Summary
Krebsstammzellen (CSCs) in Tumorrückfall durch Chemoresistenz beteiligt ist. Wir haben ein Protokoll für die Auswahl und den Ausbau von CSCs von Eierstock-Krebszelllinien optimiert. Durch die Behandlung mit dem Chemo Zellen Cisplatin und Kultivierung in einer Stammzelle Förderung der Medien bereichern wir für nicht haft CSC Kulturen.
Abstract
Krebsstammzellen (CSCs) als Teilmenge von langsamen Radfahren und undifferenzierte Zellen, die asymmetrisch zu teilen, um hoch proliferativen, invasive erzeugen und chemoresistenten Tumorzellen definiert. Daher sind KSZ eine attraktive Population von Zellen therapeutisch zu zielen. KSZ wird vorhergesagt, zu einer Anzahl von Arten von Malignitäten einschließlich derjenigen im Blut, Gehirn, Lunge, Magen, Darm, Prostata und des Eierstocks bei. Isolierung und Anreicherung einer Tumorzellpopulation für CSCs ermöglichen es den Forschern, die Eigenschaften, Genetik und therapeutische Reaktion von CSCs studieren. Wir erzielten ein Protokoll, das reproduzierbar bereichert für Eierstockkrebs Eierstockkrebs von CSCs Zelllinien (SKOV3 und OVCA429). Zelllinien werden mit 20 uM Cisplatin für 3 Tage behandelt. Überlebende Zellen werden isoliert und kultiviert in serumfreiem Medium, das Stammzell Zytokinen und Wachstumsfaktoren. Wir zeigen eine Anreicherung dieser gereinigten CSCs durch die Analyse der isolierten Zellen für known Stammzellmarker Oct4, Nanog und PROM1 (CD133) und Zelloberflächenexpression von CD177 und CD133. Die CSCs eine erhöhte Chemoresistenz. Diese Methode zur Isolierung von CSCs ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Rolle von CSCs in Chemoresistenz und Tumorrückfall.
Protocol
1. Zellkultur und Fluoreszenzmarkierung von Eierstockkrebszelllinien
- Vorbereitung SKOV3 Medien: McCoy Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 0,1 mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin. Aufrechterhaltung OVCA429 Zellen in minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 10% FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin.
- Ausbreiten SKOV3 und OVCA429 Zelllinien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. Wachsen Zellen zu 40-50% Konfluenz.
- Erzeugen Zellen rot fluoreszierendes Protein (RFP), um die Lebensfähigkeit in vitro und in vivo zu überwachen ausdrückt.
- SKOV3-Zellen zu exprimieren, zu erzeugen RFP, fügen lentivirale Partikel RFP und 10 ug / ml Polybrene zu SKOV3 Medien exprimiert in Abwesenheit von Penicillin und Streptomycin 72 Stunden.
- Nach 72 h, wählen Sie für RFP-positiven Zellen durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) wie folgt: Trypsinize RFP und nicht-RFP-exprimierenden Zellen, Zentrifugieren bei 125 xg für 5 min Die Zellen bei 10 7 Zellen / ml in PBS mit 0,1% BSA. Auf einem Zellsortierer, verwenden Sie nicht-RFP Zellen, um die Sortierparameter zu bestimmen. Dann sammeln Zellen, die hohe RFP mit einem 561-nm-Laser auszudrücken.
- Alternativ, wenn der lentiviralen Plasmid eine antibiotische Resistenz-Kassette drückt, wählen RFP-exprimierenden Zellen durch Kultivieren in dem entsprechenden Antibiotikum (wie beispielsweise 10 mg / ml Blasticidin). HINWEIS: Die Höhe der lentivirale Partikel, die verwendet werden können, und Chargen durch Zelltyp variieren werden muss. Ordnungsgemäße lentiviralen Titer sollte für jeden Zelltyp bestimmen.
2. Anreicherung von Krebsstammzellen
- Gönnen SKOV3, SKOV3-RFP oder OVCA429 Zelllinien mit 20 uM von Cisplatin 72 Stunden. ACHTUNG: Cisplatin ist giftig. Verwenden Sie Schutzkleidung / Schutzhandschuhe und Kontakt mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. Sie Cisplatin i entsorgenn Abwasser.
- Vorbereitung CSC Medien: serumfreiem DMEM / F12-Medium mit 5 ug / ml Insulin, 10 ng / ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), 12 ng / ml Leukemia Inhibitory Factor ergänzt und 0,4% Rinderserumalbumin (BSA).
- Trypsinize Zellen. Kultur überlebenden Zellen in CSC Medien.
