC die resistent zijn tegen behandeling zijn mogelijk verantwoordelijk voor het recidief na behandeling van de primaire tumor. Karakterisering van CSC kan leiden tot verbeterde therapieën voor kanker van de eierstokken. De kritische parameters in de oprichting van chemoresistent CSC's met behulp van het bovenstaande protocol worden de timing van de duur van de behandeling met chemotherapie en de concentratie van de chemotherapie. Bij het gebruik van het protocol in Ma et al. bleek dat na 7 dagen behandeling met cisplatine en paclitaxel geen levensvatbare cellen bleven 4. Door het verminderen van de behandeling 3 dagen (bij 20 uM cisplatine in plaats van 40 uM cisplatine en 10 uM paclitaxel), chemoresistent levensvatbare cellen en CSCs ontwikkeld. De lengte en de dosis van de behandeling moet worden aangepast voor verschillende eierstokkanker cellijnen.
De belangrijkste beperking van dit protocol is de lengte die de KSC levensvatbaar blijven. Met behulp van dit protocol, de CSC levensvatbaar blijven voor minder dan een week. Daarom the soorten experimenten en analysemethoden voor de CSC's moeten zorgvuldig worden getimed.
Verdere karakterisering van de CSC dient te worden uitgevoerd. Het zou nuttig zijn om de werkwijze CSC vergelijken met andere methoden CSC generatie op de overeenkomsten en verschillen tussen deze celtypes bepalen. Vergelijking van stamcel markers, respons op de behandeling, en het beste systeem voor het in vivo onderzoek moet worden gevoerd tussen de verschillende methoden voor het genereren / selectie van CSC. Er is gesuggereerd dat er verschillende types van CSC met verschillende expressie patronen van stamcel markers en verschillende prognose voor patiënten 10-12, waardoor verdere definitie van wat voor soort van CSC's worden gegenereerd door dit protocol kan helpen bepalen hoe zij betrekking hebben op de menselijke kwaadaardigheid . Tenslotte, om strikt te tonen dat de KSC geïsoleerd uit dit protocol zijn definitieve CSC cellen moeten worden geïnjecteerd in immuungecompromitteerde muizen in beperkende verdunning assay. Dezeonderzoek toont dat CSCs kunnen ovariumcarcinomen genereren bij een lage dichtheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
- Pennington, K., Pulaski, H., Pennington, M., Liu, J. R. Too Much of a Good Thing: Suicide Prevention Promotes Chemoresistance in Ovarian Carcinoma. Curr Cancer Drug Targets. 10, 575-583 (2010).
- Thigpen, T. A rational approach to the management of recurrent or persistent ovarian carcinoma. Clin Obstet Gynecol. 55, 114-130 (2012).
- Burgos-Ojeda, D., Rueda, B. R., Buckanovich, R. J. Ovarian cancer stem cell markers: prognostic and therapeutic implications. Cancer letters. 322, 1-7 (2012).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42, 593-602 (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3, 730-737 (1997).
- Alison, M. R., Lim, S. M., Nicholson, L. J. Cancer stem cells: problems for therapy. The Journal of pathology. 223, 147-161 (2011).
- Luo, X., Dong, Z., Chen, Y., Yang, L., Lai, D. Enrichment of ovarian cancer stem-like cells is associated with epithelial to mesenchymal transition through an miRNA-activated AKT pathway. Cell proliferation. 46, 436-446 (2013).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Molecular and cellular biochemistry. 363, 257-268 (2012).
- Abubaker, K., et al. Short-term single treatment of chemotherapy results in the enrichment of ovarian cancer stem cell-like cells leading to an increased tumor burden. Molecular cancer. 12, 24 (2013).
- Conic, I., Dimov, I., Tasic-Dimov, D., Djordjevic, B., Stefanovic, V. Ovarian epithelial cancer stem cells. ScientificWorldJournal. 11, 1243-1269 (2011).
- Liu, K. C., et al. Ovarian cancer stem-like cells show induced translineage-differentiation capacity and are suppressed by alkaline phosphatase inhibitor. Oncotarget. 4 (12), 2366-2382 (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncology reports. 23, 1277-1284 (2010).
