Summary
Kreft stamceller (cscs) er involvert i tumor tilbakefall på grunn chemoresistance. Vi har optimalisert en protokoll for utvalg og utvidelse av cscs fra eggstokkreft cellelinjer. Ved behandling av cellene med det kjemoterapeutiske cisplatin og dyrkning i en stamcelle fremme medier vi berike for ikke-adherente CSC kulturer.
Abstract
Cancer stamceller (cscs) er definert som en undergruppe av langsom sykling og udifferensierte celler som deler seg asymmetrisk å generere svært proliferativ, invasiv og kjemoresistent tumorceller. Derfor cscs er en attraktiv populasjon av celler å målrette terapeutisk. Cscs er spådd å bidra til en rekke typer av maligniteter, inkludert de i blod, hjerne, lunge, mage-tarmkanalen, prostata og ovarier. Isolere og berikende en svulst celle befolkning for cscs vil gjøre forskere til å studere egenskaper, genetikk og terapeutisk respons av cscs. Vi ga en protokoll som reproduserbart beriker for eggstokkreft cscs fra eggstokkreft cellelinjer (SKOV3 og OVCA429). Cellelinjer blir behandlet med 20 mM cisplatin i 3 dager. Overlevende celler er isolert og dyrket i et serumfritt medium inneholdende stamcelle cytokiner og vekstfaktorer. Vi demonstrerer en berikelse av disse rensede cscs ved å analysere de isolerte celler for known stamcellemarkører Oct4, Nanog, og Prom1 (CD133) og celleoverflaten uttrykk for CD177 og CD133. Den cscs utstillings økt chemoresistance. Denne metoden for isolering av cscs er et nyttig verktøy for å studere rollen cscs i chemoresistance og tumor tilbakefall.
Protocol
1. Cellekultur og Fluorescent Merking av eggstokkreft cellelinjer
- Forbered SKOV3 middel: McCoy medier supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin. Oppretthold OVCA429 celler i minimalt essensielt medium (MEM) supplert med 10% FBS, 1 mM natrium-pyruvat, 0,1 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin.
- Forplante SKOV3 og OVCA429 cellelinjer i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2. Grow celler til 40-50% konfluens.
- Generer celler som uttrykker rødt fluorescerende protein (RFP) for å overvåke levedyktighet in vitro og in vivo.
- For å generere SKOV3-celler som uttrykker RFP, tilsett lentiviral partikler som uttrykker RFP og 10 ug / ml polybrene til SKOV3 medier i fravær av penicillin og streptomycin i 72 timer.
- Etter 72 timer, velger du for RFP positive celler ved Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) som følger: Trypsinize RFP og ikke-RFP uttrykke celler, sentrifuger ved 125 xg i 5 min, resuspender cellene ved 10 7 celler / ml i PBS inneholdende 0,1% BSA. På en celle sorter, bruke ikke-RFP celler til å bestemme sorteringsparametere. Deretter samle celler som uttrykker høy RFP ved hjelp av en 561 nm laser.
- Alternativt, hvis den lentiviral plasmidet uttrykker en antibiotisk resistens kassett, selektere for RFP uttrykke celler ved dyrking i passende antibiotika (for eksempel 10 mg / ml blasticidin). MERK: Mengden lentiviral partikler som må brukes kan variere fra batch og etter celletype. Riktig lentiviral titer bør bestemmes for hver celletype.
2. berikelse av kreftstamceller
- Unn SKOV3, SKOV3-RFP, eller OVCA429 cellelinjer med 20 mikrometer av cisplatin for 72 timer. FORSIKTIG: Cisplatin er giftig. Bruk verneklær / hansker og unngå kontakt med hud og slimhinner. Ikke kast cisplatin jegn avløpsvann.
- Forbered CSC middel: serumfritt DMEM / F12 media supplert med 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF), 10 ng / ml basic fibroblast vekstfaktor (bFGF), 12 ng / ml av leukemi-inhiberende faktor , og 0,4% bovint serumalbumin (BSA).
- Trypsinize celler. Kultur overlevende celler i CSC media.
MERK: Etter 2 dager i kultur ikke-heft sfæroider vil danne. - Endre media hver 2 dager ved å samle media inneholdende celler og sentrifugering ved 125 xg i 5 min. Deretter resuspender pelleten i frisk CSC media. Sjekk celler for levedyktighet hver 2 dager ved å telle celler og utføre trypanblått eksklusjon.
