Summary
Здесь мы приводим протокол для распространения Homalodisca vitripennis клетки и HoCV-1 в пробирке. Среду удаляли из HoCV-1 положительных культур и РНК, выделенная каждые 24 ч для 168 часов. Сотовый живучесть количественно путем окрашивания трипановым синим. Целые вирусные частицы были извлечены после инфицирования. Извлеченные РНК оценивали количественно путем Qrt-PCR.
Abstract
Стекловидный крыльями снайпер (Homalodisca vitripennis) является весьма vagile и многоядны насекомое найти по всему юго-западе США. Эти насекомые являются преобладающими векторы Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), ксилемы ограниченной бактерия, которая является возбудителем болезни Пирса (PD) виноградной лозы. Болезнь Пирса является экономический ущерб; Таким образом, H. vitripennis стали мишенью для стратегии управления патоген. Dicistrovirus определены как Homalodisca coagulata вируса-01 (HoCV-01) была связана с повышенной смертностью в H. vitripennis населения. Потому что клетка-хозяин требуется для HoCV-01 репликации, культура клеток обеспечивает единую среду для целевого репликации, которая логистически и экономически ценным для производства биопестицидов. В этом исследовании, системы для широкомасштабного распространения H. vitripennis клетки через культуре ткани была разработана, рредоставление вирусную механизм репликации. HoCV-01 был извлечен из целых насекомых тела и использовали для инокуляции культурный H. vitripennis клетки при различных условиях. Культуральную среду удаляли каждые 24 ч в течение 168 часов, РНК экстрагировали и анализировали с Qrt-PCR. Клетки окрашивали трипановым синим и подсчитывали количественно клеток живучесть с использованием световой микроскопии. Целые вирусные частицы были извлечены до 96 часов после заражения, которое было время точка определена как до возникновения полный крах культуры клеток. Клетки также подвергаются флуоресцентной окраски и просматривать с помощью конфокальной микроскопии для исследования вирусной активности на F-актин привязанности и ядер целостности. Вывод этого исследования является то, что H. vitripennis клетки способны культивируются и используются для массового производства HoCV-01 на подходящем уровне, чтобы позволить производство биопестицида.
Introduction
Стекловидный крыльями снайпер (Homalodisca vitripennis Germar 1821) была определена в качестве основного вектора Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), возбудителя болезни Пирса виноградной лозы (PD) в Северной Америке 1. Насекомое населения управления быстро стал основным направлением научных исследований в целях борьбы с этой страшной проблемы в виноградарско промышленности в Калифорнии и по всей южной части Соединенных Штатов. Положительным смысле, одноцепочечной РНК вируса, принадлежащий к семейству Dicistroviridae, Homalodisca вирус-01 coagulata (HoCV-01) был определен в дикой H. населения vitripennis и показано, что увеличение смертности в тех популяциях 2-4, в то время как понижение сопротивляемости насекомого к инсектицидам.
Разработка методов для эффективного заднего инфицированных H. vitripennis к взрослой жизни в лабораторных условиях было трудно, потому что
Общая цель из следующих процедур является создание высокой концентрации HoCV-01, пригодного для использования в качестве агента биологической борьбы. Вирусной репликации требуется живую клетку, поэтому успешно культивируя и оптимизации H. vitripennis культуры является жизненно важным для прогресса производства выгодные уровни вируса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Культура клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Homalodisca vitripennis клеточные линии, установленные в лаборатории д-р Уэйн Хантер в Службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США (. Ft Pierce, FL США) были использованы для организации лаборатории запас, состоящий из этапов смешанных клеток, включая начальных фибробластов и монослоев.
- Выполните следующие процедуры в стерильной окружающей среде лаборатории, поддерживаемой при температуре в диапазоне 20-24 ° С с 25 см 2 колбы с культурой.
- Развивайте и поддерживать культуру в 25 см 2 колбах для культуры ткани с помощью H2G + цикадкой среды, изменение WH2 пчелы СМИ 10 (Таблица 1).
- Выдержите культуры колбы при 24 ° С с ~ 53% влажности.
- Используйте инвертированного микроскопа в общее увеличение (TM) из 100X контролировать рост культуры, например, проверить наличие аномального клеточного роста, следить за любых потенциальных загрязняющих веществ, и проверить ход роста по культура поверхности.
- Выполните полное среднее изменение (~ 4 мл культуральной среды в колбе) каждые 7 - 10 дней, не нарушая поверхность культуры.
