Introduction
Die Mehrheit der HIV-Neuinfektionen weltweit durch heterosexuelle Übertragung entstehen, mit Frauen, die 47% der Neuinfektionen im Jahr 2011 (UNAIDS 1). Das Verständnis der weiblichen Genitaltraktes (FGT), einer der Haupteingangsportale für HIV und andere sexuell übertragbare Erreger, ist von großer Bedeutung auf dem Weg zur Suche nach effizienten Strategien, um Infektionen zu vermeiden. Immunantworten im Genitalschleimhaut deutlich einzigartig und unterscheiden sich von denjenigen im peripheren Blut 2 gemessen. Allerdings ist die Kenntnis der aktuellen Immundynamik an der FGT allenfalls begrenzt. Bisher haben Studien der Schleimhautimmun Umwelt weitgehend auf den Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT), wo es ist klar geworden, dass die frühen Ereignisse im Schleimhautgewebe nach der Infektion einen starken Einfluss auf nachfolgende Fortschreiten der Krankheit 3,4 haben konzentriert. Sammelproben aus der Genitalschleimhaut stellt eine große Herausforderung und ist zumindest teilweise verantwortlich für die lack Verständnis der Immunologie der FGT. Die Lösung des Rätsels der Immun Dynamik zwischen Wirt und Pathogen in Zusammenhang mit der Umwelt, die die unterschiedlichen FGT erfordert effiziente Methoden zur Erfassung und Analyse von Proben aus diesem Gebietsschema ist.
Die FGT ist in zwei Abschnitte unterteilt: der obere Fortpflanzungsorgane, die die Eileiter, Endometrium und Endocervix und den unteren Darm-Trakt, die die Ektozervix enthält und die Vagina enthält (von Kaushic prüft et al 5). Es ist immer noch unklar, was der relative Beitrag dieser verschiedenen Websites ist es, HIV-Infektion, aber es wird angenommen, dass beide Seiten könnten, um HIV-Eintritt 6 beitragen. T-Zellen repräsentieren 40-50% der Leukozyten in den oberen und unteren Fortpflanzungsorgane, während Makrophagen umfassen ca. 10% (in Rodriguez-Garcia et al Bewertung 2). T-Zellen können in der Vagina, Gebärmutterhals, Endometrium nachgewiesen werden. Makrophagen sind stärker localiim Endometrium und Myometrium-Bindegewebe als der Zervix zed, obwohl sie in beiden Geweben nachgewiesen werden. Schließlich kann plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) und Langerhans-Zellen auch in FGT Gewebe nachgewiesen werden. Der Phänotyp und Proportionen von Immun Populationen und ihrer Anfälligkeit für eine HIV-Infektion kann allem je nach Hormonzyklen, die Verwendung von hormonellen Kontrazeptiva, bakterielle Vaginose oder sexuelle Aktivitäten 5,7-9.
Diverse Verfahren sind entwickelt worden, um die Immun Populationen und der Umgebung des FGT studieren. Cervical Biopsie-, Gebärmutterhals-und cytobrushes zervikovaginalen Spülungen (CVL) 10-12 sind die am häufigsten in der Literatur verwendet. CVL Sammlung von PBS Spülung ist das einfachste Verfahren und erlaubt die Untersuchung der immunmodulierenden Proteine führt jedoch zu extrem niedrigen Zellausbeute und eignet sich deshalb nicht für die Untersuchung der Immunzellpopulationen der FGT 13. CVL Proben andererseits vEry nützlich für die Bewertung der Immun Umgebung der FGT durch Messung der Expression von verschiedenen Zytokinen, Chemokinen oder antimikrobielle Faktoren unter Verwendung von Verfahren, wie ELISA, Cytokin Perlenanordnung 14 oder Massenspektrometrie 15,16. Charakterisierung der Immunzellfrequenzen Phänotypen und Funktionen können durch Sammeln zervikalen mononukleären Zellen (CMC), durch zervikale Zytobürste oder durch zervikale Biopsieprobennahme erreicht wird.
Cervical Biopsien ist eine invasive Methode, die die Beschwerden und das Risiko von Blutungen erhöht und nimmt 2 bis 11 Tage, um zu heilen nach dem Verfahren je nach Immunstatus der Frau 12. Auf der anderen Seite, Gebärmutterhals cytobrushes trotz der geringeren Ausbeute an Zellen gesammelt, ist eine weniger invasive und bequeme Methode, um die Immunzellen aus dem FGT sammeln. Beide Verfahren können die gleiche Ausbeute an CD45 +-Leukozyten zu erreichen, aber zwei aufeinander zervikalen cytobrushes sind notwendig, um die gleiche Menge an Zellen enthielt, erhalten wurde in ein Biopsie-13. Dennoch bietet immer noch Zytobürste Probenahme eine zulässige Anzahl von Zellen (etwa 5000 Zellen CD45 + / Zytobürste) für weitere ex vivo Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie 14. Außerdem können funktionelle Charakterisierung an diesen Proben durchgeführt werden, wie Stimulation und intrazelluläre Durchflusszytometrie oder qPCR wurden unter Verwendung von CMCs Zytobürste abgeleiteten HIV-spezifischen Immunantworten 17 oder Th-Zell-Polarisation 18 zu identifizieren. Erweiterung der T-Zellen können auch Bevölkerung erleichtern funktionelle Studien mit CMC 19.
