Introduction
Hovedparten af de nye hiv-smittede på verdensplan opstå gennem heteroseksuel transmission, med kvinder, der repræsenterer 47% af nye infektioner i 2011 (UNAIDS 1). Forståelse af kvindelige kønsorganer (FGT), en af de vigtigste indgange portaler for HIV og andre seksuelt overførte patogener, er af stor betydning på vejen til at finde effektive strategier til at forebygge infektion. Immunrespons på genitale slimhinder er klart enestående og adskiller sig fra dem, der måles i perifert blod 2. Dog er aktuelle viden immun dynamik på FGT begrænset i bedste fald. Til dato har studier af slimhindeimmunsystemet miljø i høj grad fokuseret på de tarmassocieret lymfevæv (GALT), hvor det er blevet klart, at de tidlige begivenheder i mucosavæv efter infektion har en kraftig indvirkning på den efterfølgende sygdomsprogression 3,4. Indsamling af prøver fra det genitale slimhinder udgør en stor udfordring, og er i det mindste delvist ansvarlig for lack forståelse af immunologi i FGT. Løse puslespillet af immun dynamik mellem vært og patogen i forbindelse med den særskilte miljø, der er FGT nødvendiggør effektive metoder til indsamling og analyse af prøver fra denne lokalitet.
Den FGT er opdelt i to sektioner: den øverste forplantningskanal der omfatter æggeledere, endometrium og endocervix samt lavere tarmkanalen, som indeholder ectocervix og vagina (gennemgået af Kaushic m.fl. 5). Det er stadig uklart, hvad det relative bidrag af disse forskellige sites er at HIV-infektion, men det menes, at begge steder kan bidrage til HIV indgang 6. T-celler udgør 40-50% af leukocytterne i de øvre og nedre reproduktive skrifter, mens makrofager udgør ca 10% (revideret i Rodriguez-Garcia m.fl. 2). T-celler kan påvises i skeden, livmoderhalsen og endometriet. Makrofager er stærkere localized i endometriet og myometrisk bindevæv end livmoderhalsen, selv om de kan påvises i begge væv. Endelig kan plasmacytoid dendritiske celler (PDCs) og Langerhanske celler også påvises i FGT væv. Fænotype og proportioner immun befolkninger og deres modtagelighed over for hiv-infektion kan variere vigtigere efter hormonelle cyklus, brug af hormonel prævention, bakteriel vaginose eller seksuelle aktiviteter 5,7-9.
Der er udviklet forskellige metoder til at studere immun befolkninger og miljø i FGT. Cervikal biopsi, livmoderhalskræft cytobrushes og cervicovaginal udskylninger (CVL) 10-12 er de mest almindeligt anvendte over litteraturen. CVL samling af PBS udskylning er den enkleste metode og tillader undersøgelse af immun modulerende proteiner, men resulterer i ekstremt lave celleudbytte og er derfor ikke egnet til at studere immun cellepopulationer af FGT 13. CVL prøver er på den anden side, modery nyttige til at evaluere immune miljø FGT ved måling af ekspression af forskellige cytokiner, chemokiner eller antimikrobielle faktorer ved hjælp af metoder såsom ELISA, cytokin bead matrix 14 eller massespektrometri 15,16. Karakterisering af immuncelletyper frekvenser, fænotyper og funktioner kan opnås ved at samle cervikale mononukleære celler (CMC) ved cervikal cytobrush eller ved cervikal biopsi prøveudtagning.
Cervikal biopsi prøveudtagning er en invasiv metode, der øger ubehag og risiko for blødning og tager 2 til 11 dage for at helbrede følge fremgangsmåden afhængigt immunstatus kvinde 12. På den anden side, cervikale cytobrushes, til trods for lavere udbytte af opsamlede celler, er en mindre invasiv og mere bekvem metode til at indsamle immunceller fra FGT. Begge metoder kan nå det samme udbytte af CD45 + leukocytter, men to sekventielle cervikale cytobrushes er nødvendige for at opnå den samme mængde celler indeholdt in en biopsi 13. Alligevel cytobrush prøveudtagning giver stadig et acceptabelt antal celler (ca. 5.000 CD45 + celler / cytobrush) for yderligere ex vivo fænotypebestemmelse ved flowcytometri 14. Desuden kan funktionel karakterisering udføres på disse prøver, som stimulering og intracellulær flowcytometri eller qPCR blevet udført under anvendelse cytobrush afledt CMCs at identificere HIV-specifikke immunresponser 17 eller Th cellepolarisering 18. Udvidelse af T-celler befolkning kan også lette funktionelle undersøgelser med CMCs 19.