- Pass культур, когда поверхность культуры составляет примерно 80% покрыта роста клеток (сливной) с использованием 0,25% трипсина, содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) для диссоциации клеток. Добавить ~ 2 - 3 мл трипсина каждому колбу культуры и подвергать культуру (ей) фермента в течение коротких периодов времени (5 - 10 мин) для достижения полной диссоциации клеток.
- Добавить равное количество свежей среды в колбу культуры (ы) (~ 2 - 3 мл), чтобы остановить ферментативную активность, и передавать весь раствор в коническую пробирку для центрифугирования.
- Гранул клетки центрифугированием при 4 ° С в течение 6 мин при 350 х г в.
- Удалить супернатант, не нарушая клеточный осадок и добавить ~ 8 мл свежей среды в каждую пробирку. Аккуратно гомогенизации клеток с помощью пипетки.
- Сплит культуры на 1: 2 Коэффициент для 25 см 2 колбы (~ 4 мл клеточной Solutiна за колбу) и оставить только что прошли культуры в покое на 48 часа, чтобы позволить клеток в суспензии надежно прикрепить к поверхности колбы.
Примечание: Культивирование клеток в 48-луночных стерильных тканей культуральных планшетах с поверхности роста 1 см 2 также возможно, и они могут быть сохранены в том же образом, как и культуральных колбах со снижением объема культуральной среды до ~ 250 мкл.
2 Всего Вирус Добыча
- Перемешать все тело вируса положительного H. не vitripennis в фосфатный буфер, рН ~ 7,2, с 0,02% диэтилдитиокарбамат натрия тригидрата (DETCA) встряхиванием в течение ~ 10-секундными интервалами, пока нет более большие скопления ткани настоящему. Экстракт вирус через Superspeed центрифугированием при 124500 х г в течение 4 ч при 4 ° С или 22 000 мкг в течение 16 ч при 4 ° С. Если образуется осадок в верхней части, удалить его с помощью стерильного тампона хлопка 11.
- Удалите супернатант.
- Соберите осадок ирастворить с 5 мл 10 мМ фосфатного буфера (без DETCA), рН ~ 7,2, содержащий 0,4% Na-дезоксихолевой кислоты и 4% полиэтиленгликоль гексадецил эфир (Brij 52).
- Для смешивания гранул и, удалить осадок со стороны трубки и не давить до тех пор в растворе, если это необходимо.
- Добавить еще 10 мМ фосфатного буфера в ~ 5 мл шагом, чтобы помочь осадок переходит в раствор и при необходимости объединить в 2 трубок 11.
- Центрифуга решение в 300 мкг в течение 15 мин 11.
- Удалить супернатант и пройти раствора через 0,45 мкм фильтр, и собрать фильтрат в большой пробирку 11.
- Передача фильтрат в диализной мембраны с молекулярной массой отрезаны (MWCO) 3,5 кДа, при помощи небольших количеств 10 мМ фосфатного буфера (рН 7) при необходимости 11, не содержащий DETCA.
- Поместите диализной мембраны в большой химический стакан, наполненный DDH 2 O при 4 ° С. Меняйте DDh 2 O каждый час Fили 5 - 6 ч, до белого осадка форм в мембране 11.
- Сбор очищенного вируса в мембрану и подвергать 100% вирусов раствора до 10-кратного серии разведений путем добавления 10 мкл раствора 90 мкл DDH 2 O. Впоследствии не добавить 10 мкл разведения в еще 90 мкл DDH 2 O до достижения разбавление 1: 100 000.
- Магазин вирусный раствор при -80 ° С.
3 вирусной репликации
- Семенной клеток в культуре пластин 48-а и расти все строки до роста клеток не 80% сливной (примерно 72 часов после прохода, если клетки растут со средней скоростью).
- Привить каждую строку клеток с серийным разбавленной вируса раз рост клеток достигает слияния, то есть, один ряд разведении 1:10, одна строка 1: 100 разбавления, и т.д., для верхнего ряда, за исключением. Используйте верхнюю строку в качестве контроля и добавить 10 мкл DDH 2 O друг также регулятором громкости.
- Для того чтобы установить начальный концентрации исходных клеток для сравнения с экспериментальными пунктам клеток, диссоциируют и считать первую лунку каждого ряда до первоначального посева любых скважин в культурах с вирусом.
- Монитор пластин культуры каждые 24 ч после инокуляции вируса для любого изменения цвета в среде с указанием изменения рН и для любых изменений в морфологии клеток.
- Изображение один столбец испытательной пластине в каждый момент времени, с использованием инвертированного микроскопа в 100X TM.
- Удалить все средние из колонки, которая была изображаемого в каждый момент времени 24 ч и хранить его краткосрочные при -20 ° С в течение экстракции РНК и вирусной количественного или долгосрочной перспективе при -80 ° С.
