Introduction
Yeni HIV enfeksiyonlarının çoğunluğu dünya çapında kadınların 2011 yılında (UNAIDS 1) yeni enfeksiyonların% 47 temsil ile, heteroseksüel iletim yoluyla ortaya çıkar. Kadın genital (FGT), HIV ve diğer cinsel yolla bulaşan patojenler için ana giriş portallarından birini anlamak, enfeksiyonu önlemek için etkili stratejiler bulmak için yolda yüksek önem taşımaktadır. Genital mukoza bağışıklık karşılıkları da açık bir şekilde benzersiz ve periferik kan 2 ölçülen farklıdır. Ancak, FGT de bağışıklık dinamikleri mevcut bilgi en iyi sınırlıdır. Bugüne kadar, mukozal bağışıklık çevre çalışmaları büyük ölçüde enfeksiyonu takiben mukozal dokularda erken olaylar sonraki hastalığın ilerlemesi 3,4 üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğunu açık hale gelmiştir gut-ilişkili lenfoid dokularda (GALT), odaklanmıştır. Genital mukoza numune toplama büyük bir sorun teşkil etmektedir ve lak için en azından kısmen sorumludurFGT ve immünoloji anlayış k. FGT bu yerel örnekler toplamak ve analiz etmek için etkili yöntemler gerektiren olan farklı çevre bağlamında ev sahibi ve patojen arasındaki bağışıklık dinamiğin bulmaca çözme.
FGT iki bölüme ayrılır: fallop tüpleri, endometrium ve endoserviksten ve ektoservikste içeren alt sistem ve vajina içeren üst üreme yolları (Kaushic tarafından gözden vd 5). Bu farklı sitelerde nispi katkısı HIV enfeksiyonuna ne hala belirsiz olduğunu, ancak her iki site HIV girişi 6 katkı verebilecek düşünülmektedir. T hücreleri, makrofajlar (Rodriguez-Garcia et al yorumlanan 2) yaklaşık 10% 'sini, üst ve alt üreme yolları olarak lökositlerin% 40-50 temsil eder. T hücreleri, vajina, rahim ve endometriyumda tespit edilebilir. Makrofajlar, daha güçlü olan localiher ikisi de dokularda tespit edilebilir, ancak, serviks daha endometriyum ve myometrial bağ dokusunda zed. Son olarak, plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ve Langerhans hücreleri de FGT dokularda tespit edilebilir. Fenotip ve bağışıklık nüfus ve HIV enfeksiyonuna karşı duyarlılık oranları hormonal döngülerine göre önemlisi değişebilir, hormonal kontraseptifler, bakteriyel vajinozis veya cinsel faaliyetler 5,7-9 kullanımı.
Çeşitli yöntemler FGT bağışıklık nüfus ve çalışma ortamı için geliştirilmiştir. Servikal biyopsi, servikal cytobrushes ve servikovaginal lavajlar (CVL) 10-12 en sık literatürde genelinde kullanılmaktadır. PBS lavaj ile CVL toplama en kolay metodu olarak ve son derece düşük bir hücre verimle immün modülatör proteinlerin ancak sonuç çalışma sağlar ve bu nedenle FGT 13'ün bağışıklık hücresi popülasyonlarının çalışmak için uygun değildir. CVL örnekleri, diğer taraftan, v olanELISA, sitokin boncuk dizi 14 ya da kütle spektrofotometresi 15,16 gibi yöntemler kullanılarak, çeşitli sitokinler, kemokinler ya da antimikrobiyal faktörlerin ekspresyonunu ölçerek FGT bağışıklık çevre değerlendirmek için yararlı ery. Immün hücre frekansları, fenotipler ve işlevleri karakterizasyonu servikal cytobrush veya servikal biyopsi örnekleme ile servikal mononükleer hücreleri (CMC) toplanması ile elde edilebilir.
Servikal biyopsi örnekleme kanama rahatsızlık ve riskini artırır ve kadının 12 bağışıklık durumuna bağlı olarak prosedürü takip iyileşmek için 2 ila 11 gün sürer invaziv bir yöntemdir. Öte yandan, servikal cytobrushes toplandı, hücre alt verim rağmen FGT bağışık hücreleri toplamak için daha az invaziv ve daha uygun bir yöntemdir. Her iki yöntem de CD45 + lökositlerin aynı verimi ulaşabilir, ancak iki ardışık servikal cytobrushes ihtiva ettiği hücre aynı miktarda elde etmek için gerekli olan in bir biyopsi 13. Bununla birlikte, yine, 14 numune cytobrush akış sitometrisi ile daha da ex vivo feno hücre kabul edilebilir bir sayısı (yaklaşık 5000 CD45 + hücre / cytobrush) sağlamaktadır. Uyarılması ve hücre içi akış sitometrisi veya QPCR HIV spesifik immün tepkilerini 17 ya da hücre Th polarizasyonunu 18 tespit etmek cytobrush türevli CMC kullanılarak gerçekleştirilmiştir edilmiş olarak aynı zamanda, fonksiyonel karakterizasyonu, bu numuneler üzerinde ifa edilebilir. T hücreleri nüfusunun genişleme aynı zamanda CMC lerin 19 ile işlevsel çalışmalar kolaylaştırabilir.