Es ist wichtig zu beachten, dass Biopsien und cytobrushes Probe unterschiedliche Abschnitte der FGT. Biopsien sind von der überlegenen Teil des Epithel und Stroma der Ektozervix 12,13 abgeleitet, während Gebärmutterhalskrebs cytobrushes probieren Sie die Muttermundes, Sammeln von Zellen aus dem Epithel der Endocervix und vermutlich der Transformationszone abgeleitet. Cytobrush Proben daher probieren Sie eine Wiedergion aus einer einzigen Schicht von Epithel besteht, während Biopsien, umfassen einen Bereich von einem geschichteten Plattenepithel Epithel 5 ausgekleidet. Als Folge der Natur der Leukozyten-Populationen durch zervikale Biopsie und Zytobürste gesammelt unterscheidet. Biopsien sammeln einen höheren Anteil an CD3 +-T-Zellen, während cytobrushes führen Sammlung von einem höheren Anteil an CD14 + Monozyten / Makrophagen 13.
Das Studium der Immunologie der FGT ist seit vielen Jahren 20-22 ein Interesse, und wir haben viel Know-how mit dem Studium der Cytobrush abgeleitete CMC angesammelt. Unsere Untersuchungen konzentrieren sich vor allem auf die Untersuchung von HIV-infizierten, nicht-infizierten und HIV-seronegativen ausgesetzt (HESN) Sexarbeiterinnen aus Nairobi, Kenia. HIV repliziert vorzugsweise in aktivierten T-Zellen 23 und eine geringere Anzahl an aktivierten Zellen, die von HIV in der FGT richtet werden kann, könnte den Schutz vor HIV-Ansteckung bei. Im Einklang mit dieser Hypothese mehrere studies wurden geringere Immunaktivierung unter HESN Sexarbeiterinnen, die hoch HIV ausgesetzt werden beschrieben bleiben doch nicht infizierten 24,25, und das Ruhe Phänotyp ist auch in der FGT 14 beobachtet. Hier beschreiben wir Methodik für die Verarbeitung und Bewertung von T-Zellen-Aktivierung in CMC-Proben von Gebärmutterhalskrebs cytobrushes durch ex vivo Durchflusszytometrie abgeleitet.
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Protocol
Ethik-Erklärung: Die Forschungsethik Vorstand von der Universität von Manitoba und Kenyatta National Hospital / University of Nairobi genehmigt diese Studie und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Studienteilnehmern erhalten.
1. Vorbereitung der Medien und CMC Röhrchen
- Vorbereitung phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)-Lösung (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4). Autoklav zum Sterilität. Dies kann bei 4 º C mehrere Monate gelagert werden.
- Pre-aliquote 5 ml PBS in 50 ml Falcon-Röhrchen (eine pro Probe gesammelt werden) und bei 4 º C bis zur Probenentnahme Zeit.
- Beschriften 2-4 Kryoröhrchen oder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pro Probe Spülung für die Lagerung zu sammeln.
- Vorbereitung Zellkulturmedien: RPMI 1640 + 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B (Endkonzentration 100 Einheiten / ml, 100 ug / ml und 250 ng / ml, je wEly, ohne FCS / FBS aufgenommen.
2. Sammlung von Proben Cytobrush
Sammlung von Proben Zytobürste ist ein nicht-invasives Verfahren, das von einem geschulten MD oder Gynäkologen durchgeführt werden müssen.
- Sammeln Gebärmutterhalskrebs mononuklearen Zellen (CMC) unter Verwendung sowohl einer Cytobrush und einem Holz-oder Kunststoffschaber. Sammeln CMC vom Teilnehmer unter Spekulumuntersuchung, indem Sie den Schaber und rund um den Muttermund dreht (Abbildung 1). Legen Sie die Cytobrush in die endocervical-Betriebssystem, um 360 ° drehen und sofort legen sowohl die Cytobrush und Schaber in die 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 5 ml PBS.
- Halten Proben auf Eis / bei 4 º C bis zur Verarbeitung. Um die Lebensfähigkeit der Zellen, Prozessproben innerhalb von 2 h Sammlung aufrecht zu erhalten.
- Wenn möglich, sammeln abgestimmt Blutproben in grüne Spitze Heparin-Vacutainer für periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) Isolierung als Komparator / Steuerung für CMC-Analyse dienen.
3. Isolierung von CMC
Führen Sie die Probenverarbeitung in einem Labor der Sicherheitsstufe 2, in einer sterilen Biosicherheitsschrank mit Flügelhandschuhe.
- Bei der Abholung kann CMC kontaminierten Proben mit Blut zu werden. Proben mit sichtbaren Blutkontamination aus der Studie ausschließen, um verwirrende Einbeziehung von PBMC in der letzten Probe zu verhindern. Aufgrund der geringen Anzahl von Lymphozyten von CMC-Proben isoliert, können kleine Blutkontamination leicht überwältigen die CMC-Lymphozyten-Komponente.
