Summary
Células-tronco cancerosas (CSCs) estão implicados na reincidência do tumor devido a chemoresistance. Nós otimizamos um protocolo para a seleção e expansão dos CSCs de linhas celulares de cancro do ovário. Ao tratar as células com a cisplatina quimioterapêutico e a cultura de uma célula-tronco nos meios de promoção para enriquecer culturas CSC não aderentes.
Abstract
Células-tronco cancerosas (CSCS) são definidos como um subconjunto de ciclismo lento e células indiferenciadas que se dividem de forma assimétrica para gerar altamente proliferativa, invasiva e células tumorais quimiorresistentes. Portanto, CSCs são uma população de células atraente para direcionar terapeuticamente. CSCs são previstos para contribuir para um número de tipos de tumores, incluindo os do sangue, cérebro, pulmão, tracto gastrointestinal, próstata, ovário. Isolando e enriquecendo a população de células tumorais para CSCs irá permitir aos pesquisadores estudar as propriedades, genética e resposta terapêutica dos CSCs. Geramos um protocolo que enriquece reprodutível para CSCs câncer de ovário de linhas celulares de cancro do ovário (SKOV3 e OVCA429). As linhas de células são tratadas com 20 pM de cisplatina durante 3 dias. As células sobreviventes são isoladas e cultivadas em meios de células-tronco isento de soro contendo citoquinas e factores de crescimento. Nós demonstramos um enriquecimento dessas CSCs purificados por análise das células isoladas, para known marcadores de células estaminais Oct4, nanog, e Prom1 (CD133) e a expressão da superfície das células de CD177 e CD133. A exposição CSCs aumento chemoresistance. Este método de isolamento de CSCs é uma ferramenta útil para o estudo do papel das CSCs na quimiorresistência de tumor e de recaídas.
Protocol
1. celular Cultura e Labeling fluorescentes de câncer de ovário linhas celulares
- Prepare mídia SKOV3: meios de McCoy suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS), 0,1 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina. Manter OVCA429 células em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de FBS, piruvato de sódio 1 mM, 0,1 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina.
- Propagar SKOV3 e OVCA429 linhas celulares numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. Cultivar células de 40-50% de confluência.
- Gerar células que expressam a proteína fluorescente vermelha (RFP), a fim de monitorar a viabilidade in vitro e in vivo.
- Para gerar células que expressam SKOV3 RFP, adicionar partículas lentivirais expressando RFP e 10 ug / ml de polibreno a mídia SKOV3 na ausência de penicilina e estreptomicina para 72 h.
- Depois de 72 horas, seleccione para RFP células positivas por fluorescência celular ativado Sorting (FACS) como se segue: Trypsinize RFP e não as células que expressam RFP, centrifugar a 125 xg durante 5 min, ressuspender as células em 10 7 células / ml em PBS contendo 0,1% de BSA. Em um classificador de células, as células não utilizar-RFP para determinar os parâmetros de classificação. Em seguida, recolher as células que expressam alta RFP usando um laser de 561 nm.
- Alternativamente, se o plasmídeo lentiviral expressa uma cassete de resistência aos antibióticos, seleccionar as células que expressam RFP por cultura no antibiótico apropriado (tal como 10 mg / ml de blasticidina). NOTA: A quantidade de partículas lentivirais que deve ser utilizada pode variar por lote e por tipo de célula. Titulação adequada lentiviral deve ser determinado para cada tipo de célula.
2 Enriquecimento de células-tronco cancerosas
- Trate SKOV3, SKOV3-RFP, ou OVCA429 linhas de células com 20 mM de cisplatina durante 72 horas. ATENÇÃO: A cisplatina é tóxico. Usar roupa de proteção / luvas e evitar o contato com pele e membranas mucosas. Não descarte a cisplatina in águas residuais.