- Диссоциируют клетки из лунок после удаления среды, как описано выше, с шагом 1,6 - 1,9, используя только ~ 250 мкл 0,25% трипсина ЭДТА и свежей средой, чтобы остановить активность ферментов и ~ 250 мкл свежей среды, чтобы повторно приостанавливать клеток Pelleт.
- Добавить 10 мкл 0,4% трипанового синевы в каждую пробирку, содержащую клетки для выполнения количество клеток после клеточной диссоциации для каждого периода 24 ч над одной недели. Разрешить пятно сидеть в течение 10 мин перед выполнением количество клеток.
- Выполните количество клеток в 1 ч экспозиции окрашивать или жизнеспособных клеток начнет поглощать пятно, а также нежизнеспособных клеток.
- Медленно добавляют 10 мкл окрашенного раствора клеток в каждую сторону от стандартной гемоцитометра с помощью микропипетки. Разрешить решение быть принято до под действием капиллярных сил, чтобы избежать воздушных пузырей.
- Подсчитайте количество жизнеспособных (не окрашенных) клеток с обеих сторон гемоцитометре (эквивалент 4 пунктам 16 квадратов в гемоцитометре). Выполните количество клеток для каждой лунки колонны, которая была удалена.
- Среднее значение на основании количества клеток из каждого столбца и использовать следующую формулу, чтобы получить общее количество количество элементов: (среднее количество клеток / 4) фактора х разбавления = количество ячеек х 10
4 Вирус Извлечение из клеточной культуре
- Удалить обработанную H. vitripennis клетки из культуральных колбах, как описано выше в пунктах 1.6 - 1.8, с использованием только ~ 250 мкл 0,25% трипсина ЭДТА и свежей средой, чтобы остановить ферментативную активность.
- Удалите супернатант.
- Выписка вирус из клеток культуры в соответствии с протоколом, описанным ранее в шагах 2,3 - 2,8.
5 Экстракция РНК
- Извлечение РНК из средних проб, взятых во время каждого вируса суда одну неделю с помощью гуанидина добычу тиоцианат-фенол-хлороформ, предназначенный для жидких образцов в протоколе производителя.
- Магазин экстрагируют образцы при -80 ° С.
6-ПЦР
- Создание вирусных стандарты для ОТ-ПЦР, выполнив традиционной ПЦР с использованиемпара праймеров HoCV ОТ-ПЦР праймер 1 (вперед 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', обратный 5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') с вирусом изолировать от всей H. тела vitripennis.
- С учетом ПЦР-продукт гель-электрофорезу в течение 60 мин при 120 В в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия 0,1%.
- Акцизный полос из геля и очищают с использованием набора для экстракции гелей согласно протоколу производителя.
- Бассейн все вырезали и очищали в геле продукт и далее очищают основной осаждения этанолом. Элюции осадков продукт в приблизительно 30 мкл Трис ЭДТА (ТЕ), чтобы повысить общую концентрацию образца.
- Количественной оценки уровня кДНК в объединенных пробах с помощью спектрофотометрии с использованием 260/230 настройки длин волн для обнаружения нуклеиновых кислот.
- Выполните десять раз серийный ряд разбавления очищенного образца в диапазоне от 57 нг / мкл до 57 Ag / мкл (10 -18). Выполнение серийное разведение аналогично описанному Iн 2.8 с корректировками на разницу в требованиях концентрации.
- Определить пределы обнаружения серии разбавления, выполняя Qrt-ПЦР с использованием набора Qrt-ПЦР с надежной количественной оценки низкой численности транскриптов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные концентрации ниже, чем 5 × 10 -3 копий, не могут быть обнаружены. - Извлечение РНК из экспериментальных образцов, как описано выше в шаге 5.1 и количественно с помощью спектрофотометрии.
- Нормализовать все извлеченные образцы до 5 нг / мкл, используя нуклеазную бесплатную воду.
- Выполните Qrt-ПЦР на всех образцах, в двух экземплярах, а 25 мкл реакции с использованием одностадийного Qrt-ПЦР-комплект с возможностью ощутить низкие числа копий следующим образом: 50 ° C удерживайте в течение 10 мин; 95 ° C удержания в течение 5 мин; 30 циклов 95 ° С в течение 10 сек, 60 ° С в течение 30 сек; расплава от 50 - 99 ° С в течение 5 сек на каждом шаге.
- Сделайте основной смеси таким образом, чтобы каждый реакционную смесь содержит 12,5 мкл 1х MASTEг смеси, 1,0 мкл (0,3 мкМ) прямого праймера, 1,0 мкл (0,3 мкмоль) обратного праймера, 0,25 мкл обратной транскриптазы и различным количеством шаблона на основе значений по стандартизации.