- Wirbel-Falcon-Röhrchen, die sowohl das Zytobürste und Abstreifer für 45 Sekunden, um Zellen von den Bürsten zu dissoziieren. Proben können schaumig während dieses Prozesses zu werden; das ist normal.
- Verwenden Sie die Cytobrush, um alle verbleibenden Material aus dem Schaber abkratzen, und entsorgen Sie die Schaber in ein Bleichmittel-Lösung. Um alle Zellen bleiben auf den Pinsel / Schaber angebracht sammeln, verwenden Sie einen frischen Handschuh, den Schaber zwischen Daumen und Zeigefinger zusammendrücken.Schieben Sie die Bürste, so dass die Zellen und PBS in der gleichen 50-ml-Tube gesammelt werden. Entsorgen Sie die Cytobrush in eine Bleichlösung, und entsorgen Sie den Handschuh.
WICHTIG: Verwenden Sie einen neuen Handschuh für jede Probe. - Setzen Sie einen 100 um Nylon Zelle Sieb, um ein frisches 50 ml Falcon-Röhrchen. Verwendung einer Transferpipette, sammeln die PBS-Zellsuspension aus dem Probenröhrchen und dem Filter durch das Sieb in die frisches Röhrchen.
- 5 ml RPMI 1640 auf die ursprüngliche Probenröhrchen. Mit der Transferpipette, waschen Sie die Seiten der Probenröhrchen mit der RPMI und übertragen durch den Filter auf das neue Sammelröhrchen. Und wäscht den Boden der Nylonfilter mit RPMI.
- Zentrifugieren der Proben für 10 min bei 514 x g. Es ist entscheidend, um die Zentrifuge Brems aufhören bei diesem Schritt, um Herausziehen der CMC Pellet verhindern.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus der Röhre, kümmert sich um das Pellet nicht zu stören. Pelletgröße sehr unterschiedlich sein; in some Proben wird das Pellet ziemlich groß aufgrund der Anwesenheit einer großen Zahl von Epithelzellen, während in anderen Fällen ist das Pellet kaum sichtbar und hochtransparent.
- Das Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Falcon-Röhrchen. 5 ml PBS, um die Probe zu waschen.
- Zentrifuge wieder für 10 Minuten bei 514 xg ohne Bremse Zentrifuge.
- Vorsichtig den Überstand verwerfen und wieder aussetzen das Pellet wie oben. Die Zellen sind, bereit für die Kryokonservierung (mit PBMC Kryokonservierung-Protokoll), die Stimulation oder Durchflusszytometrie Phänotypisierung.
4. CMC Oberflächenfärbung und Durchflusszytometrie
- Das Pellet aus Schritt 3.10 in 100 ul Blockierungslösung und Transfer entweder in eine 96-Well-Platte oder FACS-Röhrchen. Die Blockierungslösung (Fc &ggr;-Rezeptoren zu blockieren) Rezeptur ist wie folgt: 1,8 ul Maus-IgG (Endkonzentration 0,2 &mgr; g / &mgr; l), 5 &mgr; l FBS und 93,2 &mgr; l FACS-Wasch (PBS + 2% FBS).Die Färbung kann in einer 96-Well-Platte durchgeführt werden, wenn Pelletgrößen klein genug sind, müssen aber möglicherweise in FACS-Röhrchen durchgeführt werden, wenn Pellets sind routinemäßig groß. Es ist wichtig, Antikörper entsprechend titrieren.
- Blockieren Sie die Proben für 10 Minuten auf Eis / bei 4 ° C
- Mit 100 &mgr; l FACS-Wash (PBS + 2% FBS) in 96-Well-Platten oder 500 &mgr; l FACS-Röhrchen in die Zellen zu waschen. Zentrifuge bei 600 × g für 10 min bei 4 ° C mit dem Brems auf niedrig (oder aus, wenn eine niedrige Brems Einstellung nicht verfügbar ist).
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet durch Bewegung. In Lebensfähigkeit Stain (Live Toten feststellbar Lebensfähigkeit Farbstoff). Vorbereitung Lebensfähigkeit Farbstoff nach den Anweisungen des Herstellers. Er muss dann für den Einsatz in jedem Labor / Durchflusszytometer Setup titriert werden. Inkubation für 30 min im Dunkeln bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Zellen μl/500 100 ul PBS (für 96-Well-Platte / FACS-Röhrchen). Zentrifugieren bei 600 g für 10 min mit geringer / ohne Bremse. Entfernen supernatant und resuspendieren Zellen.
- Inkubieren der Zellen mit der Mischung aus Oberflächenmarker-Antikörper in einem Gesamtvolumen von 100 ul. WICHTIG: Optimieren und titriert jedes Durchflusszytometrie Tafel vor der Färbung zu probieren. Zellen für 30 min im Dunkeln inkubieren bei 4 ° C.
- Wiederholen Sie Schritt 4.5. wenn Anfärben in einer 96-Well-Platte, Übertragungszellen zu einer FACS-Röhrchen und mit Wasser auf ein Endvolumen von 750 &mgr; l FACS-Wash mit 1% Paraformaldehyd (PFA) (oder Cytofix, verdünnt 1 in 4). Gehen Sie zur Datenerfassung auf einem Durchflusszytometer.