- Deretter samle cscs for videre eksperimenter ved sentrifuge 129 xg i 5 min, og resuspendering av pelleten i fenol inneholdende guanidinium thiocynate (RNA), fosfatbufret saltløsning (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, og 11,9 mM fosfatbuffer, pH 7,4) med 0.1% BSA (for flowcytometri), eller CSC media for å fortsettedyrking av cellene.
- Monitor CSC cellemorfologi bruker et lysmikroskop på 20X og 40X forstørrelse.
3. CSC Karakterisering via Gene Expression Analysis for stamcellemarkører
- Samle tre preparater av cscs ved å samle mediet som inneholder celler, sentrifugering ved 129 xg i 5 min, og resuspendering av pelleten i en oppløsning av fenol inneholdende guanidinium thiocynate (andre fremgangsmåter for RNA-ekstraksjon kan anvendes).
- Forbered total RNA bruker TRIzol henhold til produsentens protokoll. Syntetisere komplementær DNA (cDNA) 0,1 til 1 mikrogram av RNA med en kommersielt tilgjengelig cDNA Reverse Transcription kit.
- Utføre kvantitativ revers transkribert polymerase chain reaction (QRT-PCR).
- Make up mester mix for hvert sett med primere som inneholder QRT-PCR mix, primere, og vann til totalt 8 mL per prøve (primere med ulike fluoroforene kan forsterkes i samme brønn). For eksempel generereren master mix for Oct4-FAM, Nanog-Hex, og GAPDH-Cy5. Generere separate master mikser for Nestin og Prom1. Tilsett 2 mL av cDNA mal per prøve.
MERK: For denne studien, ble QRT-PCR utføres ved hjelp av primere som er oppført i tabell 1. - Utføre alle QRT-PCR i duplikat for hver prøve ved hjelp av en sanntid PCR thermocycler stand til å detektere flere fluoroforer. Inkluder templat-kontroller.
- Normaliser stamcelle genekspresjon til GAPDH uttrykk for hver prøve ved hjelp av ΔΔC T-metoden.
- Make up mester mix for hvert sett med primere som inneholder QRT-PCR mix, primere, og vann til totalt 8 mL per prøve (primere med ulike fluoroforene kan forsterkes i samme brønn). For eksempel generereren master mix for Oct4-FAM, Nanog-Hex, og GAPDH-Cy5. Generere separate master mikser for Nestin og Prom1. Tilsett 2 mL av cDNA mal per prøve.
| Oct-4-FAM | Primer 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Primer 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| FAM probe: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | Primer 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Primer 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEX probe: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-Cy5 | Primer 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| Cy5 probe: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| NESTIN-FAM | Primer 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Primer 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| FAM probe: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | Primer 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Primer 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| HEX probe: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Tabell 1. Primere som brukes for CSC karakterisering av QRT-PCR.
e_title "> 4. Analysere cscs for celleoverflaten markører CD117 og CD133- Slakte cscs ved å samle media inneholdende cellene og sentrifugering ved 125 xg i 5 min. Tilsett 500 pl av en ikke-proteolytisk celle løsgjøring løsning for å bryte opp celler. Sentrifuger cellene ved 125 xg i 5 minutter for å fjerne celle løsgjøring løsning. Deretter vaskes cellene to ganger med kald PBS.
- Inkuber i normal vekstmedier i 1 time forut for merking av celler. Spinn ned celler i 5 min ved 129 x g. Resuspender cellene i PBS med 0,1% BSA med anti-CD133-PE og anti-CD117-FITC.
- Fix celler over natten i 1% paraformaldehyde. Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig (mistenkt kreftfremkallende). Gjør i avtrekksskap og bruk innen en uke.
- Utfør strømningscytometri for å analysere CD117 (med et anti-CD117 konjugert til FITC) og CD133 (med anti-CD133 konjugert til PE) celleoverflate ekspresjon på et strømningscytometer. Samle inn data om celler i FL1 (for FITC) og FL3 (for PE) kanaler. Generere porter for celler som uttrykker bådeFITC og PE. Generere et prikkplott med fire kvadranter (FITC- og PE, FITC + PE, FITC- PE +, og FITC + og PE +) og bestemme antall celler i hver kvadrant.
5. Analysere cscs for terapeutisk respons
- Plate 5000 celler per brønn (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC og SKOV3-RFP cscs) på 96-brønners plater over natten.
- Behandl med cisplatin (0, 1, 10, 100 og 1000 mM) eller paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1, 10 og 100 pM) i 96 timer.
- Utfør MTT (3-(4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) celleviabilitet assay.