- Довести общий объем реакционной смеси до 25 мкл с РНКазы свободной воды.
- Включить пять стандартные концентрации в каждой ПЦР работать со следующими числа копий: 5 х 10 -10, 5 х 10 -8, 5 х 10 -6, 5 х 10 -4, и 5 х 10 -2 копии. Установка порога для каждого запуска, чтобы чуть ниже флуоресценции 10x -2,5, чтобы снизить уровень шума во время раннего приобретения в начале каждого прогона.
7 конфокальной микроскопии
- Рост клеток Homalodisca vitripennis в двенадцать луночного планшета, содержащего покровные стекла измерительных диаметром 18 мм в каждую лунку.
- Посев один столбец на пластине каждые 24 ч в течение четырех дней, раз в монослой достигнута. Убедитесь, что каждый сЗаголовки столбцов содержит контрольный колодец, низкой вирусной разбавления (1:10) ну и высокая вирусная разбавления (1: 100 000) также. Используйте антивирусные решения, полученные с шага 2.8.
- Извлеките все носители на пятый день и мыть клетки дважды 1x PBS (рН 7,4).
- Зафиксировать клетки с холодной 4% параформальдегида при 4 ° С в течение 30 мин.
- Добавить 500 мкл 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) к клеткам и мыть их в течение 10 мин при комнатной температуре на качалке при низкой скорости. Вымойте клетки три раза.
- Добавить 500 мкл 0,1% Triton X-100 в клетки проницаемыми для их. Дайте настояться в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Промывают клетки снова, как описано выше в пункте 7.5.
- Добавить 500 мкл 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) раствор для блокирования клеток при комнатной температуре. Дайте настояться в течение 2 часов, а затем удалить.
- Развести складе родамин красный-сопряженных фаллоидина (RCP) 1: 250 в 1x PBS, содержащий 5% BSA и добавить 250 мкл разведения в каждую лунку, чтобы пятно для F-актина.
- Крышка в алюминиевой Fмасла, чтобы предотвратить краску от отбеливания и инкубируют клетки при 4 ° С CO / N.
- Снимите RCP после 12 ч инкубации и заменить его 250 мкл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (250 мкг / мл) разводят в 1x PBS, содержащим 5% BSA, для окрашивания ядра клеток .
- Инкубируйте клетки, содержащие DAPI при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промывают клетки три раза 1х PBS, как описано выше в пункте 7.5.
- Аккуратно удалите покровные из скважин и установки для Предметные помощью монтажной СМИ с анти-выцветанию реагента.
- Разрешить слайды сушить в светонепроницаемые ящики пока не рассматривается под конфокальной микроскопии. Посмотреть подготовлены слайды как можно скорее, как красители могут быстро исчезать.
- Окрашивали Image ячеек с помощью конфокальной систему, оснащенную микроскопом, содержащей 63X (масло) план-apochromate объектив.
- Установите лазерных длин волн 543 ± 10 нм возбуждения и 575 ± 10 нм излучения для Rhoadmine красно-Сопряженное фаллоидином, И 369 ± 10 возбуждения нм и 450 ± 30 нм выбросов для DAPI.
- Используйте одинаковую прибыль и величину настройки для детектора для получения всех изображений.
- Изображения процесса с использованием соответствующего программного обеспечения для обработки изображений и сортировки и импорт необходимых изображений в управляющей программного обеспечения изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Прикрепление клеток и рост наблюдался в течение 48 часов прохождения в малых и больших колбах культуры, из первичных культур и продолжающихся проходов. Роста фибробластов и развитие наблюдалось также в течение этого времени. Когда недавно посеянные Колбы нарушается до 48 часов, было видно снижение прикрепление клеток, что приводит к медленно растущим культур, а иногда и нет привязанности или роста вообще. Клетки примерно 80% сливной течение одной недели мимоходом и формируется монослой через 10-14 дней (рисунок 1). Первичные культуры, которые были выращены при инициировании данного исследования, выжили 30 + клеток проходы без морфологического ухудшения или общее снижение жизнеспособности клеток.
Прикрепление клеток и рост наблюдался в течение 48 часов прохождения от колб до пластин. Образования монослоя было достигнуто за более короткий период времени, приблизительно 5-6 дней, так как это меньше, поверхности роста. Инфицированные культуры сфотографировалит 100X при световой микроскопии показали признаки снижения целостности формы клеток. В 48 ч после инфекции, что, как представляется, большие отверстия присутствовали на поверхности клеток. Через колбы с культурой, клетки сократилась и отделен от поверхности культуры примерно 72-96 ч после заражения, не разбавляют HoCV-01 (рисунок 2).
