Summary
여기에서 우리는 시험 관내에서 Homalodisca vitripennis 세포와 HoCV-1을 전파하는 프로토콜을 제시한다. 중간 HoCV - 한 긍정적 인 문화에서 제거하고 RNA는 168 시간 동안 매 24 시간을 추출 하였다. 세포 생존은 트리 판 블루 염색에 의해 정량 하였다. 전체 바이러스 입자는 감염 후를 추출 하였다. 추출 된 RNA는 QRT-PCR에 의해 정량 하였다.
Abstract
유리 날개 사격의 명수 (Homalodisca vitripennis)은 미국 남서부에 걸쳐 발견 매우 vagile 및 잡식성 곤충이다. 이 곤충은 Xylella fastidiosa (X를 fastidiosa)의 주된 벡터, 포도 나무의 피어스 병 (PD)의 인과 에이전트 목부 제한 박테리아입니다. 피어스 병은 경제적 피해이고; 따라서 H. vitripennis 병원체 관리 전략의 대상이되고있다. Homalodisca의 coagulata 바이러스-01 (HoCV-01)로 확인 dicistrovirus는 H.의 사망률 증가와 관련이있다 vitripennis 인구. 숙주 세포는 01-HoCV 복제에 필요하기 때문에, 세포 배양 물은 생물 농약과 물류 생산 경제적 가치가 타겟팅 복제 일정한 환경을 제공한다. 이 연구, H. 대규모 전파 시스템 조직 배양을 통해 vitripennis 세포가 개발 한 P바이러스 복제 메커니즘을 roviding. HoCV-01는 몸 전체의 곤충에서 추출하여 배양 된 H. 접종에 사용 된 다양한 수준에서 vitripennis 세포. 배지는 168 시간, RNA 추출 QRT-PCR 분석을위한 매 24 시간을 제거 하였다. 세포는 트리 판 블루로 염색하고 광학 현미경을 이용하여 세포의 생존 성을 정량화하는 계수 하였다. 항목의 바이러스 입자는 전체 세포 배양 붕괴가 발생하기 전에 것으로 결정된 시점이었다 감염 후 96 시간, 최대 추출 하였다. 세포는 형광 염색을 실시하고 F-액틴 및 첨부 핵 무결성에 바이러스 활성을 조사하기 위해 공 초점 현미경을 사용하여 보여졌다. 이 연구의 결론은 있다는 것이다 H. vitripennis 세포 배양 생물 농약의 생산을 허용하기에 적합한 수준으로 HoCV-01의 대량 생산을 위해 사용 가능하다.
Introduction
유리 날개의 명사수 (Homalodisca vitripennis Germar 1821)는 북미 1, Xylella fastidiosa (X를 fastidiosa)의 지배적 인 벡터로 포도 나무 (PD)의 피어스 병의 인과 에이전트를 확인되었습니다. 곤충 인구 관리는 빨리 캘리포니아와 미국 남부에서 포도 재배 산업이 파괴 문제를 해결하기위한 연구의 초점이되었다. 가족에 속하는 양의 감지, 단일 가닥 RNA 바이러스는 Dicistroviridae, Homalodisca는 coagulata 바이러스-01 (HoCV-01) 야생 H.에서 발견되었습니다 vitripennis 인구와 살충제로 곤충의 저항을 낮추고, 그 인구 2-4에서 사망률이 증가하는 것으로.
방법의 개발을 효과적으로 후방 H. 감염합니다 실험실 환경에서 성년 vitripennis 때문에 어려웠을
다음 절차의 전체적인 목적은 생물학적 방제 제로서 이용하기에 적합한 HoCV-0129의 높은 농도를 생성하는 것이다. 바이러스 성 복제는 왜 성공적으로 H. 육성 및 최적화 된 살아있는 세포를 필요로 vitripennis 문화는 바이러스의 수익성 수준을 생산의 발전에 매우 중요합니다.
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Protocol
1 세포 배양
참고 : 미국 농무부 농업 연구 서비스 (. 포트 피어스, FL USA)에서 박사 웨인 헌터 연구소에 의해 설립 Homalodisca vitripennis 세포주 초기 섬유 아세포 및 단일 층을 포함하여 혼합 된 세포 단계로 구성된 실험실 주식을 시작하는 데 사용되었다.
- 이 25cm 배양 플라스크에 20-24 ℃의 온도 범위에서 유지 무균 실험실 환경에서 다음 절차를 수행한다.