Det er vigtigt at bemærke, at biopsier og cytobrushes prøve forskellige dele af FGT. Biopsier er afledt fra den overlegne del af epitel og stroma af ectocervix 12,13, mens cervikale cytobrushes prøve cervikale OS, indsamling af celler afledt af epithelium endocervix og formentlig overgangszonen. Cytobrush prøver derfor prøve en reregion består af et enkelt lag af søjleepitel, mens biopsier, omfatter en region foret med en skællede stratificeret epitel 5. Som et resultat, arten af leukocyt populationer indsamlet ved cervikal biopsi cytobrush forskellig. Biopsier indsamle en højere andel af CD3 + T-celler, hvorimod cytobrushes resulterer i opsamling af en højere andel af CD14 + monocytter / makrofager 13.
Studere immunologi af FGT har været en interesse i mange år 20-22, og vi har oparbejdet en stor ekspertise med studiet af cytobrush afledt CMCs. Vore undersøgelser fokuserer primært på studiet af hiv-smittede, inficerede og HIV-eksponerede seronegative (HESN) kvindelige prostituerede fra Nairobi, Kenya. HIV fortrinsvis replikerer i aktiverede T-celler 23 og lavere antal af aktiverede celler, der kan målrettes ved hiv i FGT kan bidrage til beskyttelse mod hiv erhvervelse. I overensstemmelse med denne hypotese, flere Studies har beskrevet lavere immunaktivering blandt HESN sexarbejdere, der er højt eksponeret for HIV alligevel forblive inficerede 24,25, og dette fredfyldte fænotype er også observeret i FGT 14. Her beskriver vi metoder til behandling og vurdering af T-celler aktivering i CMC prøver stammer fra cervikale cytobrushes ved ex vivo flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: De forskningsetik bestyrelser både University of Manitoba og Kenyatta National Hospital / University of Nairobi godkendt denne undersøgelse og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere.
1.. Udarbejdelse af Medier og CMC Collection Tubes
- Forbered phosphatbufret saltvand (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCI, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2PO 4). Autoklave for sterilitet. Dette kan opbevares ved 4 ° C i flere måneder.
- Pre-alikvot 5 ml PBS i 50 ml Falcon rør (én pr prøve, der skal indsamles), og opbevares ved 4 º C, indtil prøvetagningen tid.
- Mærk 2-4 kryoglas eller 1,5 ml mikrocentrifugerør pr prøve at indsamle udskylning til opbevaring.
- Forbered cellekulturmedier: RPMI 1640 + 1% penicillin / streptomycin / amphotericin B (slutkoncentration 100 enheder / ml, 100 pg / ml og 250 ng / ml, respektively, uden FCS / FBS tilsat.
2.. Indsamling af Cytobrush Prøver
Indsamling af cytobrush prøver er en non-invasiv procedure, der skal udføres af en uddannet MD eller gynækolog.
- Saml cervikal mononukleære celler (CMC) ved hjælp af både en cytobrush og en træ-eller plastic skraber. Saml CMC fra deltageren i spekulum undersøgelse ved at indsætte skraber og roterer omkring den cervikale OS (figur 1). Sæt cytobrush ind i de endocervikale OS, rotere 360 °, og straks placere både cytobrush og skraber i 50 ml Falcon rør indeholdende 5 ml PBS.
- Hold prøver på is / ved 4 º C indtil forarbejdning. For at opretholde cellelevedygtighed, proces prøver indenfor 2 timer efter prøvetagning.
- Hvis det er muligt, indsamle matchede blodprøver i grønne top heparin vacutainers for perifert blod mononukleære celler (PBMC) isoleret til at tjene som en komparator / styring CMC analyse.
3.. Isolering af CMCs
Udfør prøve behandling i et biosikkerhed niveau 2 laboratorium, i en steril biosikkerhed skab med dobbelte handsker.
- Under samling, kan CMC prøver blive forurenet med blod. Udelukke prøver med blodforurening fra undersøgelsen synlig for at forhindre forstyrrende optagelse af PBMC i den endelige prøve. På grund af det lave antal af lymfocytter isoleret fra CMC prøver kan forurening mindre blod let overvælde CMC lymfocyt komponent.