Средний живой количество клеток для контроля и экспериментальные образцы рассчитаны и построены, чтобы изобразить различия в обилии живых клеток между вирусной нагрузкой в течение долгого времени (Рисунок 3). Последовательное увеличение живых клеток в контрольной группе присутствует, что указывает на здоровые клетки. Для сравнения, все группы лечения было заметное снижение числа живых клеток, присутствующих в течение долгого времени. Высшие вирусные группы лечения указывают на гораздо более заметное снижение здоровья культуры с крупной каплей в живых клетках между 48-72 ч, в то время как нижние вирусные группы медленно снижаться до прерывают около 144 часов. Двусторонний ANOVA Wiй Бонферрони ретроспективный анализ был использован для тестирования различия в культуре клеток ставок убивать HoCV-01 на основе живых кровяных клеток в каждой группе лечения по сравнению с каждый момент времени в исследовании, а также между группами. Двусторонний дисперсионный анализ оказали значительное главный эффект фактора времени, F (7, 432) = 82,5, р <0,0001, предполагая, что длина временных культур подвергали воздействию лечения пострадавших долголетия культуры. Эффект от типа лечения культуры получили, было значительным, а, F (5, 432) = 170,6, р <0,0001, что свидетельствует, что количество вирусной нагрузки культура изначально получает сказывается на выживаемости культуры. Значительное влияние на взаимодействие между фактором времени и фактора лечения также присутствует, F (35, 432) = 17,63, р <0,0001, подчеркнув, что чем выше вирусная нагрузка получил короткий промежуток времени, необходимый для сокращения культуры фитнеса и наоборот тем ниже вирусная нагрузка,длительный период времени, необходимого для того же эффекта. Bonferroni испытания после специальных иллюстрируют существенное различие между группами лечения и контроля, что указывает на заметный отклик дозы.
Выживание вероятность клеток, зараженных при высоком уровне вирусной лечения была ниже, как проходят проверку Каплана-Мейера кривых (рисунок 4), соотносить с выводами, сделанными из среднее количество живых клеток анализирует. Был выживаемость 100% для контроля или неинфицированных клеток. Клетки подвергаются высоким ной терапии было заметное снижение вероятности выживания в течение долгого времени, в то время как более низкие вирусные процедуры не имеют большую вероятность выживания до 144 ч, затем снижение вероятности выживания присутствует. Модели пропорциональных рисков Кокса анализ не был значительным, лечение коэфф = 0,8812 (95% ДИ [0,76, 1,02]), р> 0,05. В то время как не имеет значения, данные показывают, что клетки подвергаются вируса 88% чаще проявляют более низкие показатели выживаемости в течение долгого времени.
Для каждого запуска Qrt-ПЦР, тем выше вирусные стандарты увеличили раньше, чем нижних вирусных стандартов и экспериментальных образцов. От каждого запуска, повторить значения Ct были проанализированы с использованием двусторонней ANOVA для проверки различий в изобилии HoCV-01 РНК настоящее время в экспериментальных образцов и сравнения значений в нескольких контрольных значений. Двусторонний дисперсионный анализ не показал значительного главный эффект фактора времени, F (7, 289) = 0,38, р> 0,05, или во взаимодействии времени и лечебных групп, F (63, 289) = 0,14, р > 0,05. Значительная основной эффект между группами лечения, F (9, 289) = 135,7, р <0,0001, что свидетельствует количество вируса изначально введенного в культуре клеток влияет на количество вирусной РНК обнаруженного наблюдалось. Bonferroni испытания после специальных проводились и показывают существенные взаимодействия между группами лечения и меры контроля, но без существенных взаимодействий между лечения гroups одна, что указывает на отсутствие должной мере дозы.
Различия в морфологии клеток здоровых и HoCV-01 инфицированных H. vitripennis клетки в 24 и 72 часов были замечены под флуоресценции. Снижение числа ядер, присутствующих, а также деформированы появление F-актина в клетках, подвергшихся воздействию HoCV-01 по сравнению с контрольной группой, показывают, что вирус имеет большое влияние на здоровье культуры. Клетки подвергаются высшего 1:10 вирусной нагрузки показали большую стресс, чем клеток, подвергшихся воздействию нижней лечения вирусных. Контрольные клетки появляются более обильные и иметь нормальную морфологию между двумя точками времени (рисунок 5).