- 육성 및 H2G + 매미충 매체, 수정 WH2의 꿀벌 미디어 10 (표 1)를 사용하여 25cm 두 조직 배양 플라스크에 문화를 유지한다.
- 53 %의 습도 ~로 24 ° C에서 배양 플라스크를 품어.
- , 비정상적인 세포 성장을 확인, 예를 들면 문화의 성장을 모니터링 잠재적 인 오염 물질을 모니터링하고 막에 걸쳐 성장 진행 상황을 확인하기 위해 총 배율 100 배의 (TM)에 거꾸로 현미경을 사용하여진짜야면.
- 문화 표면을 방해하지 않고 10 일 - 매 7 완전한 매체 변화 (~ 플라스크 당 4 ㎖의 배양 배지)를 수행합니다.
- 문화 표면 세포를 해리 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함하는 0.25 % 트립신을 사용하여 세포 성장 (합류)에 포함 약 80 % 인 경우에 문화를 전달합니다. 각 배양 플라스크에 3 ㎖ 트립신 및 시간의 짧은 시간 동안 배양 효소 (들)를 노출 - ~ 2 추가 - 완전한 세포 분리를 달성하기 위해 (5-10 분).
- 효소 활동을 중지하고 원심 분리를위한 원뿔 튜브에 전체 솔루션을 전송 - 문화 플라스크 (들) (3 ML ~ 2)에 새로운 배지의 동일한 금액을 추가합니다.
- 350 × g으로 6 분 동안 4 ° C에서 원심 분리하여 펠렛 세포.
- 세포 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 제거하고 각 튜브에 ~ 신선한 매체의 8 ML을 추가합니다. 부드럽게 피펫을 사용하여 세포를 균질화.
- 1에서 분할 문화 : 2 비율 25 센티미터이 플라스크 (~ 셀 soluti의 4 ML플라스크 당에) 떠날 갓 통과 현탁 배양에서 세포가 플라스크의 표면에 확실하게 부착 할 수 있도록하기 위해 48 시간 동안 방해받지.
NOTE : 1cm 2의 성장면과 48 웰 멸균 조직 배양 플레이트에서 세포 배양이 가능하다 그들이 ~ 250 μL에 배지의 부피의 감소와 함께 배양 플라스크와 동일하게 유지 될 수있다.
2 전체 바이러스 추출
- 바이러스 양성 H.의 몸 전체를 균질화 ~ 10 초 간격에 대한 텍싱 0.02 % 나트륨 디 에틸 삼수화물 (DETCA)와 인산염 완충액에서 vitripennis, 산도 ~ 7.2, 아니 현재 조직의 더 큰 덩어리가 없을 때까지. 4 ° C에서 4 시간 또는 4 ° C에서 16 시간 동안 22,000 XG에 대한 124500 XG에서 슈퍼 스피드 원심 분리를 통해 바이러스의 압축을 풉니 다. 상단에 침전물을 형성하는 경우, 멸균 면봉 (11)를 제거합니다.
- 상층 액을 버린다.
- 펠렛을 수집하고0.4 % 나트륨 데 옥시 콜산-4 % 폴리에틸렌 글리콜 데실 에테르 (BRIJ 52)을 함유하는 5 ㎖의 10 mM의 인산 완충액 (전술 DETCA), pH가 7.2 ~ 녹인다.
- 잘 섞어 펠릿, 튜브 측으로부터 펠릿을 제거하고, 필요한 경우 용액까지 분쇄.
- 펠릿이 필요한 경우 솔루션에 가서 2 튜브 (11)에 결합 할 수 있도록 ~ 5 ㎖의 단위로 10 개 mM의 인산 버퍼를 추가합니다.
- 15 분 11 300 XG에 용액을 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 0.45 μm의 필터를 통해 솔루션을 전달하고 대규모 수집 관 (11)의 여과를 수집합니다.
- 분자량 투석막에 전송 여액을 10 ㎜의 11 필요한 경우에는 DETCA을 함유하지 않는 인산염 완충액 (pH 7)를 소량 사용하여, 3.5 가와사끼 (MWCO)를 잘라.
- 4 ° C에서 DDH 2 O로 가득 큰 비커에 투석막을 놓습니다. DDH 2 O마다 시간의 F 변경또는 5-6 시간, 멤브레인 (11)의 흰색 침전물이 형성 될 때까지.