- Vortex falk rør indeholdende både cytobrush og skraber for 45 sekunder at dissociere celler fra børsterne. Prøver kan blive skummende under denne proces; dette er normalt.
- Brug cytobrush at skrabe resterende materiale fra skraberen, og kassér skraber i en blegemiddel løsning. At indsamle eventuelle celler stadig er fastgjort til børste / skraber, bruge en frisk handske at presse skraberen mellem tommel-og pegefinger.Glid ned børsten, så cellerne og PBS, der skal indsamles i samme 50 ml rør. Kassér cytobrush ind i en blegemiddel løsning, og kassér handsken.
VIGTIGT: Brug en ny handske for hver prøve. - Montér en 100 um nylon cellefilter til en frisk 50 ml Falcon rør. Ved hjælp af en overførsel pipette, indsamle PBS-celle suspension fra prøveglasset og filtreres gennem sien i den friske rør.
- Der tilsættes 5 ml RPMI 1640 til den oprindelige prøveglas. Brug overførselspipetten vaskes siderne af prøveglasset med RPMI, og overfør gennem filteret til den nye opsamlingsrør. Vask bunden af nylon filter med RPMI samt.
- Centrifuger prøverne for 10 min ved 514 x g.. Det er afgørende at forlade centrifugen bremsen i dette trin, for at undgå løsgørelse af CMC pellet.
- Fjern forsigtigt supernatanten fra røret, idet man ikke forstyrre bundfaldet. Pellet størrelse vil være meget varierende; i såme prøver pelleten er ganske stor på grund af tilstedeværelsen af et stort antal epitelceller, mens der i andre tilfælde pelleten er knapt synlige og meget gennemsigtigt.
- Pelleten resuspenderes ved forsigtig omrøring af Falcon-rør. Der tilsættes 5 ml PBS til at vaske prøven.
- Der centrifugeres igen i 10 minutter ved 514 xg uden centrifuge bremse.
- Kassere forsigtigt supernatanten og re-suspendere pellet som ovenfor. Cellerne er klar til enten nedfrysning (ved hjælp af en PBMC nedfrysning protokol), stimulation eller flowcytometri fænotypebestemmelse.
4.. CMC Surface Farvning og flowcytometri
- Resuspender pellet fra trin 3.10 i 100 pi blokeringsopløsning og overføre enten ind i en 96-brønds plade eller FACS rør. Den blokerende opløsning (for at blokere Fcy-receptorer) opskrift er som følger: 1.8 pi muse-IgG (slutkoncentration 0,2 pg / pl), 5 pi FBS og 93,2 pi FACS vask (PBS +2% FBS).Farvning kan udføres i en 96 brønds plade, hvis pillestørrelser er små nok, men muligvis udføres i FACS-rør, hvis pellets rutinemæssigt store. Det er vigtigt at titrere antistoffer i overensstemmelse hermed.
- Bloker prøverne for 10 minutter på is / ved 4 ° C.
- Vask cellerne med 100 pi FACS Wash (PBS +2% FBS) i 96-brønds plader eller 500 pi i FACS-rør. Centrifuger ved 600 xg i 10 minutter ved 4 ° C med bremsen på lav (eller fra, hvis en lav bremse indstilling er tilgængelig).
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten ved omrøring. Tilføj levedygtighed Stain (Live Dead fixable levedygtighed farvestof). Forbered levedygtighed farvestof i henhold til producentens anvisninger. Det kan være nødvendigt at titreres til brug i hver lab / cytometer setup. Der inkuberes i 30 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellerne 100 μl/500 pi PBS (for 96-brønds plade / FACS-rør). Centrifuger ved 600 xg i 10 min med lav / ingen bremse. Fjern supernatant og resuspender cellerne.
- Inkubér cellerne med cocktail af overflade markør-antistoffer, i et samlet volumen på 100 ul. VIGTIGT: Optimer og titreres hver flowcytometri panel før at prøve farvning. Cellerne inkuberes i 30 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Gentag trin 4.5. hvis farvning i en 96-brønds plade, overføre cellerne til et FACS-rør og fortyndes til et slutvolumen på 750 pi FACS Wash indeholdende 1% paraformaldehyd (PFA) (eller CytoFix, fortyndet 1 til 4). Fortsæt til dataopsamling på et flowcytometer.