Bu biyopsiler ve cytobrushes FGT belirgin bölümlerini örnek olduğuna dikkat etmek önemlidir. Servikal cytobrushes endoserviksten ve muhtemelen transformasyon bölgesinin epitel türetilen hücrelerin toplanması, serviks örnek ise biyopsileri, ektoservikste 12,13 epiteli ve stroma üstün kısmından türetilmiştir. Cytobrush örnekler bu nedenle yeniden örnekbiyopsiler, bir skuamöz tabakalı epitelyum 5 ile kaplı bir bölge dahil ederken gion, kolumnar epitel tek bir tabaka oluşur. Bunun bir sonucu olarak, servikal biyopsi ve cytobrush tarafından toplanan lökosit popülasyonları doğası farklıdır. Cytobrushes CD14 + monositler / makrofajlar 13 daha yüksek bir oranda bir araya gelmesinden ise Biyopsiler, CD3 + T hücrelerinin daha yüksek bir oran toplamak.
FGT immünolojisini incelenmesi uzun yıllar 20-22 bir ilgi oldu ve biz cytobrush türetilmiş CMC çalışma ile uzmanlık büyük bir birikimi var. Bizim çalışmalar, HIV ile enfekte enfekte ve HIV-seronegatif maruz Nairobi, Kenya (HESN) kadın seks işçileri çalışma çoğunlukla odaklanmak. HIV tercihli olarak FGT HIV tarafından hedeflenebilir aktive edilmiş hücre 23 ve daha düşük sayılar HIV satın karşı korunmasına katkıda bulunabilir, aktive edilmiş T hücrelerinde çoğaltır. Bu hipoteze göre, birkaç Studi doğrultusundaes henüz 24,25 enfekte kalır ve bu hareketsiz fenotip de FGT 14 gözlenen yüksek HIV maruz HESN seks işçileri arasında düşük bağışıklık aktivasyonunu tarif var. Burada, işleme için bir yöntem tarif ve ex vivo akış sitometrisi ile servikal cytobrushes türetilen CMC örneklerde T hücrelerinin aktivasyonunun değerlendirilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik deyimi: Manitoba Üniversitesi'nde ve Nairobi Kenyatta Ulusal Hastane / Üniversitesi'nin hem araştırma etik kurulları bu çalışmayı onayladı ve yazılı bilgilendirilmiş onam tüm katılımcıların elde edilmiştir.
1.. Medya hazırlanması ve CMC Toplama Tüpleri
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (137,93 mM NaCl, 2.67 mM KCI, 8.1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4) hazırlayın. Kısırlık için Otoklav. Bu birkaç ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- Ön kısım 5 ml PBS içine 50 ml şahin tüp (tahsil edilecek numune başına bir) ve 4 º C'de mağaza örnek toplama zamanına kadar.
- Depolama için lavaj toplamak için örnek başına 2-4 cryovials ya da 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin.
- Hücre kültürü ortamı hazırlayın: RPMI 1640 +% 1 penisilin / streptomisin / amfoterisin B (nihai konsantrasyon 100 birim / ml, 100 ug / ml ve 250 ng / ml, respectivFCS yok / FBS'li ely ekledi.
Cytobrush Numune 2. Koleksiyonu
Cytobrush örneklerinin toplanması eğitimli bir MD veya jinekolog tarafından yapılmalıdır non-invaziv bir işlemdir.
- Bir cytobrush ve bir tahta veya plastik kazıyıcı ikisi kullanılarak servikal mononükleer hücreleri (CMC) toplayın. (Şekil 1) sıyırıcıyı taktıktan ve servikal os etrafında dönen tarafından spekulum muayenesi altında katılımcıdan CMC'yi toplayın. , Endoservikal os içine cytobrush yerleştirin 360 ° döndürmek ve derhal 5 ml PBS içeren 50 ml şahin tüp içine cytobrush ve kazıyıcı hem yerleştirin.
- Işleme kadar 4 º C / buz örnekleri tutun. Toplama 2 saat içinde hücre canlılığı, süreç örnekleri korumak için.
- Mümkünse, periferik kan mononükleer hücre CMC analizi için bir karşılaştırma / kontrol olarak hizmet etmek (hücre) izolasyon için yeşil üst heparin vacutainers eşleşen kan örnekleri toplamak.
CMC 3. İzolasyonu
Çift eldiven ile steril bir biyogüvenlik kabini içinde, bir biyogüvenlik düzeyi 2 laboratuarda örnek işleme gerçekleştirin.