- Plate 5000 celler per 100 mL per brønn på en 96-brønns plate (plate celler i to eksemplarer og inkluderer media bare kontrollere brønner).
- Etter 24 timer, tilsett 10 pl av 10 mg / ml MTT. Inkuber ved 37 ° C i 2-4 timer (inntil utfelling dannes).
- Tilsett 100 ul av MTT løsemiddel 4 mM HCl, 0,1% NP-40 i isopropanol. Inkuber i 15 minutter i mørket.
- Les plater ved 570 nm på en plate reader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere at vi isolert cscs fra ovarialcancer cellelinjer ved hjelp av cisplatin behandling, må vi først kjøpte bilder av cellelinjene før behandling og etter valget. Vi brukte lysmikroskopi til å ta bilder av tilhenger (ubehandlet) SKOV3 og OVCA429 celler og SKOV3 og OVCA429 cscs (figur 1). Cscs vises runde og ikke festet til vevskulturplater (figur 1 og 2). Vi viser videre at SKOV3-celler transdusert med RFP beholde sin fluorescens etter isolering av de cscs demonstrerer at cellene er levedyktige (figur 2B).
Levedyktige CSC kulturer ble vurdert for deres respons på medikamentell behandling. Cscs vist økt motstand mot cisplatin (spesielt ved 100 uM) og paclitaxel (10 pM) (figur 3). Cscs er ofte preget av deres uttrykk for stamcelle gener. Uttrykk for CD133 (også kjent som Prom1), Ble Nestin, Nanog, og Oct4 undersøkt. CD133 ble betydelig indusert i SKOV3 CSC kulturer sammenlignet med ubehandlede (kontroll) celler (figur 4A). CD133 ble også indusert i CSC kulturer sammenlignet med ubehandlede kontroller med 16 ganger og 13 ganger i OVCA429 og OVCA429-RFP celler (data ikke vist). I innledende forsøk Oct4, Nanog, og Nestin ble forhøyet i SKOV3 CSC kulturer sammenlignet med ubehandlet, men resultatene var ikke statistisk signifikant (figur 4A). Ved å gjenta disse eksperimentene Oct4 og Nanog økt i SKOV3 cscs forhold til foreldrekontrollceller (Figur 4B). Oct4 ble økt med 4,7 ganger og 8 ganger i OVCA429 og OVCA429-RFP celler følgende CSC berikelse protokollen (ikke vist). Til slutt økes SKOV3 cscs utstillingscelleoverflate ekspresjon av CSC markør CD117 (figur 5). I konklusjonen, gir denne metoden for valg av levedyktige sfæroide cscs (uttrykker stamcellemarkører) i eggstokkreftcellelinjer ved valg med cisplatin og vekst i stamcelle medier.
Figur 1. morfologi SKOV3 og OVCA429 celler og kreftstamceller (cscs) valgt fra SKOV3 og OVCA429 celler. Fase kontrast mikros skildrer SKOV3 og OVCA429 celler (tilhenger) som er ubehandlet og har blitt valgt for cscs (spheroid).
Figur 2. berikelse for cscs gir ikke-heft sfæroider. (A) SKOV3-celler ubehandlet og anriket for cscs (60X forstørrelse). (B) SKOV3-RFP celler som er ubehandlet (a og b) eller anriket for cscs (c d). Venstre panel skildre fase bilder kontrast og høyre panel skildre fluorescens. Original forstørrelse 40X. Scale bar = 400 my.
Figur 3. cscs oppviser øket chemoresistance sammenlignet med ubehandlede cellelinjer. SKOV3 (A og B) og SKOV3-RFP (C og D), SKOV3 cscs (A og B) og SKOV3-RFP cscs (C og D) ble behandlet med ulike konsentrasjoner av cisplatin (A og C) eller paclitaxel (Taxol) (B og D). 96 timer etter behandling MTT-analysen ble utført. Forsøkene ble utført i n≥3 og statistikk ble beregnet ved hjelp av Two Way ANOVA; * P <0,05, *** p < ;. 0,0005 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Stamcelle markør uttrykk i cscs sammenlignet med ubehandlede celler. QRT-PCR analyse ble utført for SKOV3 (kontroll) og SKOV3 cscs. (A) CD133 (Prom1), Nestin, Nanog, og OCT4 (normalisert til GAPDH). ( B) En ekstra eksperiment som viser at SKOV3-RFP cscs hentet fra denne protokoll avkastning celler med forhøyet OCT4 og Nanog sammenlignet med ubehandlede celler. Resultatene var normalisert med GAPDH uttrykk. N = 3 og statistikk ble beregnet ved hjelp av studenter T-test; ** P <0.02, *** p <0,002.