5.. Indsamling og klargøring af cervikal Vaginal lavage (CVL)
- Før cytobrush prøveudtagning, bruge en sprøjte til at vaske endocervix med 2 ml sterilt PBS og aspireres udskylning fra den bageste fornix.
- Saml den aspirerede udskylning prøven i et 15 ml Falcon rør og holde på is / ved 4 º C indtil forarbejdning.
- Centrifugeres prøven ved 400 x g i 7 minutter for at fjerne cellerester.
- Collect supernatanten, portion prøven i 1 ml eller 500 pi portioner og opbevares ved -70 ° C. Aliquots kan optøs til ELISA eller perle array analyse af CVL proteiner, men undgå flere fryse / tø cykler.
- Hvis det ønskes, pellet resuspenderes celleaffald i RNA Senere at måle RNA-ekspression ved at følge fabrikantens protokol.
6.. Dataopsamling
- Forbered et sæt af erstatningsordninger rør, der matcher antistof panel. Kør den kompensation rør til at justere spektral overlapning. Køre prøver på en flerfarvet flowcytometer, der er konfigureret til fluorochrom-konjugerede antistoffer, der anvendes i panelet.
- Anskaf en PBMC prøve først at justere Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC) spænding for at detektere lymfocytpopulationen. Prøv at holde dem ved 100 på hver akse på en lineær skala. Kørsel af en PBMC kontrol vil gøre det betydeligt lettere at finde CMC lymfocytpopulationen.
- Kan være nødvendigt at forøget i forhold til PBMC prøver grund at smøre op SSC-aksen ved lave FSC-værdier FSC tærskel for CMC prøver.
- Vortex hvert rør før erhverve. Erhverve hele røret for at maksimere antallet af lymfocytporten begivenheder indsamlet. Overvåge maskinens omhyggeligt for at undgå tilstopning.
- Eksportere data i en flowcytometrisk analyse program som FlowJo.
7.. Gating Strategi
- Vælg Videresend side scatter høj (FSC-H) / Fremad sidespredning område (FSC-A) til at bestemme singlet befolkning.
- Vælg Time versus fluorescerende markør (som eksempel FITC) til at styre for kvaliteten af anskaffelsen. Flowændring kan indføre artefakter i dataene. Udelukke enhver område, der viser uoverensstemmelse i flow.
- Identificer lymfocytpopulationen på SSC-A/FSC-A plot. Brug en PBMC kontrol for at lette identifikationen. Bemærk, at CMC lymfocytpopulationen måske ikke være så klar som PBMC kontrol. </ Li>
- Gate på SSC-A/viability farvestof at udelukke døde celler fra levende celler. Døde celler kan ikke-specifikt optage antistoffer, som vil introducere artefakter.
- Gate på SSC-A/CD3 at identificere T-celle population. Fra denne port, identificere CD4 + og CD8 +-populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multiparameter flowcytometri er et kraftfuldt værktøj til at dissekere de fænotyper og funktioner celleundersæt i tidligere ukarakteriserede væv. Analyse af CMC prøver kan give oplysninger om både lymfocyt-og monocyt populationer med passende gating strategier.
En repræsentant CMC gating strategi i forhold til en matchet PBMC profil, er vist i figur 2. FSC-A versus FSC-H plot tillader udelukkelse af celle-dubletter, som er meget udbredt i CMC prøver sammenlignet med PBMC, selv efter filtrering (Figur 2A). Kvalitetskontrol omfatter fjernelse af flow spørgsmål ved gating på tid, hvor let kan identificeres ændringer i flow eller artefakter som følge af prøve klumper (figur 2B). Identifikation af lymfocyt / monocyt populationer er forholdsvis ens i både PBMC og CMC prøver (figur 2B). Udelukkelse af døde celler ved levedygtighed farvestof forhindrer inklusionaf apoptotiske celler, der er ikke-specifikt taget op fluorescerende antistofkonjugater. Levedygtighed er lavere i CMC prøver sammenlignet med PBMC, og kan være meget varierende fra prøve til prøve (figur 2B).