- Toplama sırasında, CMC örnekleri kan ile kirlenebilir. Nihai numunede PBMC'nin karıştırıcı dahil önlemek amacıyla çalışmadan görünür kan kirlenme örnekleri hariç. Nedeniyle CMC örneklerden izole edilen lenfositlerin düşük sayıda, küçük kan kontaminasyon kolayca CMC lenfosit bileşeni bunaltabilir.
- Fırçalarından hücreleri ayırmak için 45 saniye boyunca cytobrush ve kazıyıcı hem de içeren Vortex şahin tüpler. Örnekler, bu işlem sırasında köpüklü hale gelebilir; Bu normaldir.
- Kazıyıcı kapalı kalan malzemeyi kazımak ve bir çamaşır suyu çözeltisi içine kazıyıcı atmak için cytobrush kullanın. Fırça / kazıyıcı bağlı kalarak herhangi hücreleri toplamak için, başparmak ve işaret parmağı arasında kazıyıcı sıkmak taze bir eldiven kullanın.Hücreleri ve PBS aynı 50 ml tüp tahsil edilecek izin, fırçayı aşağı kaydırın. Bir çamaşır suyu çözeltisi içine cytobrush atmak ve eldiven atın.
ÖNEMLİ: Her örnek için yeni bir eldiven kullanın. - Yeni bir 50 ml şahin tüp 100 mikron naylon hücre süzgeç yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, numune tüpten PBS-hücre süspansiyonu toplamak ve temiz bir tüp içine süzgeç içinden geçirilerek filtre edilmektedir.
- Orijinal numune tüpüne RPMI 1640 içinde 5 ml. Transfer pipeti kullanarak, RPMI ile örnek tüpün tarafı yıkayın ve yeni bir toplama tüpüne filtreden aktarın. De RPMI ile naylon filtrenin alt yıkayın.
- 514 x g de 10 dakika süre ile numuneler santrifüjleyin. Bu CMC pelet yerinden ayrılmasını önlemek amacıyla, bu aşama sırasında santrifüj fren bırakmak için çok önemlidir.
- Yavaşça pelet rahatsız değil özen, tüpten çıkarın. Pelet boyutu son derece değişken olacaktır; öylesineDiğer durumlarda, topak zor görünür ve son derece şeffaf iken me örnekleri, topak nedeniyle epitel hücreleri çok sayıda varlığı oldukça büyüktür.
- Falcon tüpün yumuşak çalkalama ile pelet yeniden süspanse edin. Örnek yıkamak için 5 ml PBS ekleyin.
- Herhangi bir santrifüj freni ile 514 x g'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj.
- Dikkatlice süpernatant atın ve yukarıdaki gibi pelet yeniden askıya. Hücreleri (bir PBMC dondurulması protokolünü kullanarak) kriyokoruması, uyarma veya fenotiplen akış sitometri ya için hazırız.
4. CMC Yüzey Boyama ve Sitometrisi
- 100 ml bloke etme ul aşama 3.10 gelen pelet yeniden süspanse edin ve 96 oyuklu bir plaka ya da FACS tüpü içine ya aktarın. Bloklama çözeltisi (Fcy reseptörleri bloke etmek için) aşağıdaki tarifi: 1.8 ul fare IgG (nihai konsantrasyon 0.2 mg / ml), 5 ul FBS ve 93,2 ul FACS yıkama (PBS +% 2 FBS).Boyama topak boyutları kadar küçük ise, 96 oyuklu bir plaka içerisinde gerçekleştirilebilir, ama granül rutin olarak büyük ise FACS tüpler içinde gerçekleştirilebilir gerekebilir. Bu, buna göre antikor titre etmek için önemlidir.
- 4 ° C'de buz / 10 dakika boyunca numune bloke
- 96 oyuklu plakalar içinde FACS yıkama (PBS +% 2 FBS), 100 ul, FACS ya da tüpler içinde 500 ul hücreleri yıkayın. Üzerinde düşük fren ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca 600 x g santrifüj (kapalı veya düşük fren ayarı kullanılamaz ise).
- Süpernatantı ve ajitasyon ile hücre pelet yeniden askıya. Canlılığı Leke (Canlı Ölü düzeltilebilir canlılığı boya) ekleyin. Üreticinin talimatlarına uygun olarak canlılığı boya hazırlayın. Her laboratuvar / sitometresiyle kurulumunda kullanılmak üzere titre gerekebilir. 4 ° C'de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe
- (96 oyuklu plaka / FACS borular için) hücreleri PBS içinde 100 ul μl/500 yıkayın. Düşük / yok frenli 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj. Supernatan Kaldırt ve tekrar süspansiyon hücreleri.
- 100 ul'lik bir toplam hacimde, yüzey işaretleyici antikor kokteyli ile hücreleri inkübe edin. ÖNEMLİ: Optimize ve boyanma örnek önce panelde sitometri her akışını titre. 4 ° C'de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe hücreleri
- Adımı 4.5 tekrarlayın. bir FACS tüpü 96 oyuklu bir plaka, transfer hücrelerde boyama ve% 1 paraformaldehid (PFA) içeren FACS yıkama 750 ul'lik nihai bir hacme kadar seyreltin (veya Cytofix 4, 1 'seyreltilmiş). Bir akış Sitometre üzerinde veri toplama devam edin.