| Насекомое среднего Грейс (дополнено, 1x) | 210 мл |
| 0,06 М L-гистидин раствор моногидрата (рН = 6,5) | 290 мл |
| Средний 199 (10x) | 10 мл |
| Средний 1066 (1x) | 17 мл |
| Сбалансированные Соли Хэнка (1x) | 33 мл |
| L-глютамин (100x) | 1,5 мл |
| МЕМ, смесь аминокислот (50x) | 1,5 мл |
| Решение 1 М MgCl | 6 мл |
| Pen-Strep (ж / глютамин) | 2,5 мл / 500 мл |
| Нистатин | 1,0 мл / 500 мл |
| Гентамицин | 1,5 мл / 500 мл |
| Декстроза | 1,8 г |
| Эмбриональной телячьей сыворотки | 10% от конечного объема |
Таблица 1 Компоненты цикадкой средние H2G +.
Рисунок 1. Изображения H. vitripennis сеРост LL в пробирке захвачен в 100X ТМ. (A) Клетки два дня (48 ч) пост-проход, обладающий привязанность и развитие фибробластов. (BE) Клетки четыре, шесть, восемь и десять дней после прохождения продолжает расти по всей поверхности культуры. Формирование (F) однослойная происходит ~ 10- 14 дней. Шкала баров:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Зараженные H. vitripennis клетки изображение получено на 100X ТМ захватить морфологические изменения. (А) роста фибробластов перед посевом. (B) Клетки 24 часа после инфицирования. (C) Клетки сообщение инфекции 48 час. (D) после инфицирования клетки 96 час естьв основном отдельно от поверхности культуры и среднего стала пасмурная погода. Шкала баров:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Гистограмма показывает средние живые количество клеток для экспериментальных образцов. Среднее число импульсов живые клетки были рассчитаны для экспериментальных образцов на вирусную нагрузку получил за каждый день в течение экспериментального периода и показаны здесь со стандартными баров отклонения. Среднее количество клеток показывают значительное снижение живых клеток ~ 72 ч после заражения с высокой вирусной нагрузкой и значительным снижением в графов живых клеток в ~ 144 ч после инфицирования нижних вирусной нагрузкой. Пожалуйстанажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4 Каплана-Мейера анализ выживаемости из пяти различных HoCV-01 процедур по сравнению с не-инфицированной контроля в H. клеточные культуры vitripennis. Контрольные культуры поддерживается выживаемость 100% по сравнению с группами пяти лечения. Самая низкая вероятность выживания была замечена в высокой группе лечения и все терапевтические группы направляемся к нулевой вероятности выживания на 168 ч при п = 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Figu. Re 5. конфокальной изображений контроля и инфицированных клеток H.vitripennis Homalodisca vitripennis клетки были инфицированы сериала разбавляют HoCV-01 в 1:10 и 1: 100000 концентрациях в 24 час интервалами. Клетки обрабатывали родамин фаллоидином и DAPI пятен визуализировать F-актин и ядрами в культурах. Конфокальные изображения были захвачены в 63x и показать перерыв вниз в морфологии клеток при 72 ч при низких и высоких вирусных разведения. Шкала баров:. 1 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рост беспокойства в отношении притока инвазивных сельскохозяйственных видов привели к увеличению спроса на новых методологий по защите от новых вредителей и патогенов. В центре внимания профилактике заболеваний и управления включает в себя управление патогенных векторов и было основной целью данного исследования. Экономика играть жизненно важную роль в решении производить этот тип биопестицида управлять патогенных векторов в сельском хозяйстве, потому что практическое применение должно быть большое количество на больших площадях, но при низкой стоимости 12. Практика использования культуры клеток для исследований и разработок становится все более распространенным, и как таковой, последствия этого исследования имеют большое значение. Определение экономически обоснованных комплексной борьбы с вредителями (IPM) стратегии является ключом к долгой и успешной сельскохозяйственной продукции во всем мире, и выводы, содержащиеся в этом исследовании способствовать прогрессу в улучшении стратегии IPM и уменьшая появление ПД виноградной лозы.