- Prepare mídia CSC: soro de meio DMEM / F12 livre suplementado com 5 ug / ml de insulina, 10 ng / factor de crescimento epidérmico humano recombinante ml (EGF), 10 ng / factor de crescimento de fibroblastos básico ml (bFGF), 12 ng / ml factor de inibição de leucemia , e 0,4% de albumina de soro bovino (BSA).
- Células Trypsinize. Cultura das células sobreviventes em meios CSC.
NOTA: Após 2 dias em cultura de esferóides não aderentes formarão. - Mudar mídia a cada 2 dias, recolhendo meios contendo as células e centrifugação a 125 xg durante 5 min. Em seguida, ressuspender o sedimento em media CSC fresco. Entrada para a viabilidade de células a cada 2 dias através da contagem de células e a realização de exclusão de azul de tripano.
- Em seguida, recolher CSCs para posteriores experiências por centrifugação 129 x g durante 5 min e ressuspender o sedimento em fenol contendo guanidina thiocynate (ARN), salino tamponado com fosfato (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM e 11,9 mM de tampão fosfato, pH 7,4) com 0,1% BSA (por citometria de fluxo), ou mídia CSC para continuara cultura das células.
- Monitorar a morfologia das células CSC usando um microscópio de luz em 20X e 40X ampliações.
3. CSC Caracterização via Análise da expressão genética para marcadores Stem Cell
- Recolhe 3 preparações de CSCs, recolhendo meios contendo as células, centrifugação a 129 xg durante 5 min, e ressuspender o pellet em solução de fenol contendo guanidina thiocynate (podem ser utilizados outros métodos de extracção de RNA).
- Preparar ARN total, utilizando TRIzol de acordo com o protocolo do fabricante. Sintetizar DNA complementar (cDNA) 0,1-1 ug de RNA usando um kit de ADNc A transcrição inversa disponível comercialmente.
- Realizar de transcrição reversa em cadeia da polimerase quantitativa reacção (QRT-PCR).
- Compo mistura principal para cada conjunto de iniciadores contendo mistura QRT-PCR, os iniciadores, e água para o total de 8 mL por amostra (iniciadores com diferentes fluoróforos pode ser amplificada no mesmo poço). Por exemplo, geraruma mistura de mestre para Oct4-FAM, Nanog-Hex, e GAPDH-CY5. Gerar misturas principais separados para Nestin e Prom1. Adicionar 2 mL de modelo de cDNA por amostra.
NOTA: Para este estudo, QRT-PCR foi realizada utilizando os iniciadores listados na Tabela 1. - Realiza toda QRT-PCR em duplicado para cada amostra utilizando um termociclador de PCR em tempo real capazes de detectar vários fluoróforos. Não incluem controles de modelo.
- Normalizar a expressão de genes em células estaminais para a expressão de GAPDH em cada amostra utilizando o método ΔΔC T.
- Compo mistura principal para cada conjunto de iniciadores contendo mistura QRT-PCR, os iniciadores, e água para o total de 8 mL por amostra (iniciadores com diferentes fluoróforos pode ser amplificada no mesmo poço). Por exemplo, geraruma mistura de mestre para Oct4-FAM, Nanog-Hex, e GAPDH-CY5. Gerar misturas principais separados para Nestin e Prom1. Adicionar 2 mL de modelo de cDNA por amostra.