5.. Toplama ve Servikal Vajinal Lavajın Hazırlama (CVL)
- Örnekleme cytobrush önce, steril PBS içinde 2 ml endoserviksten yıkama ve posterior forniksten lavaj aspire için bir şırınga kullanın.
- 15 ml şahin tüp içine aspire lavaj örnek toplamak ve işlenmesine kadar 4 º C / buz üzerinde tutmak.
- Hücresel enkaz kaldırmak için 7 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj örnek.
- Co-70 ° C'de 1 ml ya da 500 ul alikotları ve deposuna süpernatan, kısım örnek llect Alikolar ELISA veya CVL proteinlerin boncuk dizisi analizi için çözülmüş, ancak birden donma / çözülme döngüleri önlemek olabilir.
- Eğer arzu edilirse, üreticinin protokolü izlenerek RNA ekspresyonunu ölçmek için daha sonra RNA hücresel enkaz pelletini.
6.. Veri Toplama
- Antikor paneli maçlar tazminat tüpler bir dizi hazırlamak. Spektral örtüşme ayarlamak için tazminat tüpler çalıştırın. Bu sitometresi renkli bir akış örnekleri çalıştırın panelde kullanılan florokrom eşlenik antikorlar için yapılandırılır.
- Lenfosit nüfusu tespit etmek için İleri Dağılım'ı (FSC) ve yan dağılım (SSC) voltaj ayarlamak için ilk PBMC'nin örnek edinin. Lineer ölçekte her bir eksen üzerinde 100 onları tutmaya çalışın. Bir PBMC denetimi Koşu önemli ölçüde daha kolay CMC lenfosit nüfusu bulmak için yapacaktır.
- CMC numuneler için FSC eşik düşük FSC değerlerinde SSC eksenini smear nedeniyle PBMC'nin numunelere göre artmış gerekebilir.
- Almadan önce her tüp vorteks. Toplanan lenfosit kapısı olayların sayısını arttırmak için bütün boruyu edinin. Tıkanmasını önlemek için dikkatli makineyi izleyin.
- Böyle FlowJo gibi bir akım sitometri analizi programına İhracat verileri.
7. Yolluk Stratejisi
- Yüksek İleri yan dağılım (FSC-H) seçin / İleri yan dağılım alanı (FSC-A) tekli nüfusu belirlemek için.
- Edinimi kalitesi kontrol etmek için (örnek olarak FITC) Floresan işaretleyici karşı Saat'i seçin. Akış hızı değişim verilerde eserler taşıyabilirler. Akış hızında farklılık gösteren herhangi bir alan kapsar.
- SSC-A/FSC-A arsa üzerinde lenfosit popülasyonu tespit. Kimlik kolaylaştırmak için bir PBMC'nin kontrolünü kullanın. CMC lenfosit nüfus PBMC kontrolü gibi net olmayabilir unutmayın. </ Li>
- SSC-A/viability üzerinde Kapısı canlı hücreler ölü hücreleri hariç boya. Ölü hücreler non-spesifik eserler tanıtacak olan antikorları dahil edebilirsiniz.
- SSC-A/CD3 üzerinde kapı T hücre popülasyonu tespit etmek. Bu kapıdan, CD4 + ve CD8 + popülasyonlarının belirlenmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multiparametreli akış sitometri önce karakterize dokularda hücre alt fenotipleri ve fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araçtır. CMC örneklerinin analizi, uygun yolluk stratejileri ile lenfosit ve monosit nüfus hem de bilgi verebilir.
Temsili bir CMC yolluk bir strateji, bir eşleştirilmiş PBMC profili ile karşılaştırıldığında, Şekil 2 'de gösterilmiştir. FSC-H grafiği FSC-A daha sonra filtrasyon, PBMC ile karşılaştırıldığında CMC örneklerde oldukça yaygın olan hücre çifti, hariç sağlar (Şekil 2A). Kalite kontrol, numune kümeleri için akış hızı ya da eserler değişiklikler kolayca (Şekil 2B) tespit edilebilir zamanında, üzerinde yolluk akışı sorunları kaldırılmasını içerir. Lenfosit / monosit popülasyonlarının tanımlanması PBMC ve CMC örneği (Şekil 2B) hem de göreceli olarak benzer. Canlılığı boya ile ölü hücrelerin Dışlama dahil önlerspesifik olmayan bir floresan antikor konjugatları almış apoptotik hücreler. Canlılık, PBMC ile karşılaştırıldığında CMC örneklerde daha düşüktür ve (Şekil 2B) numuneden numuneye oldukça değişken olabilir.