- 막 내에서 정제 된 바이러스를 모아 둘 DDH O. 90 μL로 용액 10 μl를 첨가하여 10 배 희석 계열로 100 % 바이러스 용액을 가하지 100000 : 그 후 1의 희석에 도달 할 때까지 DDH 2 O의 또 다른 90 μL로 희석의 10 μl를 추가합니다.
- -80 ° C에서 보관 바이러스 솔루션입니다.
3 바이러스 성 복제
- 세포 성장이 (세포가 평균 속도로 성장하는 경우 약 72 시간 후 - 패스) 80 %의 합류 때까지 48 웰 배양 플레이트에서 종자 세포는 모든 행을 성장.
- 세포 성장이 포화 상태에 도달하면 희석시킨 바이러스와 세포의 각 행에 접종, 즉, 1:10 희석 한 행, 하나의 하나의 행 : 위쪽 행 (100)를 제외한 희석 등. 대조군으로 맨 위 행을 사용하여 볼륨 컨트롤로 각 웰에 DDH 2 O의 10 μl를 추가합니다.
- 종래 바이러스 배양 모든 웰의 초기 접종하여 각 행의 제 1 웰을, 실험 세포 수와 비교 시작 기준선 세포 농도를 확립 해리 및 카운트하기 위해.
- 배양 플레이트에게 pH 변화를 나타내는 매체의 모든 색상 변경 및 세포 형태의 변경에 대한 바이러스 접종 후 매 24 시간을 모니터링합니다.
- 100X TM에서 도립 현미경을 이용하여 각 시점에서의 테스트 플레이트의 이미지 한 칼럼.
- 각 24 시간 시점에서 이미지화 된 열에서 모든 매체를 제거하고 -80 ° C에서 RNA 추출 및 바이러스 정량 또는 장기적으로 -20 ° C에 그것을 단기를 저장합니다.
- 셀 PELLE 다시 중단 효소 활성 및 신선한 배지 ~ 250 μl를 중지 0.25 % 트립신 EDTA 및 신선한 배지 만 ~ 250 μl를 사용하여 1.9, - 이전의 단계 1.6에 기재된 바와 같이 매체를 제거한 후 웰로부터 세포를 해리t.
- 일주 이상 각 24 시간 동안 세포 분리 한 후 세포 수를 수행 할 수있는 세포를 포함하는 각각의 튜브에 0.4 %의 트리 판 블루 염색의 10 μl를 추가합니다. 얼룩이 세포 수를 수행하기 전에 10 분 동안 앉아 할 수 있습니다.
- 얼룩뿐만 아니라 비 가능한 세포 통풍 관을 시작합니다 스테인 노출 또는 가능한 세포의 1 시간 이내에 세포 수를 수행합니다.
- 천천히 마이크로 피펫을 사용하여 표준 혈구의 각 측면에 염색 세포 용액 10 μL를 추가한다. 허용 용액을 공기 방울을 방지하기 위해 모세관 현상에 의해 흡수된다.
- 혈구 양쪽 가능한 (착색되지 않은) 셀의 개수 (혈구에서 16 제곱의 4 카운트에 해당)를 카운트. 제거 된 컬럼의 각 웰에 세포 수를 수행합니다.
- 각 열에서 세포 수를 평균 전체 셀 카운트 수 구하는 다음의 공식을 사용 X 희석 인자 (세포 / 4의 평균 수) = X (10)의 셀 수가
세포 배양에서 4 바이러스 추출
- 처리 H. 제거 효소 활동을 중지하기 위해 0.25 % 트립신 EDTA와 신선한 매체 만 ~ 250 μl를 사용하여 1.8 - 배양 플라스크에서 vitripennis 세포는 이전 단계 1.6에 설명 된대로.
- 상층 액을 버린다.
- 2.8 - 이전 단계 2.3에 설명 된 프로토콜 다음 배양 세포에서 바이러스의 압축을 풉니 다.
5 RNA 추출
- 제조 업체의 프로토콜 당 액체 샘플을 위해 설계된 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출을 사용하여 각 한 주 바이러스 시험에서 수집 된 매체 샘플에서 RNA를 추출합니다.
- 스토어는 -80 ° C에서 샘플을 추출 하였다.
6 RT-PCR
- 사용하여 기존의 PCR을 실행하여 RT-PCR을위한 바이러스 성 기준을 설정프라이머 쌍 HoCV RT-PCR 프라이머 1 (정방향 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 '- ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3 5'리버스 ') 바이러스가 몸 전체 H.에서 분리 vitripennis.