H. клеточные культуры vitripennis размножали и поддерживается в течение года без видимого морфологического ухудшения. Номера Пассаж может сильно повлиять на результаты исследований в пробирке в клетках млекопитающих, изменяя клеточный метаболизм и характеристики роста 13. Как репликации в клетках виво и ин витро, теломеры сократить с каждого цикла репликации клеток и в конечном счете достигнет критического предела, где теломеры становятся слишком коротким и индуцировать клеточное старение 14. При возникновении тяжелой укорочение теломер, генетическая нестабильность и, наконец, кризис, или массивная гибель клеток происходит 15. Из этого явления, культуры редко выживают за 50 subcultivations или одного года, считается Хейфлика Limit, на основе следующих критериев: сохранение секс хроматина, histotypical дифференциации, неприспособленности приостановить культуру, доброкачественных характеристики в естественных условиях, конечный предел выращивания, Аналогично морфология клеток в первичной ткани, увеличение производства кислоты по сравнению с клеточными линиями, удержание вещества рецепторов Коксаки А9 и легкость, с которой штаммы могут быть разработаны 16. Потенциальные осложнения номера прохода не наблюдалось в течение длительности данного исследования, указывающего, что этот способ распространения клеточной линии способен непрерывного производства в течение продолжительных периодов времени. Потому что использование культуры клеток над живой выращивания насекомых или других дорогих и сложных методов производства быстро становится обычным явлением во многих областях науки, долговечность этого типа клеточной линии имеет множество практических применений. Если поддерживается должным образом, одна линия первичной клетки могут быть использованы для множества циклов продукции вируса.
Два основных факторов успешного долгосрочного поддержания этих клеток были нарушения время для недавно посеянных культур и надлежащего среднего подготовки. Культуры, которые остались нетронутыми в течение первых 48 ч после прохождения показали заметное увеличение роста кросс-колбы по сравнению с теми, что были перемещены в течение этого начального окна. Когда не трогать, быстрое репликации клеток достигается монослоев в качестве лишь десять дней после прохода в колбах для культуры. Средний подготовка столь же важно, во время исследования в качестве времени возмущения, насколько общее состояние здоровья культура была обеспокоена. Даже с антибиотиками, присутствующих в среде, бактериальное загрязнение по-прежнему является важным фактором при подготовке среды. Позволяя аликвот среде оставаться при комнатной температуре в течение нескольких дней перед использованием в культурах, вероятность разрушительного серии культуры разрушается, потому бактериального загрязнения была снижена до почти несуществующего фактора. Антибиотики, такие как гентамицин и стрептомицин, которые обычно используются в клеточной культуральной среде для борьбы с бактериями, находящимися внутри клеток и любого внешнего загрязнения. Оба этих антибиотиков были связаны с депрессией клеточного роста в культурах млекопитающихд к уменьшению использования методов асептики и заботу о увеличивая вероятность развития устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий 17,18. Антибиотики не должны использоваться чрезмерно; Однако их использование необходимо для предотвращения проблемы загрязнения клеточной культуре.
Последствия этих факторов таковы, что увеличение масштаба производства клеток является жизнеспособным вариантом для быстрого массового производства биопестицида материалов с незначительными шагами по обеспечению качества клеточных культурах. Биореакторы появились в 1950-х и 1960-х годов, и с тех пор превратилась обеспечить эффективные средства производства миллиарды клеток в исключительно короткий промежуток времени 19. Многие типы биореакторов существуют, которые могут быть использованы, чтобы значительно увеличить количество H. vitripennis клетки производятся в одно время и процесс развития этого типа производственной системы потребует разработки метода для лечения клеток для предотвращения сдвига сюдаРост м поверхности в биореакторах.
Успешное продолжение роста клеточных линий имеет решающее значение для HoCV-01 репликации и как только достигнут, могут быть использованы для решения вопроса о том, сколько вирус необходима для количественной в пробирке репликации и как долго должны вирус будет разрешено оставаться в культурах. Ясно, корреляция между количеством исходного вирусной нагрузки, полученной клеток и продолжительности вирусных частиц времени было разрешено инкубировать в клетках. Чем выше вирусная нагрузка получили, тем ниже потребность время для гибели клеток, что указывает на быстрое размножение вируса. Тем не менее, во всех процедур количество клеток отказался ниже порогового значения 25 х 10 4 клеток / мл приблизительно 144 ч после заражения, демонстрируя всеобъемлющей культуры клеток живучести порог. Результаты показывают, что большое количество вируса может быть получена быстро, если большие количества вируса легко доступны для первичной инфекции, или, что растет в ценеASED количество вируса может быть получена в течение более длительного периода времени с более низкой начальной дозе. Изменчивость в отношениях между концентрационных и временных факторов позволяет некоторую гибкость в настройках производства для более масштабных исследований с оптимальным вирусной время экстракции 72-96 ч после заражения.