HINWEIS: Nach 2 Tagen in Kultur nicht haft Sphäroiden wird zu bilden. - Wechselmedien alle 2 Tage durch Sammeln Medien enthaltenden Zellen und Zentrifugation bei 125 × g für 5 min. Dann das Pellet in frischem CSC Medien. Überprüfen Zellen für die Lebensfähigkeit alle 2 Tage durch Zählen der Zellen und die Durchführung Trypanblauausschluß.
- Dann sammeln CSC für weitere Experimente durch Zentrifugation 129 g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in Phenol enthält Guanidinium thiocynate (RNA), Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 11,9 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) mit 0,1% BSA (für die Durchflusszytometrie) oder CSC Medien weiterKultivieren der Zellen.
- Überwachen CSC Zellmorphologie mit einem Lichtmikroskop bei 20facher und 40facher Vergrößerung.
3. CSC Charakterisierung über Genexpressionsanalyse für Stammzellmarker
- Sammle 3 Präparationen von CSC durch Sammeln von Medium, das Zellen, Zentrifugieren bei 129 xg für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in einer Lösung von Phenol, enthaltend Guanidiniumthiocyanat thiocynate (andere Methoden zur RNA-Extraktion verwendet werden können).
- Vorbereitung der Gesamt-RNA unter Verwendung von TRIzol nach dem Protokoll des Herstellers. Synthese von komplementärer DNA (cDNA) von 0,1 bis 1 ug RNA mit einem kommerziell erhältlichen cDNA-Reverse Transkription-Kit.
- Führen quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR).
- Make-up Master-Mix für jeden Satz von Primern, welche QRT-PCR-Mix, Primer und Wasser auf insgesamt 8 ul pro Probe (Primer mit unterschiedlichen Fluorophore können in der gleichen gut verstärkt werden). Zum Beispiel erzeugenein Master-Mix für Oct4-FAM, Nanog-Hex und GAPDH-CY5. Erzeugen separaten Master Mixes für Nestin und PROM1. Add 2 ul cDNA-Matrize pro Probe.
HINWEIS: Für diese Studie qRT-PCR wurde unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgelisteten Primer. - Führen Sie alle QRT-PCR in zweifacher Ausfertigung für jede Probe mit einer Echtzeit-PCR-Thermocycler Aufspüren von mehreren Fluorophore. Enthalten keine Template-Kontrollen.
- Normalisieren Stammzellen Genexpression GAPDH Ausdruck für jede Probe mit der ΔΔC T-Methode.
- Make-up Master-Mix für jeden Satz von Primern, welche QRT-PCR-Mix, Primer und Wasser auf insgesamt 8 ul pro Probe (Primer mit unterschiedlichen Fluorophore können in der gleichen gut verstärkt werden). Zum Beispiel erzeugenein Master-Mix für Oct4-FAM, Nanog-Hex und GAPDH-CY5. Erzeugen separaten Master Mixes für Nestin und PROM1. Add 2 ul cDNA-Matrize pro Probe.
| Oct-4-FAM | Primer 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Primer 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAM-Sonde: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | Primer 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Primer 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEX-Sonde: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | Primer 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| CY5 Sonde: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| NESTIN-FAM | Primer 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAM-Sonde: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | Primer 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Primer 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| HEX-Sonde: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Tabelle 1. Primer für CSC Charakterisierung von QRT-PCR verwendet.
e_title "> 4. Analyse CSCs für Zelloberflächenmarker CD117 und CD133- Ernte CSC durch Sammeln von Medium, das Zellen und Zentrifugation bei 125 × g für 5 min. Fügen Sie 500 ul einer nicht-proteolytischen Zellablösung Lösung Break-up-Zellen. Zentrifuge Zellen bei 125 × g für 5 min, um die Zellentfernungslösung zu entfernen. Dann waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBS.
- Inkubieren in normalem Wachstumsmedium für 1 h vor der Markierung Zellen. Spin-down-Zellen für 5 min bei 129 x g. Die Zellen in PBS mit 0,1% BSA mit anti-CD133-PE und anti-CD117-FITC.
- Fix Zellen über Nacht in 1% Para. Achtung: Paraformaldehyd ist giftig (Verdacht auf krebserzeugende Stoffe). Machen in Abzug und innerhalb von einer Woche.