- 제목 PCR 생성물을 0.1 % 에티 디움 브로마이드를 함유하는 2 % 아가 로즈 젤에서 120 V에서 60 분간 전기 영동 겔.
- 겔에서 밴드를 절제하고 제조자의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 정제.
- 수영장은 모두 절제 젤 정제 제품 또한 기본 에탄올 침전에 의해 정화. 전체 시료 농도를 증가 트리스 EDTA (TE)의 약 30 μL로 침전 생성물을 용출.
- 핵산 검출 용 230분의 260 파장 설정을 사용하여 분광 광도법을 통해 풀링 된 cDNA 샘플에서의 수준을 정량화.
- 57 NG에 이르기까지 정제 된 시료의 10 배 용액을 희석 시리즈를 수행 / 57 AG / μL (10 -18)에 μL. 유사한 직렬 희석 제가 설명 수행N 농도 조건에서의 차이에 대한 조정이 이루어 2.8.
- 미량의 성적 증명서의 신뢰성 정량화와 QRT-PCR 키트를 사용하여 QRT-PCR을 수행하여 희석 시리즈의 검출 한계를 결정합니다.
참고 : 5 × 10 -3 사본보다 바이러스 농도가 낮은는 검출되지 않습니다. - 단계 5.1에서 전술 한 바와 같이 실험 샘플에서 RNA를 추출하고 분광 광도계를 사용하여 정량화.
- 클리 무료 물을 사용 μL / 5 NG 모든 추출 된 샘플을 정상화.
- 다음과 같이 25 ㎕의 반응이 낮은 사본 번호를 감지 할 수있는 능력을 한 단계 QRT-PCR 키트를 사용하는 것으로, 중복에, 모든 샘플에 QRT-PCR을 수행 : 50 ° C 10 분 동안 유지; 5 분 동안 95 ° C에서 개최; 10 초, 30 초 동안 60 ° C, 95 ° C의 30주기; 각 단계에서 5 초 동안 99 °의 C - 50에서 녹아.
- 각각의 반응 혼합물은 1X maste 12.5 μl를 포함하도록 마스터 믹스 만들기R 믹스, 앞으로 프라이머의 1.0 μL (0.3 μM), 역방향 프라이머의 1.0 μL (0.3 μM), 역전사 효소 및 표준화 값을 기반으로 템플릿의 변수 금액의 0.25 μL.
- 의 RNase 무료 물 25 μL에 총 반응 볼륨을 가져와.
- 각 PCR에 다섯 표준 농도는 다음 복사본 번호와 함께 실행 같습니다 × 10 -10 5, 5 × 10-8, 5 × 5 × 10 -4 -6 10, 5 × 10 -2 사본. 각 실행의 시작 부분에 초기 취득시 소음을 줄이기 위해 단지 10 배 -2.5의 형광 아래에 각 실행에 대한 임계 값을 설정합니다.
7 공 초점 현미경
- 물론 각 직경 18mm를 측정 열두 웰 플레이트 포함 유리 커버 슬립에 Homalodisca vitripennis 세포를 성장.
- 단층이 달성되면, 사일 동안 플레이트에 24 시간마다 하나의 칼럼을 접종한다. 각 C 있는지 확인olumn 잘 컨트롤이 포함 낮은 바이러스 희석 (1시 10분)도 높은 바이러스 성 희석 (1 : 100,000) 잘. 단계 2.8에서 얻은 바이러스 솔루션을 사용합니다.
- 다섯째 날에 모든 미디어를 제거하고 두 번 1X PBS (산도 7.4)로 세포를 씻어.
- 30 분 동안 4 ° C에서 차가운 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
- 1X 인산염의 500 μL은 세포에 생리 식염수 (PBS)를 버퍼에 추가하고 저속에서 로커에 RT에서 10 분 동안 씻어. 세포를 세 번 씻으십시오.
- 그들을 Permeabilize 하시려면하는 세포에 0.1 % 트리톤 X-100의 500 μl를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 앉아 보자.
- 세포를 씻고 다시 같은 이전 단계 7.5에 설명.
- RT에서 세포를 차단하기 위해 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 500 μl를 추가. 2 시간 동안 앉아서 다음 제거하자.
- 1X PBS가 5 % BSA를 포함하는 250와 F-액틴에 대한 얼룩에 각 웰에 희석 250 μl를 추가 : 재고 로다 민 레드 - 복합 phalloidin (RCP) 하나를 희석.