Denne analyse vil fokusere på fænotypebestemmelse T lymfocytpopulationen, men CMC prøver indeholder også monocytter. Efter gating på monocytten befolkning, celler gated baseret på en levedygtighed farvestof og en dump-kanal (figur 3A). Den dump kanal indeholder antistoffer mod CD56, CD3 og CD19, og gating på dump kanal-negative celler vil fjerne enhver lymfocyt forurening i monocytaktiveringsassayet befolkning. Celler kan derefter identificeres baseret på ekspressionen af markører, såsom CD16 og CD11. CD3 + lymfocytpopulation typisk reduceres proportionalt blandt CMC forhold til PBMC (figur 3B, tabel 1). Den høje andel af epitelceller, granulocytter og ikke CD3 + CD45 +-leukocytter, der er indeholdt i CMC prøver dominates over T-celle population. CD4 + T-celler (median: 55,30%, IQR: 50.53% -68,18%) og CD8 +-T-celler (median: 25,60%, IQR: 21,50% -33,80%) findes ved et lavere forhold (tættere til 2:1 blandt CMC) i forhold til 5:1 observeret blandt raske PBMC prøver fra kommercielle sexarbejder kohorte i Kenya (figur 3C, tabel 1). Som i blod, HIV-infektion påvirker andelen af CD4 + og CD8 + T-celler blandt CMC, faldende CD4 +: CD8 +-forholdet til 0,7 (median: 0,7, IQR: 0,31-2,45) (figur 3C, tabel 1). Imidlertid er det ikke ualmindeligt at observere en højere andel af CD8 + T-celler blandt CMC populationer fra raske individer (figur 3C). Interessant, en udvidet CD4-CD8-(dobbelt negativ, DN) T-celle population i forhold til PBMC DN T-celle frekvens kan observeres blandt mange CMC prøver af hiv-negative individer (tabel 1). Disse resultater svarer til dem opnået for forhud prøver 26, althoUH disse celler er dårligt karakteriseret.
Typiske T-celle fænotypemarkører let kvantificeres blandt CMCs men kan afvige fra PBMC'er, Figur 4 viser identifikation af en CD8 + CD161 + + (MAIT) befolkning, der er forskellige i PBMC'er men næsten fraværende i CMCs (figur 4A). Angivelse af aktivering markører CD69 og HLA DR, migration markør CCR5 eller udmattelse markør PD-1 tydeligt kan identificeres på CD4 + eller CD8 +-populationer (figur 4B).
Kvantificering af koncentrationen af cytokiner / chemokiner i CVL kan analyseres parallelt med CMC-farvning. Dette giver mulighed for sammenhæng mellem CVL cytokin milieu (pro-inflammatorisk versus immunoregulatorisk) og fænotype CMCs. Disse data kan også anvendes til at bestemme, om frekvensen af chemokinreceptor-ekspression på CMCs er relateret til den relative ekspression af enten plasma eller CVL kemokiner 14. Tabel 2 </ Strong> angiver den gennemsnitlige koncentration af cytokin og kemokine analytter i CVL indsamlet fra raske kvinder og analyseret af Milliplex cytokin perle array-kits.
Figur 1.. Anatomi af den kvindelige reproduktive tarmkanalen. A) Tværsnit af de kvindelige kønsveje, som viser forholdet af skeden til det ydre cervikal OS, cervikalkanalen og livmoderhulen. B) Front vinkel baggrund af livmoderhalsen, der viser de ydre OS, og forreste og bageste fornix regioner på 12.00 og 06:00, hhv. Gengivet med tilladelse fra Reusch et al 27. Cervikal skraberen drejes omkring den cervikale os at indsamle CMC, mens cytobrush indsættes i cervikalkanalen og roteres til at indsamle yderligere CMC. Cervikal vaginale udskylninger (CVL)opsamles ved vask endocervix med PBS og opsamling af den fra den bageste fornix.
Figur 2. Gating og kvalitetskontrol af CMC prøver. A) Identifikation af slåbrokker af FSC-A versus FSC-H plot viser den lave procentdel af slåbrokker i CMC prøver i forhold til PBMC prøver, selv efter filter-baserede CMC isolation. B) Eksempler på høj og fattige prøver kvalitet er vist for adskillige kvalitet kontrol trin. Gating af Time versus fluorescens (eller SSC / FSC) kan identificere flowhastigheden spørgsmål, og anvendes til at udelukke begivenheder, der kan resultere i farvningsteknikker artefakter. En lymfocytpopulation baseret på FSC versus SSC måske eller måske ikke let identificeres afhængigt af prøven. Inddragelse af et levedygtighed farvestof er afgørende, da nogle prøver kan indeholde færre end 50% levedygtige celler. Viability (aminreaktiv) farvestoffer pletten døde celler mere klart end levende celler, som tab af membran-integritet ved celledød tillader farvestof at få adgang til amingrupper på proteiner i cellen. Levedygtige celler er derfor identificeret ved gating på levedygtighed dye-negativ population.