5 "fo: content-width =" 5in "src =" / filer / Ftp_upload / 51891 / 51891fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. flowcytometrisystemer Analyse av stamcellemarkører i SKOV3 celler og SKOV3 cscs alene eller omformet eller uten RFP. CD133, CD117, og CD133 / CD117 uttrykk i (A) SKOV3 (ubehandlet / kontroll) celler, (B) SKOV3 cscs, (C) SKOV3-RFP ubehandlede celler, og (D) SKOV3-RFP cscs. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cscs som er resistente mot behandling kan være ansvarlig for tilbakefall etter behandling av primærtumor. Karakterisering av cscs kan føre til bedre behandling for eggstokkreft. De kritiske parametre i etableringen av kjemoresistent cscs ved hjelp av ovennevnte protokoll er timingen lengden av behandling med kjemoterapi og konsentrasjonen av kjemoterapi. Ved bruk av protokollen i Ma et al. det ble funnet at etter 7 dagers behandling med cisplatin og paclitaxel, ingen levedyktige celler forble 4. Ved å redusere behandling for 3 dager (med 20 mM i stedet for cisplatin 40 uM cisplatin og 10 uM paclitaxel), levedyktige celler og kjemoresistent cscs utviklet. Lengden og dosen av behandlingen kan måtte endres for forskjellige ovarian cancer-cellelinjer.
Den store begrensningen av denne protokollen er lengden at cscs være levedyktig. Ved hjelp av denne protokollen er cscs være levedyktig for mindre enn en uke. Derfor the typer eksperimenter og analyse for cscs må nøye timet.
Ytterligere karakterisering av cscs skal foregå. Det ville være nyttig å sammenligne denne metoden for cscs til andre metoder for CSC generering for å bestemme likheten, og forskjellen mellom disse celletypene. Sammenligning av stamcelle markører, respons på behandling, og den beste system for in vivo analyse må bli utført mellom ulike metoder for generering / utvalg av cscs. Det har vært antydet at det er forskjellige typer cscs med ulike uttrykk mønstre av stamcellemarkører og annen prognose for pasienter 10-12, og dermed ytterligere definisjon av hva slags cscs er generert av denne protokollen kan bidra til å bestemme hvordan de forholder seg til menneskelig malignitet . Til slutt, for å vise at de strengt cscs isolert fra denne protokollen er definitive cscs, cellene trenger for å bli injisert i immunkompromitterte mus i en begrensende fortynningsanalyse. DetteAnalysen viser at cscs er i stand til å generere ovarietumorer ved en lav tetthet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
- Pennington, K., Pulaski, H., Pennington, M., Liu, J. R. Too Much of a Good Thing: Suicide Prevention Promotes Chemoresistance in Ovarian Carcinoma. Curr Cancer Drug Targets. 10, 575-583 (2010).
- Thigpen, T. A rational approach to the management of recurrent or persistent ovarian carcinoma. Clin Obstet Gynecol. 55, 114-130 (2012).
- Burgos-Ojeda, D., Rueda, B. R., Buckanovich, R. J. Ovarian cancer stem cell markers: prognostic and therapeutic implications. Cancer letters. 322, 1-7 (2012).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42, 593-602 (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3, 730-737 (1997).
- Alison, M. R., Lim, S. M., Nicholson, L. J. Cancer stem cells: problems for therapy. The Journal of pathology. 223, 147-161 (2011).
- Luo, X., Dong, Z., Chen, Y., Yang, L., Lai, D. Enrichment of ovarian cancer stem-like cells is associated with epithelial to mesenchymal transition through an miRNA-activated AKT pathway. Cell proliferation. 46, 436-446 (2013).
- Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Molecular and cellular biochemistry. 363, 257-268 (2012).
- Abubaker, K., et al. Short-term single treatment of chemotherapy results in the enrichment of ovarian cancer stem cell-like cells leading to an increased tumor burden. Molecular cancer. 12, 24 (2013).
- Conic, I., Dimov, I., Tasic-Dimov, D., Djordjevic, B., Stefanovic, V. Ovarian epithelial cancer stem cells. ScientificWorldJournal. 11, 1243-1269 (2011).
- Liu, K. C., et al. Ovarian cancer stem-like cells show induced translineage-differentiation capacity and are suppressed by alkaline phosphatase inhibitor. Oncotarget. 4 (12), 2366-2382 (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncology reports. 23, 1277-1284 (2010).