5. Entnahme und Vorbereitung von Gebärmutterhalskrebs Vaginal Lavage (CVL)
- Vor der Entnahme Cytobrush, verwenden Sie eine Spritze, um die Endocervix mit 2 ml steriler PBS waschen und saugen Sie den Spülung aus dem hinteren Scheidengewölbe.
- Sammeln Sie die angesaugte Spülung Probe in ein 15 ml Falcon-Röhrchen und halten auf Eis / bei 4 º C bis zur Verarbeitung.
- Zentrifuge Proben bei 400 × g für 7 min, um Zelltrümmer zu entfernen.
- Collect der Überstand, Aliquot der Probe in 1 ml oder 500 ul Aliquots und bei -70 ° C Aliquots können ELISA-oder Perlen Array Analyse der CVL Proteine aufgetaut werden, aber vermeiden Sie mehrfaches Einfrieren / Auftauen.
- Wenn gewünscht, das Pellet von Zelltrümmern in RNA später RNA-Expression durch folgende Protokoll des Herstellers gemessen.
6. Datenerfassung
- Einen Satz der Vergütung Rohre, die den Antikörper-Panel passt. Führen Sie die Ausgleichsrohre spektrale Überlappung einzustellen. Führen Sie die Proben auf jedem Multicolor Durchflusszytometer, dass ist für den Fluorochrom konjugierte Antikörper in der Gruppe verwendet, konfiguriert.
- Erwerben Sie eine Probe PBMC erste Forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Spannung, um die Lymphozytenpopulation erkennen einzustellen. Versuchen, sie bei 100 auf jeder Achse auf einer linearen Skala zu halten. Ausführen eines PBMC Steuer wird es deutlich einfacher, die CMC Lymphozyten-Population zu finden.
- Das FSC-Schwelle für die CMC-Proben müssen in Bezug auf PBMC-Proben wegen zu niedrigen Werten FSC schmieren die SSC-Achse erhöht werden.
- Mischen Sie jedes Rohr vor dem Erwerb. Erwerben das gesamte Rohr, die Anzahl der Lymphozyten-Gate Ereignisse gesammelt maximieren. Überwachen Sie die Maschine sorgfältig, um ein Verstopfen zu vermeiden.
- Exportieren der Daten in eine durchflusszytometrische Analyse Programm wie FlowJo.
7. Gating-Strategie
- Wählen Sie Weiterleiten Seitenstreuung hoch (FSC-H) / Vorwärts Seitenstreubereich (FSC-A) die Singulett-Bevölkerung zu bestimmen.
- Wählen Sie Zeit gegen Fluoreszierende Marker (wie zB FITC) für die Qualität der Akquisition steuern. Änderung der Strömungsrate kann zu Artefakten in den Daten einzuführen. Schließen Sie alle mögliche Fläche, die Diskrepanz in der Fließgeschwindigkeit zeigt.
- Identifizieren Sie die Lymphozyten-Population auf SSC-A/FSC-A Handlung. Verwenden Sie einen PBMC Steuerung, um die Identifizierung zu erleichtern. Beachten Sie, dass die CMC Lymphozyten-Population vielleicht nicht so klar wie die PBMC Kontrolle. </ Li>
- Tor auf SSC-A/viability färben, um tote Zellen von lebenden Zellen auszuschließen. Tote Zellen können nicht-spezifisch zu integrieren, die Antikörper, die Artefakte vorstellen wird.
- Tor auf der SSC-A/CD3, um die T-Zellpopulation zu identifizieren. Von diesem Tor, identifizieren die CD4 + und CD8 +-Populationen.
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Representative Results
Multi Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Phänotypen und Funktionen der Zell-Untergruppen in bisher nicht charakterisiertes Gewebe zu sezieren. Analyse von CMC Proben können Informationen sowohl Lymphozyten und Monozyten-Populationen mit entsprechenden Gating Strategien ergeben.
Ein Vertreter CMC Gating-Strategie, im Vergleich zu einem angepassten PBMC-Profil, ist in Abbildung 2 dargestellt. Das FSC-A gegen FSC-H ermöglicht Grundstück für den Ausschluss von Dubletten Zelle, die im Vergleich zu PBMC sehr weit verbreitet sind in der CMC-Proben, auch nach der Filtration (Fig. 2A). Die Qualitätskontrolle umfasst die Entfernung von Flussprobleme durch Gating auf Zeit, wo Änderungen in der Fließgeschwindigkeit oder Artefakte aufgrund der Proben Klumpen leicht identifiziert werden können (Abbildung 2B). Identifizierung der Lymphozyten / Monozyten-Populationen sowohl PBMC und CMC-Proben (Fig. 2B) relativ ähnlich. Ausschluss von toten Zellen durch Lebensfähigkeit Farbstoff verhindert die Aufnahmevon apoptotischen Zellen, die haben nicht eigens Fluoreszenz-Antikörper-Konjugate übernommen. Die Lebensfähigkeit ist niedriger in CMC-Proben im Vergleich zu PBMC und kann sehr variabel sein, von der Probe zu Probe (Abbildung 2B).