- Führen Durchflusszytometrie auf CD117 (mit einem anti-CD117 FITC konjugiert) und CD133 (mit Anti-CD133 PE konjugiert) Zelloberflächenexpression auf einem Durchflusszytometer analysiert. Sammeln Sie Daten auf Zellen in der FL1 (für FITC) und FL3 (für PE)-Kanäle. Erzeugen Tore für beide Zellen exprimierenFITC und PE. Erzeugen ein Punkt-Diagramm mit 4 Quadranten (FITC- und PE-, FITC + PE, PE FITC- + und + FITC und PE +) und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in jedem Quadranten.
5. Analyse CSCs für therapeutische Reaktion
- Platte 5000 Zellen pro Well (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC und SKOV3-RFP CSCs) auf 96-Well-Platten über Nacht.
- Behandle mit Cisplatin (0, 1, 10, 100 und 1000 um) und Paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1, 10 und 100 uM) für 96 Stunden.
- Führen MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) Zelllebensfähigkeitstest.
- Platte 5000 Zellen pro 100 ul pro Well auf einer 96-Well-Platte (Plattenzellen in zweifacher Ausfertigung und gehören Medien nur steuern Brunnen).
- Nach 24 Stunden werden 10 ul 10 mg / ml MTT. Bei 37 ° C für 2-4 Stunden (bis zum Niederschlag).
- 100 l MTT Lösungsmittel 4 mM HCl, 0,1% NP-40 in Isopropanol. Die Proben für 15 min im Dunkeln.
- Lesen Platten bei 570 nm auf einem Teller rEADER.
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Representative Results
Um zu zeigen, dass wir isoliert KSZ von epithelialen Eierstockkrebszelllinien unter Verwendung von Cisplatin-Behandlung wir zunächst aufgenommenen Bildern der Zelllinien vor der Behandlung und nach der Selektion. Wir haben die Lichtmikroskopie, um Bilder von adhärenten (unbehandelt) und SKOV3 OVCA429 Zellen und SKOV3 und OVCA429 CSCs (Abbildung 1) zu erfassen. CSCs rund und nicht erscheinen, um die Gewebekulturplatten befestigt (Abbildungen 1 und 2). Wir zeigen weiter, dass SKOV3 Zellen mit RFP transduzierten nach Isolierung der CSCs zeigt, dass die Zellen lebensfähig (2B) sind, behalten ihre Fluoreszenz.
Lebensfähige CSC Kulturen wurden für ihre Reaktion auf medikamentöse Therapie beurteilt. KSZ zeigte, dass die Resistenz gegenüber Cisplatin (insbesondere bei 100 uM) und Paclitaxel (10 uM) (Figur 3). CSCs sind oft durch ihre Expression von Stammzellgene charakterisiert. Expression von CD133 (auch bekannt PROM1), Nestin, Nanog, Oct4 und wurde untersucht. CD133 wurde deutlich SKOV3 CSC Kulturen im Vergleich zu unbehandelten (Kontrolle) Zellen (4A) induziert. CD133 wurde ebenfalls in Kulturen von CSC 16-fach und 13-fach in der OVCA429 und OVCA429-RFP-Zellen induziert im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen (Daten nicht gezeigt). In ersten Experimenten wurden Oct4, Nanog und Nestin in SKOV3 CSC Kulturen im Vergleich zu unbehandelten erhöht, aber die Ergebnisse waren nicht statistisch signifikant (4A). Nach Wiederholung dieser Experimente Oct4 und Nanog erhöht in SKOV3 CSCs im Vergleich zu Kontrollzellen Eltern (4B). Oct4 wurde um 4,7-fach und 8-fach in der OVCA429 und OVCA429-RFP-Zellen nach der CSC Bereicherung Protokoll erhöht (nicht gezeigt). Schließlich SKOV3 CSCs eine erhöhte Zelloberflächenexpression des CSC-Marker CD117 (Abbildung 5). Im Ergebnis ermöglicht diese Methode für die Auswahl der lebensfähigen Sphäroid KSZ (Stammzellmarker exprimieren) in OvarialkarzinomZelllinien durch Auswahl mit Cisplatin und Wachstum in der Stammzell Medien.
Abbildung 1. Morphologie der SKOV3 und OVCA429 Zellen und Krebsstammzellen (CSCs), ausgewählt aus SKOV3 und OVCA429 Zellen. Phasenkontrastmikroskopie zeigt SKOV3 und OVCA429 Zellen (adhärenten), die unbehandelt sind und haben für CSCs (Sphäroid) ausgewählt wurde.
Abbildung 2. Bereicherung für CSCs ergibt nicht haft Sphäroiden. (A) SKOV3 Zellen unbehandelt und für CSCs angereichert (60X Vergrößerung). (B) SKOV3-RFP Zellen, die unbehandelt sind (a und b) oder für CSCs angereichert (c d). Linke Felder zeigen Phasenkontrastaufnahmen und rechten Fenster zeigen Fluoreszenz. Originalvergrößerung 40X. Maßstab = 400 Mikrometer.