Bu analiz, T lenfosit bir popülasyonun fenotiplendirilmesi odaklanacaktır, fakat CMC örnekleri de monositleri içerir. Monosit nüfusu üzerinde geçiş sağlandıktan sonra, hücreler bir canlılığı boya ve bir döküm kanalı (Şekil 3A) göre kapılı. Döküm kanalı CD56, CD3 ve CD19'a karşı antikorlar içerir ve döküm kanal-negatif hücreleri üzerinde kapılama monosit popülasyonunda bir lenfosit kontaminasyonu ortadan kaldırır. Hücreler daha sonra, CD16 ve CD11c gibi belirteçlerin ekspresyonuna göre tespit edilebilir. CD3 + lenfosit popülasyonu tipik haliyle PBMC (Şekil 3B'de, Tablo 1) ile karşılaştırıldığında CMC arasında orantılı olarak azalır. Epitel hücreleri, granülositler ve CMC numunelerde bulunan olmayan CD3 + CD45 + Lökositlerin yüksek oranda dT hücre popülasyonu üzerinde ominates. CD4 + T hücreleri (ortalama:% 55.30, DAG: 50.53% -68,18%) ve CD8 + T hücreleri (ortalama:% 25.60, DAG: 21.50% -33,80%) daha düşük bir oranda bulunurlar (CMC arasında 2:1 yakın) Kenya (Şekil 3C, Tablo 1) de ticari seks işçisi kohorttan sağlıklı PBMC örneklerinde arasında gözlenen 5:1 oranında göre. Kan olduğu gibi, HIV enfeksiyonu CD4 + azaltılması, CMC arasında CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin oranını etkiler: 0.7 CD8 + oranı (medyan: 0.7, DAG: 0,31-2,45) (Şekil 3C, Tablo 1). Bununla birlikte, sağlıklı bireylerde (Şekil 3C) arasındaki CMC popülasyonlar arasında CD8 + T hücrelerinin daha yüksek bir oranda gözlemlemek için nadir değildir. İlginç bir şekilde, genişletilmiş bir CD4-CD8-(negatif çift, DN) PBMC DN T hücresi frekansı T hücre popülasyonu nispi HIV-negatif kişilerin (Tablo 1) birçok CMC örnekleri arasında gözlemlenebilir. Bu sonuçlar sünnet derisi numuneleri 26, and için elde edilenlere benzerdiröf bu hücrelerin zayıf bir şekilde karakterize edilir.
Tipik T hücresi fenotipik işaretleyiciler kolayca CMC lerin arasında sayılabilir, ancak PBMC farklı olabilir; Şekil 4, PBMC içinde ayrı fakat (Şekil 4A) CMC lerin hemen hemen mevcut değildir, bir CD8 + CD161 + + (MAIT) nüfus tanımlanmasını gösterir. Aktivasyonu CD69 ve HLA DR, göç işaretleyici CCR5 ya da tükenme işareti PD-1 açık bir şekilde CD4 + ya da CD8 + popülasyonları (Şekil 4B) üzerine tespit edilebilir sentezlenmesi.
CVL olarak sitokinler / kemokinler konsantrasyonunun miktarının CMC boyanması paralel olarak analiz edilebilir. Bu CVL sitokin ortamın (immüno karşı pro-enflamatuar) ve CMC fenotip arasındaki korelasyon sağlar. Bu veriler aynı zamanda CMC lerin on kemokin reseptör ifadesinin frekans plazma veya CVL kemokin 14 ya da göreli ifadesi ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Tablo 2 <> / Strong CVL sağlıklı kadın toplandı ve sitokin Milliplex boncuk dizi setleri ile deneye tabi sitokin ve kemokin analitlerin ortalama konsantrasyonunu gösterir.
Dişi üreme yolunun Şekil 1.. Anatomy. Dış os gösteren, dış servikal os, servikal kanal ve uterin kavite serviks. B) Ön görüş açısı için vajinanın ilişkisini gösteren kadın üreme sistemi, ve anterior ve posterior forniksin A) kesitsel görünümü 12:00 ve 06:00 da bölgeler, sırasıyla. Reusch ark 27 izniyle yayınlanmıştır. Cytobrush servikal kanalın içine sokulur ve ek CMC toplamak için döndürüldüğünde ise servikal kazıyıcı, CMC toplamak için servikal os çevresinde döndürülür. Servikal vajinal lavaj (CVL)PBS ile endoserviksten yıkama ve arka forniksten toplayarak tarafından toplanır.
2.. Ayırıcı ve CMC numunelerin kalite kontrolü Şekil. A)-H FSC grafiği FSC-A tekliler tanımlanması, yüksek ve düşük kaliteli örneklerinin filtre tabanlı CMC izolasyonu. B) Örnekler çeşitli kalite için gösterilmiştir sonra bile, PBMC örnekleri ile karşılaştırıldığında CMC örneklerinde gömleğin birbirine geçtiği düşük oranda gösteren kontrol adımlar. Zaman karşı floresan (veya SSC / FSC) arasında yolluk debisi sorunları belirleyebilir ve boyama eserler neden olabilir olayları dışlamak için kullanılır. SSC karşı FSC göre bir lenfosit popülasyonu veya kolayca örnek olarak tespit edilebilir veya edilmeyebilir. Canlılık boya dahil edilmesi, bazı örnekler daha az% 50 kalıcı bir hücre içerebilir gibi, önemlidir. ViabiliHücre ölümü üzerine membran bütünlüğü kaybı boya hücre içinde protein üzerinde amin gruplarına erişim sağlar olarak lik (amin-reaktif) boyalar daha parlak canlı hücrelere göre ölü hücreleri boyamak. Canlı hücreler, bu nedenle canlılığı boya-negatif popülasyonu üzerinde yolluk ile tanımlanır.