Diese Analyse wird auf Phänotypisierung der T-Lymphozyten-Population zu konzentrieren, aber CMC Proben Monozyten enthalten. Nach Gating auf dem Monocytenpopulation werden die Zellen auf der Basis eines Farbstoffes und Lebensfähigkeit einer Deponie Kanal (3A) verknüpft. Der Dump-Kanal enthält Antikörper gegen CD56, CD3 und CD19 und Gating auf Dump-Kanal-negativen Zellen keine Lymphozyten-Kontamination in der Monozyten-Population zu eliminieren. Zellen können dann auf der Basis der Expression von Marker wie CD16 und CD11c identifiziert werden. CD3 +-Lymphozyten-Population wird in der Regel im Verhältnis zu CMC reduziert im Vergleich zu PBMC (3B, Tabelle 1). Der hohe Anteil von Epithelzellen, Granulozyten und nicht CD3 + CD45 + Leukozyten in CMC Proben enthielten dominates über den T-Zellpopulation. CD4 + T-Zellen (Median: 55,30%, IQR: 50,53% -68,18%) und CD8 + T-Zellen (Median: 25,60%, IQR: 21,50% -33,80%) zu einem niedrigeren Verhältnis gefunden (näher zum 2:1 unter CMC) im Vergleich zum 5:1 bei gesunden PBMC-Proben aus dem Handels Sexarbeiterin Kohorte in Kenia (3C, Tabelle 1) beobachtet. Wie in Blut, HIV-Infektion betrifft die Anteile der CD4 + und CD8 + T-Zellen bei CMC, die Verringerung der CD4 +: CD8 +-Verhältnis von 0,7 (Mittelwert: 0,7 IQR: 0,31-2,45) (3C, Tabelle 1). Es ist jedoch nicht ungewöhnlich, dass ein höherer Anteil der CD8 +-T-Zellen unter den CMC Populationen von gesunden Individuen (Fig. 3C) zu beobachten. Interessanterweise ist eine erweiterte CD4-CD8-(doppelt negativ, DN) Zellpopulation in Bezug auf DN-T-Zellen PBMC Frequenz T kann unter vielen CMC Proben von HIV-negativen Patienten (Tabelle 1) beobachtet werden. Diese Ergebnisse ähneln denen für Vorhautproben 26, obgleich erhalten werden,ugh diese Zellen sind schlecht gekennzeichnet.
Typische T-Zell-phänotypischen Marker sind leicht zu quantifizieren CMCs kann aber von PBMCs unterscheiden, Fig. 4 zeigt die Identifizierung eines CD8 + CD161 + + (MAIT) Bevölkerung, die verschieden in PBMCs aber fast abwesend in CMCs (4A) ist. Expression von Aktivierungsmarkern CD69 und HLA-DR-, Migrations-Marker CCR5 oder Erschöpfung Marker PD-1 auf CD4 + und CD8 +-Populationen (4B) eindeutig identifiziert werden.
Quantifizierung der Konzentration von Zytokinen / Chemokinen in CVL kann parallel mit CMC-Färbung analysiert werden. Dies ermöglicht eine Korrelation zwischen der CVL Zytokinmilieu (pro-inflammatorischen gegenüber immun) und dem Phänotyp der CMC. Diese Daten können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Frequenz der Chemokin-Rezeptor-Expression auf CMC auf der relativen Expression von entweder Plasma oder CVL Chemokine 14 verwandt. Tabelle 2 </ Strong> zeigt die mittlere Konzentration von Zytokin-und Chemokin-Analyten in CVL von gesunden Frauen gesammelt und von Milliplex Zytokin-Bead-Kits getestet.
Fig. 1 ist. Anatomie des weiblichen Reproduktionstrakts. A) Querschnitt der weiblichen Geschlechtsorgane, welche die Beziehung der Vagina auf die externe Muttermund, Gebärmutterhals-Kanal-und Gebärmutterhöhle. B) Front Winkel Blick auf den Muttermund, welche die äußere Muttermund und der vorderen und hinteren Scheidengewölbe Regionen um 12:00 Uhr und 06.00 Uhr auf. Mit Genehmigung von Reusch et al 27 wiedergegeben. Die zervikale Schaber um den Muttermund gedreht CMC zu sammeln, während die Zytobürste wird in den Zervikalkanal eingeführt und gedreht, um zusätzliche CMC sammeln. Cervical vaginalen Spülungen (CVL)werden durch Waschen der Endocervix mit PBS und Sammeln aus dem hinteren Scheidengewölbe gesammelt.
Abbildung 2. Anschnitt-und Qualitätskontrolle von CMC-Proben. A) Bezeichnung des Singuletts von FSC-A gegen FSC-H-Plot zeigt den geringen Anteil an Singuletts in CMC-Proben im Vergleich zu PBMC-Proben, auch nach Filter-basierten CMC Isolation. B) Beispiele für schlechte Qualität und hohe Proben werden mehrere Qualitäts gezeigt Kontrollschritte. Gating der Zeit gegen die Fluoreszenz (oder SSC / FSC) können Durchflussrate Probleme zu identifizieren und verwendet, um Ereignisse, die in Färbung Artefakten führen kann, auszuschließen. Eine Lymphozytenpopulation basierend auf FSC gegen SSC kann oder kann nicht leicht in Abhängigkeit von der Probe identifiziert werden. Aufnahme eines Lebensfähigkeit Farbstoff ist entscheidend, da einige Proben können weniger als 50% lebensfähige Zellen enthalten. Viability (Amin-reaktiven) Farbstoffe färben toten Zellen heller als lebende Zellen, wie Verlust der Membranintegrität auf Zelltod kann der Farbstoff an Amingruppen auf Proteine innerhalb der Zelle zugreifen. Lebensfähige Zellen werden daher durch Gating auf die Lebensfähigkeit Farbstoff-negativen Bevölkerung identifiziert.