- 알루미늄 f를 커버 플레이트오일은 표백에서 염료를 방지하고 4 ° CO / N에서 세포를 배양한다.
- 배양 12 시간 후 RCP를 제거하고 세포의 핵을 염색하기 위해, 5 % BSA를 함유하는 1X PBS에 희석하여 6-diamidino-2-페닐 인돌 (4)의 250 μL '(DAPI) (250 μg / ㎖)로 대체 .
- 1 시간 동안 RT에서 DAPI를 포함하는 세포를 배양한다.
- 이전 단계 7.5에 설명 된대로 1X PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
- 조심스럽게 우물 된 커버를 제거하고 방지 페이드 시약 장착 미디어를 사용하여 슬라이드를 현미경 마운트합니다.
- 공 초점 현미경으로 볼 때까지 슬라이드 박스 차광에서 건조하도록 허용합니다. 염료가 빠르게 사라질 수로보기는 가능한 한 빨리 슬라이드를 준비했다.
- 63X (오일) 계획 - apochromate 렌즈를 포함하는 현미경 장착 공 초점 영상 시스템을 이용하여 염색 된 세포.
- 543 ± 10 nm의 여기 및 Rhoadmine 레드 conjucated phalloidin 대 575 ± 10 nm의 방출에 레이저 파장을 설정DAPI 대, 및 369 ± 10 nm의 여기 및 450 ± 30 nm의 방출.
- 모든 이미지를 얻기 위해 감지기 동일한 이득과 오프 설정 설정을 사용합니다.
- 화상 처리에 적합한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 관리하는 소프트웨어에 정렬 및 수입 원하는 이미지와 이미지 프로세스.
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Representative Results
세포 부착과 성장은 차 문화와 계속 통로에서, 크고 작은 문화 플라스크에 통과 48 시간 내 보였다. 섬유 아세포의 성장과 발전은이 시간 내에 관찰되었다. 새로 시드 플라스크 48 시간 전에 교란되었을 때,이, 세포 부착에 보이는 감소했다 때로는 느린 성장 문화와 전혀 첨부 파일 또는 성장을 선도. 세포는 전달의 1 주일 이내에 약 80 %의 합류했고, 10~14일 (그림 1)에서 단일 층을 형성했다. 이 연구의 개시에서 재배 된 차 문화는 어떤 형태 저하 또는 전체 세포 생존 능력의 감소없이 30 + 세포 통로를 살아 남았다.
세포 부착과 성장은 판에 플라스크에서 통과 48 시간 내 보였다. 그것은 더 작은 성장 표면 그대로 단층 형성은, 더 짧은 시간주기에서 약 5-6일을 달성 하였다. 감염된 문화가 촬영t 100X는 광학 현미경 하에서 감소 셀 모양의 무결성의 흔적을 보여 주었다. 48 시간 게시물 감염에서 큰 구멍이 세포의 표면에 존재 할 것을 나타납니다. 약 72-96 시간이 아닌 희석 HoCV-01 (그림 2)에 감염된 후 배양 플라스크에 걸쳐, 세포가 수축하고, 문화면에서 분리.
제어 생균 수를 평균 및 실험 샘플을 계산하고 시간에 따른 바이러스 성 부하 사이의 생균 풍부 차이 (도 3)를 묘사하는 플롯 하였다. 대조군 생균의 일관성 증가는 건강한 세포를 나타내는 존재한다. 상대적으로, 모든 처리 군은 시간이 지남에 본 생균 수의 현저한 감소가 있었다. 낮은 바이러스 성 그룹이 천천히 144 시간이 떨어져까지 감소하면서 높은 바이러스 성 치료 그룹은 48 ~ 72 시간 사이에 살아있는 세포의 주요 드롭 문화 건강에 훨씬 더 표시 감소를 나타냅니다. 이 일원 분산 분석 위스콘신제 페로 니 사후 분석마다 연구 포인트뿐만 아니라, 그룹 간의 비교 각 처리 군에서 살아있는 세포 수에 기초 HoCV-01에 의해 세포 배양 킬 율의 차이를 시험 하였다. 분산의 양방향 분석 시간 배양의 길이가 치료 영향 배양 장수에 노출되었음을 시사 시간 계수, F (7, 432) = 82.5, p <0.0001의 중요한 주요 효과가 있었다. 치료 배양 수신 타입의 효과는 배양 초기에 수신 바이러스 부하의 양이 배양 생존에 영향을 미치는 것을 나타낸다뿐만 F (5, 432) = 170.6, p <0.0001 유의 하였다. 시간 요소와 처리 요소 사이의 상호 작용에 중요한 영향은 더 높은 바이러스 부하가 배양 니스를 줄이기 위해 필요한 시간보다 짧은 양을 획득하고, 반대로 것을 강조, 또한 F (35, 432) = 17.63, p <0.0001 존재 하부 바이러스 부하,동일한 효과를 위해 필요한 시간의 긴 기간. 페로 니 사후 시험 주목할 투여 량 반응을 나타내는, 처리 군과 대조군 사이에 유의 한 차이를 나타낸다.