T hücre alt Şekil 3.. Belirlenmesi. A) CMC örnekleri arasında CD3 + nüfusu PBMC numuneleri ile karşılaştırıldığında, genel olarak lemfosit kapının daha küçük bir oranıdır. Gösterildiği gibi CMC örnekleri, T hücre popülasyonunun büyüklüğü de daha değişken bulunmaktadır. B) CD4 +, CD8 + ve CD4-CD8-T hücre popülasyonları kolayca CMC ve PBMC örneklerinde hem de tanımlanır. CD4: CD8 T hücre oranı gösterildiği gibi, CMC arasında bir numuneden diğerine değişebilir. Gösterilen veriler, HIV bulaşmamış kadın toplanmıştır.
CMC örneklerde Şekil 4,. T hücresi fenotipleri. A) mukozal kolayca PBMC örneklerinde tanımlanır (MAIT) CD8 + CD161 + + nüfus CMC lerin neredeyse tamamen yok olduğunu değişmeyen T hücrelerini ilişkilidir. CD8 + T hücreleri, CD161 + Her iki örnekte de tespit edilebilir. CD69, HLA-DR, CCR5 ve PD-1 de dahil olmak üzere fenotipik belirteçlerin B) CMCs sergi ifade. Gates, floresan eksi bir (FMO) denetimleri dayalı çizildi. Gösterilen veriler, HIV bulaşmamış kadın toplanmıştır.
| CMCs | PBMC'leri | |||||
| Nüfus | HIV + (n = 34) | HIV (n = 44) | P değeri | HIV + (n = 28) | HIV-(n = 35) | P değeri |
| medyan (DAG) | medyan (DAG) | medyan (DAG) | medyan (DAG) | |||
| % Canlı lenfositler | 85,65 (60.25-92.63) | 88,70 (74.85-95.38) | 0,1193 | - | - | |
| Canlı lenfosit kapısı% CD3 + | 5.94 (0,90-16,80) | 1.44 (0,39-8,46) | 0.0303 | 41,15 (17,08-62,10) | 41,90 (20.40-51.30) | 0,4231 |
| p değeri b | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| CD3 + kapı içinde% CD8 + | 43,20 (25.75-66.00) | 25,60 (21.50-33.80) | 0.001 | 30,05 (22.75-38.78) | 14.60 (8,01-24,80) | <0.0001 |
| p değeri b | 0.0291 | <0.0001 | ||||
| CD3 + kapı içinde% CD4 + | 31,10 (20.45-63.10) | 55,30 (50.53-68.18) | 0.0003 | 56,10 (50.10-61.28) | 77,20 (65.90-92.80) | <0.0001 |
| p değeri b | 0.002 | <0.0001 | ||||
| Oranı CD4: CD8 | 0.71 (0,31-2,45) | 2.09 (1,55-3,01) | 0.0003 | 1.92 (1,44-2,39) | 5.34 (2,66-10,77) | <0.0001 |
| p değeri b | 0.004 | <0.0001 | ||||
| CD3 + kapı içinde% DN | 10.40 (6,36-14,30) | 10.70 (6,76-19,10) | 0,4793 | 9.58 (6,65-15,98) | 7.01 (5,26-8,07) | 0.0032 |
p değeri | 0,8338 | 0.0006 | | ||||
Tablo 1. CMC lerin ve PBMC içinde T hücre alt göreceli oranları. 44. HIV-negatif ve 34 HIV pozitif dişi seks işçileri ve PBMC örnekleri 35 HIV-negatif ve 28 HIV-pozitif canlı hücre göreceli oranı için karşılaştırılmıştır ikinci CMCsamples, CD3 + T hücreleri ve CD4 +, CD8 + ve CD8-CD4-DN T hücre alt grupları. Veri ortanca (25 inci -75 dörttebirlikler arası, DAG'den inci) olarak sunulmaktadır. Gruplar arasındaki farklar Mann-Whitney testi ile hesaplanmıştır. p değerleri, HIV + ve HIV-ya da CMC ve PBMC b veriler arasında bir karşılaştırmanın sonucunu göstermektedir.