| Oct-4-FAM | Iniciador 1: 5'-CCCAAGGAATAGTCTGTAGAAGTG-3 ' |
| Iniciador 2: 5'-TGCATGAGTCAGTGAACAGG-3 ' | |
| Sonda FAM: 5'-CTTCCAAGC / ZEN / TGCCCACCTAACTTCT / 3IABkFQ -3 ' | |
| Nanog-HEX | Iniciador 1: 5'-CCTTCTGCGTCACACCATT-3 ' |
| Iniciador 2: 5'-AACTCTCCAACATCCTGAACC-3 ' | |
| HEX sonda: 5'-CTGCCACCT / ZEN.CTTAGATTTCATTCTCTGGT / 3IABkFQ-3 ' | |
| GAPDH-CY5 | Iniciador 1: 5'-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3 ' |
| Iniciador 2: 5'-ACATCGCTCAGACACCATG-3 ' | |
| CY5 sonda: 5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTC / 3IABRQSP-3 ' | |
| Nestin-FAM | Iniciador 1: 5'-AGGACCTGAGCGATCTGG-3 ' |
| Iniciador 2: 5'-CGTTGGAACAGAGGTTGGAG-3 ' | |
| Sonda FAM: 5'-AACTTTTCA / ZEN / GTAGCCCGCAGCC / 3IABkFQ -3 ' | |
| CD133-HEX | Iniciador 1: 5'-ACTCTCTCCAACAATCCATTCC-3 ' |
| Iniciador 2: 5'-AAACAATTCACCAGCAACGAG-3 ' | |
| Sonda HEX: 5'-ACAATCACT / ZEN / GAGCACTCTATACCAAAGCG / 3IABkFQ-3 |
Tabela 1. Os iniciadores utilizados para a caracterização por CSC QRT-PCR.
e_title "> 4. CSCs Analisando para a superfície celular marcadores CD117 e CD133- CSCs colheita através da recolha de mídia contendo células e centrifugação a 125 xg por 5 min. Adicionar 500 mL de uma solução não proteolítico descolamento celular para quebrar-se as células. Células centrifugar a 125 xg por 5 min para remover a solução descolamento celular. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS frio.
- Incubar em meio normal de crescimento durante 1 h antes de células de rotulagem. Gire as células durante 5 minutos a 129 x g. Ressuspender as células em PBS com BSA a 0,1%, com anti-CD133-PE e anti-CD117-FITC.
- Fixar as células durante a noite em paraformaldeído a 1%. Atenção: O paraformaldeído é tóxico (possivelmente cancerígeno). Faça em extractor de fumo e usar dentro de uma semana.
- Realizar a citometria de fluxo para analisar CD117 (com um anticorpo anti-CD117 conjugado com FITC) e CD133 (com anti-CD133 conjugado com PE) a expressão de superfície celular num citómetro de fluxo. Coletar dados sobre as células do FL1 (para FITC) e FL3 (PE) para os canais. Gerar portas para as células que expressam tantoFITC e PE. Gerar um gráfico de pontos com quatro quadrantes (FITC e PE-, PE-FITC +, + PE FITC e PE e FITC + +) e determinar o número de células em cada quadrante.
5. Analisando CSCs para a resposta terapêutica
- Placa de 5000 células por poço (SKOV3, SKOV3-RFP, SKOV3 CSC e SKOV3-RFP CSCs) em placas de 96 poços durante a noite.
- Trata-se com cisplatina (0, 1, 10, 100 e 1.000 mM) ou paclitaxel (0, 0,01, 0,1, 1, 10, e 100 ^ M) durante 96 horas.
- Realizar MTT (3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-) ensaio de viabilidade celular.
- Placa de 5000 células por 100 ul por cavidade em uma placa de 96 poços (placa de células em duplicado, e incluem meios de controlar apenas poços).
- Após 24 horas, adicionar 10 ul de 10 mg / mL de MTT. Incubar a 37 ° C durante 2-4 horas (até a formação de precipitado).
- Adicionar 100 ul de HCI mM de MTT solvente 4, 0,1% de NP-40 em isopropanol. Incubar durante 15 min no escuro.
- Ler as placas a 570 nm numa placa de reader.
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Representative Results
Para demonstrar que isolámos CSCs de linhas celulares de cancro de ovário epitelial utilizando o tratamento com cisplatina, que em primeiro lugar as imagens adquiridas das linhas de células antes do tratamento e após selecção. Nós usamos a microscopia de luz para capturar imagens de aderente (não tratada) SKOV3 e OVCA429 células e SKOV3 e OVCA429 CSCs (Figura 1). CSCs aparecem redonda e não ligado às placas de cultura de tecidos (Figuras 1 e 2). Mostramos também que as células transduzidas com SKOV3 RFP conservam a sua fluorescência após o isolamento das CSCs que demonstram que as células são viáveis (Figura 2B).