Использование клеточных культур для вирусных исследований зависит от способности обнаруживать целевой вирус и количественной оценки результатов исследования. Надежный способ для этого является использование ПЦР для проверки на наличие вирусных последовательностей РНК в экспериментальных образцов. Анализ значений Ct по данным ПЦР в этом исследовании не дает четкого ответа на то, что оптимальное время добыча вируса будет; Однако, отсутствие окончательного время экстракции не свидетельствует о неспособности повторить HoCV-01 в пробирке, но из деликатности вирусных исследований. Количество клеток с трипановым синим же кредитовать более четкое представление оптимальных раза экстракции, но ни в коем случае не definitivэ ответ. Гибель клеток показывает, что данные высокой вирусной нагрузкой привести к высокой уменьшилось клеток выживаемость после 72 ч, что свидетельствует о вирусной экстракции между 48 ч и 72 ч после инфекции может быть идеальным, чтобы уменьшить разрушение клеточной вирусных частиц, как клетки в культуре начинают умирать экспоненциально. Раз добычи на более низкие начальные вирусной нагрузки не столь однозначны, но с резкому снижению клеточной выживаемости после 144 часов, можно предположить, что оптимальное время экстракции бы 24 - 48 ч до этого момент времени. Определение оптимального вирусного время экстракции является жизненно важным для действенной производства биопестицидов для использования против H. vitripennis инвазии и это исследование сделала важный шаг на пути к определению тех времен.
Микроскопия является ключевым инструментом для анализа культуры клеток и это исследование является первым, чтобы использовать конфокальной микроскопии с H. vitripennis клетки. Изображений белок увеличение вложение или упадок и обилиеЯдра клеток является первым шагом на пути к более детальных исследований в внутриклеточной активности HoCV-01 в пробирке. На протяжении этого исследования, клеточные культуры были сохранены без видимых морфологических ухудшений. После каждого последующего прохода клеток, нормального роста фибробластов наблюдалось, с последующим образованием монослоя. Клетки оставались однородными по форме и размеру. Однако, когда зараженные культуры были обследованы с конфокальной микроскопии, снижение морфология клеток наблюдались, особенно в момент времени 72 ч, с высокой и низкой исходной вирусной нагрузкой. Небольшие отверстия-подобные структуры можно было увидеть на поверхности клеток, возможно, в связи с гибелью клеток и вытесняющие внутриклеточного материала. Клетки по всей поверхности колбы сморщенные и в конце концов стали отделяться от поверхности. Последствия от этого первого использования более высокого разрешения микроскопии коррелируют с результатами, полученными при анализе клеток живучести и порождает другие возможного использования для увеличения вирусных исследований. Расширенный мильмикроскопия методы могут быть использованы для ее максимальной мощности, если был проведен развитие антитела для HoCV-01. Антитела для вируса не только позволит визуализацию межклеточных выработках вирусных частиц, но также может помочь определить ставки распространения и даже более точные экстракции раз.
Процесс расширения производственных методов, разработанных в данном исследовании, для получения эффективного агента биологической борьбы до точки, где большие биомассы клетки собирают на вирус и затем наносят на полях в основном вопросом стоимости. Первоначальные затраты на строительство до больших систем масштаба высока, и многие факторы должны быть рассмотрены, такие как: рентабельность, клетки и производительности вируса, расходы среднего клеточных культур, нормы расхода, масштабов производства и затрат серийного производства 12. Несмотря первоначальной стоимости, потенциальные офф платные стоят инвестиции. Используя методов культивирования клеток, вниз вопросам очистки потока значительно снижается Бевызвать возможность кишки микроба и других вирусов, обнаруженных целого тела насекомого значительно снижается, а также стоимости объектов для живого обслуживания насекомых и воспитания.
С культуре клеток уже используемой для производства белков, биопестициды и других фармацевтических препаратов, экономическая ценность для этой области исследований растет. Для масштабного производства биопестицидов в сельском хозяйстве, было бы полезно, чтобы попытаться аналогичное исследование в одной завершенной здесь, но с использованием более крупной системы роста клеток. Биореакторы и новая методология выращивания систем 3D-матрица клеток позволяют для увеличения объемов производства клеток и, в то же уважения, больших объемов вирусной производства 20. В то время как начальная стоимость создания крупномасштабных систем является высокой, выигрыш в размере продукта, способного производить имеет потенциал, чтобы быть еще больше. Область исследования, что позволит значительно кредитовать дальнейшего исследования передачи в крупномасштабной системы describред выше антитела дизайн. Дизайн антитела все шире используется в вирусных исследований для таких заболеваний, как ВИЧ и гепатит С. В то время как это отнимает много времени и детальный процесс, для HoCV-01, это позволило бы для визуализации вирусной активности в пробирке с конфокальной микроскопии и может привести к другой области исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
- Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
- Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
- Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
- Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
- Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
- Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
- Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
- Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
- Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
- Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
- Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
- Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
- Abbot, A., Cyranoski, D.