3. Identifizierung von T-Zell Untergruppen. A) Die CD3 +-Population unter CMC-Proben ist in der Regel ein kleiner Anteil der Lymphozyten-Gate im Vergleich zu PBMC-Proben. CMC Proben sind auch variabel in der Größe der T-Zellpopulation, wie dargestellt. B) CD4 +, CD8 + und CD4-CD8-T-Zellpopulationen können leicht sowohl CMC und PBMC-Proben identifiziert. CD4: CD8-T-Zell-Verhältnis von Probe zu variieren, um zu CMCs abzutasten, wie gezeigt. Die angegebenen Daten wurden von nicht HIV-infizierten Frauen gesammelt.
Abbildung 4. T-Zell-Phänotypen in CMC-Proben. A) Die Schleimhaut-assoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) CD8 + CD161 + +-Population, die leicht in PBMC-Proben identifiziert ist fast vollständig in CMCs nicht vorhanden. Die CD8 + CD161 + T-Zellen können in beiden Proben identifiziert werden. B) CMC Ausstellungs Ausdruck der phänotypischen Marker einschließlich CD69, HLA-DR, CCR5 und PD-1. Tore wurden basierend auf Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen gezogen. Die angegebenen Daten wurden von nicht HIV-infizierten Frauen gesammelt.
| CMC | PBMCs | |||||
| Bevölkerung | HIV + (n = 34) | HIV-(n = 44) | P-Wert ein | HIV + (n = 28) | HIV-(n = 35) | P-Wert ein |
| Median (IQR) | Median (IQR) | Median (IQR) | Median (IQR) | |||
| % Live-Lymphozyten | 85,65 (60,25-92,63) | 88,70 (74,85-95,38) | 0,1193 | - | - | |
| % CD3 + Lymphozyten im Live-Gate | 5,94 (0,90-16,80) | 1,44 (0,39-8,46) | 0,0303 | 41,15 (17,08-62,10) | 41,90 (20,40-51,30) | 0,4231 |
| p-Wert b | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| % In CD8 + CD3 +-Gate | 43,20 (25,75-66,00) | 25,60 (21,50-33,80) | 0,001 | 30,05 (22,75-38,78) | 14,60 (8,01-24,80) | <0.0001 |
| p-Wert b | 0,0291 | <0 ist.0001 | ||||
| % In CD4 + CD3 +-Gate | 31,10 (20,45-63,10) | 55.30 (50,53-68,18) | 0,0003 | 56,10 (50,10-61,28) | 77.20 (65,90-92,80) | <0.0001 |
| p-Wert b | 0,002 | <0.0001 | ||||
| Verhältnis CD4: CD8 | 0,71 (0,31-2,45) | 2,09 (1,55-3,01) | 0,0003 | 1,92 (1,44-2,39) | 5,34 (2,66-10,77) | <0.0001 |
| p-Wert b | 0,004 | <0.0001 | ||||
| DN% in CD3 +-Gate | 10,40 (6,36-14,30) | 10,70 (6,76-19,10) | 0,4793 | 9,58 (6,65-15,98) | 7,01 (5,26-8,07) | 0,0032 |
p-Wert | 0,8338 | 0,0006 | | ||||
Tabelle 1. Relative Anteile der T-Zelluntergruppen in CMC und PBMCs. CMCsamples von 44 HIV-negativen und 34 HIV-positive Sexarbeiterinnen und PBMC-Proben von 35 HIV-negativen und 28 HIV-Positiven wurden für ihre relative Anteil der lebenden Zellen verglichen, CD3 + T-Zellen und CD4 +, CD8 + und CD8-CD4-DN T-Zell-Untergruppen. Die Daten sind als Median (25. -75 th Quartils, IQR) vorgestellt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurde mittels Mann-Whitney-Test berechnet. p-Werte zeigen das Ergebnis eines Vergleichs zwischen einem HIV-und HIV-oder b CMC und PBMC Daten.