CSC culturas viáveis foram avaliados quanto à sua resposta à terapia medicamentosa. CSCs demonstraram um aumento da resistência à cisplatina (particularmente a 100 uM) e de paclitaxel (10 uM) (Figura 3). CSCs são frequentemente caracterizadas pela sua expressão de genes de células-tronco. A expressão de CD133 (também conhecido como Prom1), Nestina, Nanog e Oct4 foi examinada. CD133 foi significativamente induzida em culturas de células SKOV3 CSC comparado com controlo (células não tratadas) (Figura 4A). CD133 também foi induzido em culturas de CSC em comparação com controlos não tratados em 16 vezes e 13 vezes maior nas células OVCA429 e OVCA429-RFP (dados não mostrados). Em experiências iniciais Oct4, Nanog, e nestina foram elevados em culturas de células SKOV3 CSC não tratado, em comparação com, mas os resultados não foram estatisticamente significativas (Figura 4A). Após a repetição destas experiências Oct4 e nanog aumentada em SKOV3 CSCs em comparação com células de controlo parental (Figura 4B). Oct4 foi aumentada em 4,7 vezes e 8 vezes na das células OVCA429 e OVCA429-RFP seguindo o protocolo de enriquecimento CSC (não mostrado). Finalmente, SKOV3 CSCs exibem um aumento da expressão da superfície da célula do CSC marcador CD117 (Figura 5). Em conclusão, este método permite a seleção de CSCs viáveis esferóides (que expressam marcadores de células tronco) em câncer de ováriolinhas celulares por meio de seleção com cisplatina e crescimento em meio de células-tronco.
Figura 1 Morfologia de SKOV3 e OVCA429 células e células-tronco cancerosas (CSCs) selecionados a partir de SKOV3 e OVCA429 células. Microscopia de contraste de fase retrata SKOV3 e OVCA429 células (aderente), que são tratadas e foram selecionadas por CSCs (esferóide).
Figura 2 Enriquecimento de CSCs produz esferóides não aderentes. Células (D) sem tratamento SKOV3 e enriquecido para os CSCs (60X de ampliação). (B) células SKOV3-RFP que são não tratada (a e b) ou enriquecido para os CSCs (c d). Painéis da esquerda mostram imagens de contraste de fase e de painéis da direita mostram a fluorescência. Ampliação original 40X. Barra de escala = 400 microns.
Figura 3 CSCs apresentam aumento chemoresistance comparação com linhagens de células não tratadas. SKOV3 (A e B) e SKOV3-RFP (C e D), SKOV3 CSCs (A e B) e SKOV3-RFP CSCs (C e D) foram tratados com vários As concentrações de cisplatina (A e C) ou paclitaxel (Taxol) (B e D). 96 h MTT tratamento pós foi realizada. Os experimentos foram realizados em n≥3 e estatísticas foram calculadas usando Two Way ANOVA; * P <0,05, *** p < ;. 0,0005 por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Caule expressão do marcador de células em comparação com os CSCs células não tratadas. Análise de QRT-PCR foi realizada para células SKOV3 (controlo) e SKOV3 CSCs. (A) CD133 (Prom1), nestina, Nanog, e OCT4 (normalizados para GAPDH). ( B) Um experimento adicional demonstrando que as CSCs SKOV3-RFP obtidos neste protocolo células rendimento com OCT4 elevada e Nanog comparação com células não tratadas. Os resultados foram normalizados com a expressão de GAPDH. N = 3 e as estatísticas foram calculados utilizando teste t de Student; ** P <0,02, *** p <0,002.