| Analit | Bir (Std dev.) Ortalama | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35.5 (90.6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Fraktalkin | 51.6 (69.5) | 10.6 |
| IFN-a2 | 24.0 (12.0) | 40.6 |
| IFN-g | 3.9 (14.2) | 0.3 | IL-1a | 268.4 (721.3) | 6.4 |
| IL-1b | 46,8 (126,2) | 0.7 |
| IL-1 ra | 4.967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0.9 (2.6) | 0.6 |
| IL-6 | 14.8 (30.5) | 0.7 |
| IL-7 | 6.3 (10.1) | 0.1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| IL-15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| IP-10 | 381.4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129.4 (340.4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| MDC | 84.2 (94.6) | 6.9 |
| MIP-1a 20.9 (28.9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28.5 (42.6) | 8.9 |
| sCD40L | 10.8 (19.3) | 9 |
| sIL-2Ra | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF-a | 1.9 (4.1) | 0.1 |
CVL sitokinlerin ve kemokinlerin Tablo 2.. Ifadesi. Orta adet döngüsünde kadın cinsiyet işçi kohort 51 HIV ile enfekte (non-HESN) katılımcılardan alınan numuneler Milliplex MAP insan sitokin / kemokin, boncuk kullanılarak, sitokin / kemokin konsantrasyonu için analiz edilmiştir Dizi kit üreticiye göreKopya halinde test 'ın bir gecede protokol. IFN: interferon; MCP: monosit kemotaktik proteini; MDC: makrofaj kemo, s: çözünür; TNF: tümör nekroz faktörü; MIP: makrofaj enflamatuar protein; ITAC: interferon indüklenebilen T hücresi alfa kemo-çekici; MIG: gamma interferon tarafından uyarılan monokinleri; IP-10; interferon indüklenebilen protein. bir değerler saptama sınırının altında saptama sınırının yarısının bir değeri atanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kadın genital sistem (FGT) de dokunulmazlık ile ilgili bilgide büyük boşluklar göz önüne alındığında, CMC fenotipik analizi serviks birden fazla lenfosit nüfus içine anlayışlar geniş bir dizi sağlayabilir. Proteomik analizi ve servikal lavajında viral yük ölçümleri ile birleştiğinde, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar (CYBE) ler ve diğer patojenler için bağışıklık çeşitli toplumlarda disseke edilebilir.
Teknik hususlar - CMCs: izolasyon ve CMC numunelerin boyama zor olabilir. CMC toplama protokolü optimizasyonu son olarak da rahim ağzı kazıyıcı ardından ilk CVL toplama etkinliği ve cytobrush vurgulamıştır. Bu, aşağıda tartışılan çeşitli nedenlerle için örnek dışlanma ihtimalinin artması nedeniyle periferal kan çalışmaları için hesaplanan kıyasla planlanan numune boyutlarını arttırmak için önemlidir.
Arzu TestCMC numuneler d akış paneli çalışmanın başlamasından önce kritik. Özellikle monosit kapısı, CMC numuneler içinde hücre otoflüoresanı izlenmesi önemlidir. CMC, bazı kanallarda otofloresan yolluk ve sinyal-gürültü oranı etkileyebilen, PBMC ile karşılaştırıldığında yükseltilebilir. Daha önce PBMC örneklerinde belirlenen Dahası, optimum gerilimler CMC örnekler için teyit edilmelidir.
Veri bütünlüğünü korumak için, kan kontaminasyon ya da cinsel yolla bulaşan enfeksiyonların karıştırıcı ile örnekleri dışlamak için önemlidir. Panelinden sitometri akışında bir hücre canlılığı boya dahil olmayan spesifik floresan antikorlar sürebilir ölü hücreleri hariç önemlidir. En çok uygun olan örnekler birlikte, canlılığı boyası ile hücrelerin% 10-20 dışlamak için nadir değildir. CD4 ve CD8 ifade göre alt küme analizi planlanmıştır, bu analiz ile devam etmek için, en az 100 CD3 + olayları elde etmek için önemlidir. Farklı kadınların toplanan örnekler ve hatta aynı kadın a dan farklı zaman noktaları t, çok farklı hücre sayıları 13 verebilir.
Bir PBMC kontrol numunesi CMC örnekleri ile aynı anda çalıştırmak olabilir eğer mukozal lenfosit akım sitometri analizi genellikle daha kolay ve daha başarılı olur. Bazı CMC örneklerinde lenfosit nüfus FSC / SSC geçit tarafından tespit etmek zordur, ancak PBMC numunenin dahil nerede kapısı için daha iyi bir fikir verecektir. Daha açık bir lenfosit FSC / SSC nüfus olmayan örnekleri, ayrı CD3 + popülasyonları tespit edilebilir. Veri toplama zamanla floresan üzerinde yolluk teknik konularda (emme tıkanma sitometrede, vb, kabarcıklar) tarafından kesilirse yine numune analizi sağlarken veri toplama eserler kaldırabilirsiniz. Bu tür kapı yerleştirme için floresans eksi bir (FMO) borular gibi uygun kontrol gereken hücre sayısı cytobrush örnekleri kullanmak için çok önemli olduğu zaman periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) üzerinde gerçekleştirilebilir gerekebilir.