| Analyt | Bedeuten (Std dev.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35,5 (90,6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19,4 |
| ITAC | 2,7 (6,3) | 0,8 |
| Fractalkine | 51,6 (69,5) | 10.6 |
| IFN-a2 | 24,0 (12,0) | 40,6 |
| IFN-g | 3.9 (14.2) | 0,3 | IL-1a | 268,4 (721,3) | 6.4 |
| IL-1b | 46,8 (126,2) | 0,7 |
| IL-1ra | 4967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0,9 (2,6) | 0,6 |
| IL-6 | 14,8 (30,5) | 0,7 |
| IL-7 | 6.3 (10.1) | 0,1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0,3 |
| 4,5 (8,6) | 0,5 | |
| IL-15 | 1.4 (2.7) | 0,7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0,3 |
| IP-10 | 381,4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129,4 (340,4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| MDC | 84,2 (94,6) | 6.9 |
| MIP-1a 20,9 (28,9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28,5 (42,6) | 8.9 |
| sCD40L | 10,8 (19,3) | 9 |
| sIL-2Ra | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF-a | 1,9 (4,1) | 0,1 |
Tabelle 2. Expression von Zytokinen und Chemokinen in CVL. Proben von 51 nicht HIV-infizierten (nicht HESN) Teilnehmer der Sexarbeiterin Kohorte in der Mitte des weiblichen Menstruationszyklus wurden Zytokin / Chemokin-Konzentration mit der Milliplex MAP Menschen Cytokine / Chemokine Wulst untersucht Array-Kit nach Hersteller'S über Nacht Protokoll, doppelt getestet. IFN: Interferon; MCP: Monozyten-chemotaktische Protein; MDC: Makrophagen abgeleiteten Chemokine, s: löslich; TNF: Tumornekrosefaktor; MIP: Makrophagen-Entzündungsprotein; ITAC: Interferon alpha inductible T-Zell-chemoattractant; MIG: Monokin von Gamma-Interferon induziert; IP-10; Interferon inductible Protein. ein Werte unterhalb der Nachweisgrenze wurden einen Wert von der Hälfte der Nachweisgrenze zugewiesen.
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Discussion
Angesichts der großen Wissenslücken in Bezug auf die Immunität im weiblichen Genitaltrakt (FGT), können phänotypische Analyse von CMC eine breite Palette von Einsichten in verschiedene Lymphozyten-Populationen in den Gebärmutterhals zu liefern. Mit Proteomanalyse und Viruslastmessungen in den zervikalen Spülung gekoppelt, kann Immunität zu sexuell übertragbaren Infektionen (STI) s und andere Krankheitserreger in verschiedenen Populationen zerschnitten werden.
Technische Überlegungen - CMC: Die Isolierung und erfolgreiche Färbung von CMC-Proben kann schwierig sein. Optimierung der CMC Sammelprotokoll hat die Wirksamkeit des Sammelns der CVL, gefolgt von der Hals Schaber und dann schließlich die Zytobürste hervorgehoben. Es ist wichtig zu geplanten Probengrößen im Vergleich zu denen für periphere Blut Studien aufgrund der erhöhten Wahrscheinlichkeit einer Probe Ausschluss für eine Vielzahl von Gründen, wie unten diskutiert berechnet erhöhen.
Prüfung der Wunschd-Strom-Panel auf CMC Proben ist vor der Einleitung zu studieren. Es ist wichtig, Zellautofluoreszenz in CMC-Proben zu überwachen, insbesondere in der Monocyten-Schranke. CMC Autofluoreszenz in einigen Kanälen kann im Vergleich zu PBMCs erhöht werden, was Anschnitt-und Signal-zu-Rausch-Verhältnis beeinflussen. Darüber hinaus sollte eine optimale Spannungen für CMC-Proben bestätigt werden, wenn zuvor auf PBMC-Proben bestimmt werden.
Um die Datenintegrität zu bewahren, ist es wichtig, Proben mit Blutkontamination oder STIs Verwechslung auszuschließen. Die Aufnahme eines Zelllebensfähigkeit Farbstoff in der Durchflusszytometrie Panel ist wichtig, um tote Zellen, die nicht spezifisch nehmen fluoreszierende Antikörper auszuschließen. Während die meisten Proben sind sehr tragfähige, ist es nicht ungewöhnlich, dass 10-20% der Zellen durch Lebensfähigkeit Farbstoff ausschließen. Wenn Teilmenge Analyse basierend auf CD4-und CD8-Expression ist geplant, ist es wichtig, mindestens 100 CD3 + Ereignisse mit der Analyse gehen zu erhalten. Proben von verschiedenen Frauen gesammelt, und sogar von der gleichen Frau ein t verschiedenen Zeitpunkten, können sehr unterschiedliche Zellzahlen ergeben 13.
Durchflusszytometrische Analyse der Schleimhaut Lymphozyten ist oft einfacher und erfolgreicher, wenn ein PBMC Kontrollprobe gleichzeitig mit den CMC-Proben getestet werden. In einigen Proben CMC ist die Lymphozyten-Population schwer durch FSC / SSC-Gating zu identifizieren, aber die Aufnahme der PBMC Probe wird eine bessere Vorstellung von dem zu Tor zu geben. Auch in Proben ohne klare Lymphozyten FSC / SSC Bevölkerung kann verschiedene CD3 +-Populationen identifiziert werden. Wenn die Datenerfassung wird durch technische Probleme (Durchflusszytometer Aufnahme Verstopfung, Blasen, etc.) Gating auf Fluoreszenz über die Zeit unterbrochen und es trotzdem erlauben Probenanalyse Datenerhebung Artefakte zu entfernen. Entsprechende Kontrollen wie Fluoreszenz minus eins (FMO) Rohre für Tor Platzierung kann brauchen, um auf peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) durchgeführt, wenn die Anzahl der Zellen erforderlich ist, ist zu wesentlichen um Cytobrush Proben zu verwenden.