Figur 3 KSZ eine erhöhte Chemoresistenz im Vergleich zu unbehandelten Zelllinien. SKOV3 (A und B) und SKOV3-RFP (C und D), SKOV3 KSZ (A und B) und SKOV3-RFP KSZ (C und D) wurden mit verschiedenen behandelten Konzentrationen von Cisplatin (A und C) oder Paclitaxel (Taxol), (B und D). 96 Stunden nach der Behandlung MTT-Test durchgeführt wurde. Die Experimente wurden in n≥3 geführt und Statistiken wurden mit Hilfe Two Way ANOVA; * P <0,05, *** p < ;. 0,0005 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Stammzellmarker-Expression in CSCs im Vergleich zu unbehandelten Zellen. QRT-PCR-Analyse wurde für SKOV3 (Kontrolle) und SKOV3 CSCs durchgeführt. (A) CD133 (PROM1), Nestin, Nanog und OCT4 (GAPDH normalisiert zu). ( B) Ein weiterer Versuch zeigt, dass die SKOV3-RFP CSCs aus diesem Protokoll Ausbeute Zellen mit erhöhter OCT4 und Nanog erhalten im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Ergebnisse wurden normalisiert mit GAPDH Ausdruck. N = 3 und Statistiken wurden unter Verwendung von t-Test; ** P <0,02, *** p <0,002.
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Abbildung 5. Durchflusszytometrie-Analyse von Stammzellmarkern in SKOV3 Zellen und SKOV3 CSCs allein oder transduziert oder ohne RFP. CD133, CD117, CD133 und / CD117-Expression in (A) SKOV3 (unbehandelt / Kontrolle) Zellen, (B) SKOV3 CSCs, (C) SKOV3-RFP unbehandelten Zellen, und (D) SKOV3-RFP CSCs. Experimente wurden dreifach durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
CSCs, die therapieresistent sind, können nach der Behandlung des Primärtumors verantwortlich für den Rückfall sein. Charakterisierung von CSCs zu verbesserten Therapien für Eierstockkrebs führen. Die kritischen Parameter in der Einrichtung chemoresistentem KSZ Verwendung des obigen Protokolls sind Zeit die Länge der Behandlung mit Chemotherapie und die Konzentration der Chemotherapie. Wenn unter Verwendung des Protokolls in Ma et al. es wurde festgestellt, daß nach 7 Tagen der Behandlung mit Cisplatin und Paclitaxel, blieb keine lebensfähigen Zellen 4. Durch die Reduzierung der Behandlung zu 3 Tage (mit 20 uM Cisplatin anstelle von 40 uM Cisplatin und Paclitaxel 10 uM), lebensfähigen chemoresistenten Zellen und CSCs entwickelt. Die Länge und die Dosis der Behandlung muss eventuell für verschiedene Eierstock-Krebszelllinien verändert werden.
Die Hauptbeschränkung dieses Protokolls ist die Länge, die CSCS lebensfähig bleiben. Über dieses Protokoll, bleiben die CSCs fähig weniger als einer Woche. Daher the Arten von Experimenten und Analysen für die CSCs müssen sorgfältig zeitlich abgestimmt werden.
Weitere Charakterisierung der CSCS durchgeführt werden muss. Es wäre sinnvoll, dieses Verfahren des CSCS zu anderen Methoden der CSC Generation zu vergleichen, um die Ähnlichkeit und Unterschiede zwischen diesen Zelltypen zu bestimmen. Vergleich von Stammzellmarkern, Ansprechen auf die Therapie und beste System für In-vivo-Analyse muss zwischen verschiedenen Methoden zur Erzeugung / Auswahl von CSCs durchgeführt werden. Es wurde vorgeschlagen, dass es verschiedene Arten von CSC mit unterschiedlichen Expressionsmuster von Stammzellmarker und andere Prognose für Patienten 10-12, damit weitere Definition davon, welche Art des CSCS dieses Protokoll erzeugt werden kann, um festzustellen, wie sie die menschliche maligne beziehen . Schließlich, um nachzuweisen, dass streng CSCS dieses Protokoll isoliert sind definitive CSCS Zellen müssen in immungeschwächten Mäusen in einem begrenzenden Verdünnungsanalyse injiziert werden. DiesTest zeigt, dass CSCs sind in der Lage, Tumoren der Eierstöcke bei einer niedrigen Dichte zu erzeugen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
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