Fig. 3. Identifikation af T-celle delmængder. A) CD3 +-populationen blandt CMC prøver er generelt en mindre andel af lymfocytporten forhold til PBMC prøver. CMC prøver er også mere variabel i størrelsen af T-celle population, som vist. B) CD4 +, CD8 + og CD4-CD8-T-cellepopulationer er let identificeret i både CMC og PBMC prøver. CD4: CD8-T-celle-forhold kan variere fra prøve til prøve blandt CMCs som vist. Viste data blev indsamlet fra HIV-ikke-inficerede kvinder.
Figur 4.. T-celle fænotyper i CMC prøver. A) slimhinde forbundet invariante T-celler (MAIT) CD8 + CD161 + + befolkning, der er let identificeres i PBMC prøverne er næsten helt fraværende i CMCs. CD8 + CD161 + T-celler kan identificeres på begge prøver. B) CMCs udviser ekspression af fænotypiske markører, herunder CD69, HLA DR, CCR5 og PD-1. Gates blev trukket baseret på fluorescens minus én (FMO) kontrol. Viste data blev indsamlet fra HIV-ikke-inficerede kvinder.
| CMCs | PBMC'er | |||||
| Befolkning | HIV + (n = 34) | HIV-(n = 44) | P-værdi a | HIV + (n = 28) | HIV-(n = 35) | P-værdi a |
| median (IQR) | median (IQR) | median (IQR) | median (IQR) | |||
| % Levende lymfocytter | 85,65 (60.25-92.63) | 88,70 (74.85-95.38) | 0,1193 | - | - | |
| % CD3 + i levende lymfocytporten | 5,94 (0,90 til 16,80) | 1,44 (0,39-8,46) | 0,0303 | 41,15 (17.08-62.10) | 41,90 (20.40-51.30) | 0,4231 |
| p-værdi b | <0,0001 | <0,0001 | ||||
| % CD8 + i CD3 + gate | 43,20 (25.75-66.00) | 25,60 (21.50-33.80) | 0.001 | 30,05 (22.75-38.78) | 14,60 (8.01-24.80) | <0,0001 |
| p-værdi b | 0,0291 | <0.0001 | ||||
| % CD4 + i CD3 + gate | 31,10 (20.45-63.10) | 55,30 (50.53-68.18) | 0,0003 | 56,10 (50.10-61.28) | 77,20 (65.90-92.80) | <0,0001 |
| p-værdi b | 0.002 | <0,0001 | ||||
| Ratio CD4: CD8 | 0,71 (0.31-2.45) | 2,09 (1,55-3,01) | 0,0003 | 1,92 (1,44-2,39) | 5,34 (2,66-10,77) | <0,0001 |
| p-værdi b | 0.004 | <0,0001 | ||||
| % DN i CD3 + gate | 10,40 (6.36-14.30) | 10,70 (6.76-19.10) | 0,4793 | 9,58 (6.65-15.98) | 7,01 (5,26-8,07) | 0,0032 |
p-værdi | 0,8338 | 0,0006 | | ||||
Tabel 1. Relative andele af T-celledelmængder i CMCs og PBMC'er. CMCsamples fra 44 hiv-negative og 34 hiv-positive kvindelige sexarbejdere og PBMC prøver fra 35 hiv-negative og 28 hiv-positive blev sammenlignet for deres relative andel af levende celler, CD3 + T-celler og CD4 +, CD8 + og CD8-CD4-DN T-celle delmængder. Data er præsenteret som median (25 th -75 th interkvartile, IQR). Forskelle mellem grupper blev beregnet ved Mann-Whitney testen. p-værdier angiver resultatet af en sammenligning mellem en HIV + og HIV-eller b CMC og PBMC data.