NHALT "> Mehrere Studien haben den Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten bei CMC-Proben nachgewiesen. CMC Cytokin-Produktion kann auch durch PMA / Ionomycin, PHA, IFN &ggr; und Anti-CD3-Stimulation. Eine der Haupteinschränkungen der CMC Stimulationen induziert werden Zellzahl, die die Anzahl der Auflagen und Kontrollen, die pro Probe durchgeführt werden kann, reduziert. Es ist auch wichtig, sorgfältig zu überwachen und zusätzliche Schritte, um Zellkultur-Kontamination zu verhindern. Die Genitaltrakt ist kein steriler Ort, und in einigen Fällen zusätzliche Antibiotika müssen Kulturmedien zugegeben, um Bakterienwucherung zu verhindern. Obwohl CMCs mit wenig Verlust der Lebensfähigkeit kryokonserviert werden, ist die Wiedergewinnung etwa 50%, was kryokonservierten Proben schlechte Kandidaten für Stimulationsstudien sofern Zellexpansion soll 10.Technische Überlegungen - CVLs: Sammlung von CVL führt in der Regel begrenzten Stichprobe volUME, verhindert die Analyse einer großen Anzahl von Proteinkonzentrationen durch ELISA wiederholt. Ein alternativer Test ist das Cytokin Perlenanordnung, bezogen auf das Luminex-System oder Durchflusszytometrie Plattform. Multiplex-Kits sind von verschiedenen kommerziellen Quellen, so dass die Quantifizierung von bis zu 30 Analyten in einer extrem kleinen Probenvolumen (oft ~ 25 &mgr; l). Die Optimierung dieser Assays optimale Detektion von Analyten zeigte mit der Inkubation über Nacht Protokoll. Einige Analyten, die im Plasma / Serum-Proben nachweisbar sind, sind nicht nachweisbar in CVL. Insbesondere hat Konzentration an CVL Proben mittels Spinsäulen Nachweis beliebiger Analyten nicht verbessert, was darauf hindeutet, dass es keinen Vorteil für die Probenkonzentration vor der Ausführung des Bead-Assay.
Störfaktoren spezifisch auf die Genitalschleimhaut: Studium der FGT Immunologie müssen darauf achten, zu erkennen und machen so viele Störvariablen wie möglich. Der Menstruationszyklus hwie jetzt nachgewiesen, dass sie Auswirkungen auf periphere Blut Immunität 28, und übt mehr Auswirkungen auf die CMC Phänotyp und Zellzusammensetzung als auch die Proben von CVL 29 gesammelt Proteine wahrscheinlich. Synchronisieren Probensammlung, um Menstruationszyklusphase ist der bevorzugte Weg, um Datenvariabilität zu reduzieren, sei es durch Östrogen / Progesteron-Spiegel oder Tage seit dem ersten Tag der letzten Menstruation gemessen. Die Verwendung der hormonellen Kontrazeption auch die Schleimhautumgebung stark beeinflußt und deren Auswirkung sollte berücksichtigt werden, wenn eine Untersuchung oder Analyse entnommen werden. Veränderung der Vaginalflora was die bakterielle Vaginose (BV) ändert auch die Immun Umwelt und zellulären Phänotypen. BV kann durch Gram-Färbung diagnostiziert werden und eine Nugent-Score können gegründet, um die verwirrende Wirkung der BV zu steuern.
Sexuelle Aktivität hat auch einen großen Einfluss auf Genital Immunologie, da allo-Reaktionen auf Sperma kann schnellen und dramatischen Veränderungen in cel induzierenl Phänotyp und Menschenhandel. Tatsächlich Lajoie et al. haben Unterschiede in der Proteinzusammensetzung zwischen CVL Sexarbeiterin und nicht-Sexarbeiterin Bevölkerung, mit den Veränderungen in den ersten Jahren nach Beginn der auftretenden Sexarbeit beschrieben.
Schließlich werden kulturelle Praktiken wie Spülungen weitere Variante in der Schleimhaut Probenahme einzuführen. Abhängig von der verwendeten Reagens (Bleichmittel, Reinigungsmittel, Limettensaft, etc.), kann die Frequenz Spülungen / Phänotyp der Zellpopulationen zu reduzieren, oder ändern Sie die Autofluoreszenz im Vergleich zu anderen Proben. Idealerweise sollte Spülungen vor der Probenahme Cytobrush unter den Gebern entmutigen.
Zukünftige Anwendungen: Neben der Gewinnung wichtiger Einblick in die Regulation der Schleimhautimmunität während des Menstruations / hormonelle Schwankungen, virale / bakterielle Infektion und vor / nach der Menopause, ist die Analyse der Schleimhautproben besonders relevant für Impfstoff-Studien gegen STIs / Schleimhaut Krankheitserreger. Im Fall von HIV,wobei ein Hauptziel der Impfstoffstudien ist es, eine Schleimhaut-Antikörper oder T-Zellantwort hervorzurufen, wird die Entwicklung von CMC-basierte Assays eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung Korrelate Schutz spielen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
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