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Figura 5 Citometria de Fluxo de Análise de marcadores de células-tronco em células SKOV3 e SKOV3 CSCs sozinho ou transduzidas ou sem SDP. CD133, CD117, CD133 e / expressão CD117 em (A) SKOV3 (sem tratamento / controle) células, (B) SKOV3 CSCs, (C) SKOV3-RFP células não tratadas, e (D), CCC-RFP SKOV3. Os experimentos foram realizados em triplicata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
CSCs que são resistentes à terapia pode ser responsável por recaída após o tratamento do tumor primário. Caracterização dos CSCs podem levar a melhores terapias para o câncer de ovário. Os parâmetros críticos no estabelecimento de CSCs quimiorresistentes utilizando o protocolo anteriormente referido, são cronometrar o tempo de tratamento com a quimioterapia e a concentração de quimioterapia. Ao usar o protocolo em Ma et al. verificou-se que ao fim de 7 dias de tratamento com cisplatina e paclitaxel, não há células viáveis permaneceram 4. Ao reduzir o tratamento de 3 dias (com 20 pM de cisplatina, em vez de 40 pM de cisplatina e paclitaxel 10 uM), as células viáveis e quimiorresistentes CSCs desenvolvido. O comprimento e a dose de tratamento pode necessitar de ser alterado para diferentes linhas de células de cancro do ovário.
A principal limitação do presente protocolo é o comprimento que os CSCs permanecer viável. Usando este protocolo, os CSCs permanecer viáveis por menos de uma semana. Portanto, the tipos de experimentos e análise para o CSCs precisam ser cuidadosamente cronometrada.
A caracterização do CSCs precisa ser conduzida. Seria útil para comparar este método de CSCs a outros métodos de produção de CSC para determinar a similaridade e diferença entre estes tipos de células. Comparação de marcadores de células-tronco, a resposta ao tratamento e melhor sistema para a análise in vivo deve ser realizado entre diferentes métodos para geração / seleção de CSCs. Tem sido sugerido que existem diferentes tipos de CSCs com diferentes padrões de expressão de marcadores de células-tronco e prognóstico diferente para os pacientes 10-12, portanto, de maior definição de que tipo de CSCs são gerados por este protocolo pode ajudar a determinar como eles se relacionam com malignidade humana . Finalmente, a fim de demonstrar que os CSCs rigorosamente isoladas a partir deste protocolo são CSCs definitivos, as células têm de ser injectado em ratinhos imunocomprometidos em um ensaio de diluição limitante. Esteensaio demonstra que os CSCs são capazes de gerar tumores de ovário, a uma densidade baixa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy | Life Technologies | 16600-108 | Warm to 37 °C prior to use |
| DMEM / F12 serum free | Life Technologies | 11320-033 | Warm to 37 °C prior to use |
| Minimal Essential Media | Life Technologies | 42360032 | Warm to 37 °C prior to use |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Blasticidin | Life Technologies | R21001 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | T7402-5MG | Caution: Toxic. Use precautions |
| pLenti-suCMV-Rsv | Gentarget | LVP023 | BSL2 approval needed |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Human Recombinant EGF | Cell Signaling Technology | 8916LC | |
| bFGF | BD biosciences | 354060 | |
| LIF | Santa Cruz | sc-4988A | |
| Bovine Serum Albumin | Roche | 03 116 956 001 | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| IQ Multiplex Powermix | BioRad | 1725849 | |
| Accumax | Millipore | ||
| Primers | Integrated DNA Technology | individually designed and ordered (see protocol for sequnces) | |
| Anti-CD133 PE | Milenyl | 130-098-826 | Primer/probe sets are light sensitive |
| CD117-Biotin | Miltenly | 130-098-570 | |
| AntiBiotin-FITC | Miltenly | 130-098-796 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | Caution: Toxic. Always prepare in hood and make fresh. |
| Trypsin | Life Technologies | 25300062 | |
| MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) | Sigma-Aldrich | 25200-072 | |
| EVOS Fl Epifluorescence and Transmitted Light Microscope | Advanced Microscopy Group | ||
| Biorad CFX96 C1000 System | Biorad | ||
| Beckman Coulter FC500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| Spectramax 340PC384 | Molecular Devices |
References
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