| Analyt | Betyde en (Std dev.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35,5 (90,6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Fractalkin | 51,6 (69,5) | 10.6 |
| IFN-a2 | 24,0 (12,0) | 40.6 |
| IFN-g | 3,9 (14,2) | 0.3 | IL-1a | 268,4 (721,3) | 6.4 |
| IL-1b | 46,8 (126,2) | 0.7 |
| IL-1 ra | 4967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0,9 (2,6) | 0.6 |
| IL-6 | 14,8 (30,5) | 0.7 |
| IL-7 | 6.3 (10.1) | 0.1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4,5 (8.6) | 0.5 | |
| IL-15 | 1,4 (2,7) | 0.7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| IP-10 | 381,4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129,4 (340,4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5,9 (7,1) | 3.7 |
| MDC | 84,2 (94,6) | 6.9 |
| MIP-1a 20,9 (28,9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28,5 (42,6) | 8.9 |
| sCD40L | 10,8 (19,3) | 9 |
| sIL-2Ra | 8,4 (9,8) | 7.7 |
| TNF-a- | 1,9 (4.1) | 0.1 |
Tabel 2.. Angivelse af cytokiner og kemokiner i CVL. Prøver fra 51 HIV-ikke-inficerede (ikke-HESN) deltagere i den kvindelige sexarbejder kohorte medio menstruationscyklus blev analyseret for cytokin / kemokin koncentration vha. Milliplex MAP Menneskelige Cytokine / Chemokine perle matrix kit ifølge producentens'S overnight protokol, analyseret i to eksemplarer. IFN: interferon; MCP: monocytkemotaktisk protein; MDC: makrofag afledte kemokiner s: opløselig; TNF: tumornekrosefaktor; MIP: makrofag inflammatorisk protein; ITAC: interferon inductible T-celle-alpha kemoattraktant; MIG: monokin induceret af gamma-interferon; IP-10; interferon inductible protein. et Værdier under detektionsgrænsen blev tildelt en værdi på halvdelen af detektionsgrænsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I betragtning af de store huller i viden med hensyn til immunitet på kvindelige kønsorganer (FGT) kan fænotypisk analyse af CMCs levere en bred vifte af indsigt i flere lymfocytpopulationer på livmoderhalsen. Kombineret med proteom analyse og virusbelastningsrespons målinger i livmoderhalskræft udskylning, kan immunitet over for seksuelt overførte infektioner (STI) s og andre patogener dissekeres i forskellige populationer.
Tekniske overvejelser - CMCs: Den isolation og vellykket farvning af CMC prøver kan være udfordrende. Optimering af CMC kollektion protokollen har understreget effektiviteten af opsamling af CVL først, efterfulgt af livmoderhalskræft skraber og derefter endelig cytobrush. Det er vigtigt at øge planlagte prøvestørrelser i forhold til dem, der beregnes til undersøgelser perifert blod på grund af den øgede sandsynlighed for udelukkelse prøven til en række forskellige årsager, beskrevet nedenfor.
Afprøvning af ønsketd flow panel på CMC prøver er afgørende, før at studere indvielse. Det er vigtigt at overvåge celle autofluorescens CMC prøver, især i monocyt gate. CMC autofluorescens i nogle kanaler kan være forhøjet i forhold til PBMC'er, hvilket kan påvirke gating og signal-til-støj-forhold. Desuden bør optimale spændinger bekræftes for CMC prøver, hvis tidligere bestemt på PBMC prøver.
For at bevare data integritet, er det vigtigt at udelukke prøver med blod forurening eller confounding sexsygdomme. Inddragelsen af en celle levedygtighed farvestof i flowcytometri panelet er afgørende for at udelukke døde celler, der ikke specifikt tager op fluorescerende antistoffer. Mens de fleste prøver er meget levedygtig, er det ikke ualmindeligt at udelukke 10-20% af celler ved levedygtighed farvestof. Hvis der planlægges delanalyse baseret på CD4 og CD8 udtryk, er det vigtigt at få mindst 100 CD3 + arrangementer for at fortsætte analysen. Prøver indsamlet fra forskellige kvinder, og selv fra den samme kvinde en t forskellige tidspunkter, kan give vidt forskellige celletal 13.
Flow cytometri af slimhinde lymfocytter er ofte lettere og mere vellykket, hvis en PBMC kontrolprøve kan køre samtidig med CMC prøver. I nogle CMC prøver, er vanskelig af FSC / SSC gating at identificere lymfocytpopulationen, men inddragelse af PBMC prøven vil give en bedre idé om, hvor at gate. Selv i prøver uden en klar lymfocyt FSC / SSC befolkning, kan identificeres særskilt CD3 +-populationer. Hvis købet dataene er afbrudt af tekniske problemer (cytometer indtagelse tilstopning, bobler osv.) gating på fluorescens over tid kan fjerne dataindsamling artefakter mens det stadig tillader analyse prøve. Passende kontroller såsom fluorescens minus én (FMO) rør til gate placering skal muligvis udføres på perifere mononukleære blodceller (PBMC), når antallet af celler, der kræves, er for stor til at bruge cytobrush prøver.