"ontent> Çoklu çalışmalar CMC örnekleri arasında, antijen-spesifik T hücre yanıtlarının saptanmasını göstermiştir. CMC sitokin üretimi ayrıca, PMA / lonomisin, PHA, IFNy ve anti-CD3 CMC uyarılarının en büyük sınırlamalar uyarılması. biri tarafından indüklenebilir koşulları ve örnek başına yapılabilir kontrollerin sayısını azaltır hücre sayısı. dikkatle izlemek ve hücre kültürü bulaşmayı önlemek için ekstra adımlar atması için de çok önemlidir. genital sistem steril bir site değil ve bazı durumlarda ekstra antibiyotikler aşırı bakteriyel büyümeyi önlemek için kültür ortamına ilave edilmelidir. CMCs canlılığının az kayıp ile dondurularak edilebilir olsa da, geri kazanım hücre genişleme 10 planlanan sürece uyarım çalışmaları için dondurularak saklanan örnekler kötü adaylar yaparak, yaklaşık 50% 'dir.Teknik hususlar - CVLS: CVL Koleksiyonu genellikle sınırlı bir örnek vol sonuçlarıume, tekrarlanan protein konsantrasyonları ELISA ile büyük bir sayısının analizini önlemek. Alternatif bir deney, Luminex platform ya da Flow Cytometry platformuna dayalı sitokin boncuk dizidir. Çoklanmış kitleri son derece küçük bir numune hacmi (çoğunlukla ~ 25 ul) içinde, 30 analitlerin ölçümü sağlayan, çeşitli ticari kaynaklardan temin edilebilir. Bu tahlillerin optimizasyonu gece boyunca inkübasyon protokol kullanılarak analitlerin uygun algılama ortaya çıkarmıştır. Plazma / serum örneklerinde belirlenebili bazı Analitler CVL olarak algılanabilir değildir. Özellikle, spin sütunları kullanarak CVL örneklerin konsantrasyonu örnek konsantrasyonu hiçbir yararı önce boncuk dizisi tahlil çalışan olduğunu düşündüren, herhangi analitlerinin algılama düzelmedi.
Genital mukozanın özel karıştırıcılar: FGT immünoloji Çalışmalar kabul özen ve mümkün olduğunca çok sayıda karıştırıcı değişkenler hesaba katmalısınız. Adet döngüsü hşimdi periferik kan bağışıklığı 28 etkisi gösterilmiş ve büyük olasılıkla daha büyük CMC fenotip ve hücre kompozisyon üzerindeki etkileri yanı sıra CVL örneklerinden 29 toplanan proteinleri uygular olmuştur. Adet döngüsü aşamasına örnek koleksiyonu senkronize son regl ilk günden beri östrojen / progesteron düzeyleri veya gün ile ölçülen olsun, veri değişkenliği azaltmak için tercih edilen yoldur. Hormonal doğum kullanımı da büyük ölçüde mukozal ortam etkiler ve bir çalışma tasarımı ya da analiz sırasında etkisi dikkate alınmalıdır. Bakteriyel vajinozis (BV) ile sonuçlanan vajinal floranın değiştirilmesi de bağışıklık çevre ve hücresel fenotipleri değiştirir. BV Gram boyama ile teşhis edilebilir ve bir Nugent skoru BV karıştırıcı etkisini kontrol etmek için kurulmuş olabilir.
Meni allo-cel tepkiler hızlı ve dramatik değişikliklere neden olabilir çünkü cinsel aktivite de, genital immünoloji üzerinde derin bir etkisi vardırl fenotip ve ticareti. Gerçekten de, Lajoie et al. seks çalışma başladıktan sonra ilk birkaç yıl içinde meydana gelen değişiklikler ile seks işçisi olmayan seks işçisi popülasyonlar arasındaki CVL protein bileşiminin farklılıkları tarif var.
Son olarak, douching gibi kültürel uygulamalar mukozal örnekleme içine başka varyasyonu tanıtacak. (Ağartma, deterjan, limon suyu, vb), kullanılan reaktife bağlı olarak, douching hücre popülasyonlarının frekansı / fenotip azaltabilir veya başka numuneler ile karşılaştırıldığında otoflüoresanı değiştirebilir. İdeal olarak, örnekleme cytobrush öncesinde douching bağışçılar arasında cesareti olmalıdır.
Gelecek uygulamalar: Hormonal / adet değişkenliği, viral / bakteriyel enfeksiyon ve / menopoz sonrası önce, mukozal örneklerin analizi CYBE / mukozal patojenlere karşı aşı çalışmaları için özellikle önemlidir sırasında mukozal bağışıklığın düzenlenmesinde içine önemli fikir veren ek olarak. HIV durumunda,aşı çalışmalarında önemli bir hedefi, mukoza antikor veya T hücresi tepkisi ortaya çıkarmak için olduğu yerde, CMC-esaslı testlerin gelişimi koruma etkenleri belirlemede önemli bir rol oynayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