NDHOLDET "> Flere undersøgelser har vist, at påvisning af antigen-specifikke T-celle responser blandt CMC prøver. kan CMC cytokinproduktion også induceres med PMA / Ionomycine PHA, IFNy og anti-CD3-stimulering. En af de vigtigste begrænsninger for CMC stimuleringer er celle nummer, som reducerer antallet af betingelser og kontrol, der kan udføres per prøve. Det er også afgørende for nøje at overvåge og tage ekstra skridt til at forhindre celle forurening kultur. kønsorganerne er ikke et sterilt sted, og i nogle tilfælde ekstra antibiotika skal føjes til dyrkningsmedier for at forhindre bakteriel overvækst. Selvom CMCs kan kryopræserveres med lidt tab af levedygtighed, nyttiggørelse er omkring 50%, hvilket gør kryopræserverede prøver dårlige kandidater til stimulering studier medmindre celleekspansion er planlagt 10.Tekniske overvejelser - CVLS: Indsamling af CVL normalt resulterer i begrænset prøve vol.ume, forhindrer analyse af et stort antal af proteinkoncentrationer ved gentagen ELISA. En alternativ assay er cytokinet bead array, baseret på Luminex platform eller Flowcytometri platform. Multipleksede kits er tilgængelige fra flere kommercielle kilder, der giver mulighed for kvantificering af op til 30 analytter i en meget lille prøvemængde (ofte ~ 25 ul). Optimering af disse assays har vist optimal påvisning af analytter ved hjælp af inkubation natten over protokollen. Nogle analytter, der er detectible i plasma / serumprøver er ikke detectible i CVL. Navnlig havde koncentrationen af CVL prøver under anvendelse spin-søjler ikke forbedre påvisning af eventuelle analytter, hvilket tyder på, at der ikke er nogen fordel koncentration prøven forud for kører perlen matrix assay.
Konfoundere specifikke for genitale slimhinder: studier af FGT immunologi skal sørge for at anerkende og tegner sig for så mange forstyrrende variabler som muligt. Menstruationscyklus hsom nu er blevet påvist at påvirke blod immunitet perifere 28, og sandsynligvis udøver større indvirkning på CMC fænotype og cellesammensætning samt proteinerne indsamlet fra CVL prøver 29. Synkronisering prøvetagning til menstruationscyklus fase er den foretrukne måde at reducere variabilitet data, uanset om målt ved østrogen / progesteron niveauet eller dage siden den første dag i sidste menstruation. Anvendelse af hormonal prævention også i høj grad påvirker den mucosale miljø og dens virkning skal tages i betragtning ved udformning eller analyse af en undersøgelse. Ændring af den vaginale flora resulterer i bakteriel vaginose (BV) ændrer også immun miljø og cellefænotyper. BV kan diagnosticeres ved Gram-farvning og kan oprettes en Nugent score for at kontrollere for confounding effekt af BV.
Seksuel aktivitet har også en dybtgående indvirkning på genital immunologi, da allo-reaktioner på sæd kan fremkalde hurtige og dramatiske ændringer i cell fænotype og menneskehandel. Faktisk Lajoie, et al. har beskrevet forskelle i CVL protein sammensætning mellem prostitueret og ikke-prostitueret befolkninger med forandringer i de første par år efter initiering af sexarbejde.
Endelig vil kulturelle praksisser såsom douching indføre yderligere variation i slimhinde prøveudtagning. Afhængigt af det anvendte reagens (blegemiddel, vaskemiddel, limesaft, etc.), kan douching reducere hyppigheden / fænotype af cellepopulationer eller ændre autofluorescens i forhold til andre prøver. Ideelt set bør douching før cytobrush prøvetagning blive afskrækket blandt donorer.
Fremtidige anvendelser: Ud over at giver vigtig indsigt i reguleringen af slimhindeimmunitet under menstruation / hormonelle variabilitet, viral / bakteriel infektion og før / efter overgangsalderen, analyse af slimhinde prøver er især relevant for vaccine studier mod SOI / slimhinde patogener. I tilfælde af HIV,hvor et vigtigt mål for undersøgelser vaccine er at fremkalde en mucosal antistof eller T-celle respons, vil udvikling af CMC-baserede assays spille en afgørende rolle i fastlæggelsen korrelater for beskyttelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