평균 생균 분석에서 도출 된 결론의 상관 관계, 카플란 - 마이어 곡선 (그림 4)에서 테스트로 높은 바이러스 성 치료 접종 세포의 생존 확률은 낮았다. 제어 또는 비 - 감염된 세포에 대한 100 %의 생존율이 있었다. 저급 바이러스 치료 144 시간까지 생존 확률이 더 높은 반면 바이러스 성 치료에 노출 후 세포 생존 가능성의 감소가 존재하는, 시간이 지남에 생존 확률의 현저한 감소가 있었다. 콕스 비례 위험 모델 분석은 유의하지 않았다, 치료 선형 열팽창 계수 = 0.8812 (95 % CI [0.76, 1.02), P> 0.05. 중요한 것은 아니지만, 데이터를 바이러스에 노출 된 세포가 시간이 지남에 따라 더 낮은 생존율을 88 % 발휘할 가능성이 제안.
각 QRT-PCR 실행의 경우, 높은 바이러스 성 표준은 이전의 낮은 바이러스 성 표준 및 실험 샘플보다 램프 업. 각각의 실행에서, 코네티컷 값은 실험 샘플 HoCV RNA-01 존재 풍부 차이를 테스트하고 여러 개의 제어 값으로 값을 비교 양방향 ANOVA를 이용하여 분석 하였다 복제. 분산의 양방향 분석 유의 메인 시간 요소의 영향, F (7, 289) = 0.38, p> 0.05, 또는 시간과 처리 군 사이의 상호 작용에서, F (63, 289) = 0.14가 없었다 쪽 > 0.05. 초기에 세포 배양 물에 도입 바이러스의 양을 나타내는 처리 군, F (9, 289) = 135.7, p <0.0001, 간의 중요한 주요 효과는 관찰 검출 바이러스 RNA의 양에 영향을 미친다. 페로 니 사후 테스트 실행 및 치료 그룹과 통제 조치하지만, 치료 g 사이에 유의 한 상호 작용 사이의 중요한 상호 작용을 표시했다어떤 측정 가능한 용량 반응이 없음을 나타내는 혼자 roups.
건강의 세포 형태 및 HoCV-01의 차이는 H. 감염 24 및 72 시간에서 vitripennis 세포를 형광에서 관찰되었다. 현재 핵의 수의 감소뿐만 아니라 컨트롤과 비교 HoCV-01에 노출 된 세포에서 F - 굴지의 흉한 모습은 바이러스가 문화의 건강에 큰 영향을 가지고 있음을 나타냅니다. 1시 10분 높은 바이러스 부하에 노출 세포 하부 바이러스 치료에 노출 셀보다 큰 고통을 보였다. 제어 세포는 더 풍부 표시하고이 시점 (그림 5) 사이의 정상적인 형태를 가지고.
| 그레이스의 곤충 매체 (보충, 1 배) | 210 ml의 |
| 0.06M의 L-히스티딘 일 수화물 용액 (pH가 6.5) | 290 ml의 |
| 보통 199 (10 배) | 10 ML |
| 중간 1066 (1X) | 17 ML |
| 행크의 균형 소금 (1 배) | 33 ML |
| L-글루타민 (100 배) | 1.5 ml의 |
| MEM 아미노산 믹스 (50X) | 1.5 ml의 |
| 한 M를 MgCl 솔루션 | 6 ML |
| 펜 연쇄상 구균 (글루타민 / w) | 2.5 ㎖ / 500 ㎖의 |
| 니 스타틴 | 1.0 ㎖ / 500 ㎖의 |
| 겐타 마이신 | 1.5 ㎖ / 500 ㎖의 |
| 우선 당 | 1.8 g |
| 태아 혈청 | 최종 부피의 10 % |
표 1 H2G + 매미충 매체의 구성 요소.
H.의 1 이미지 그림 vitripennis CE100X TM 캡처 체외에서 LL 성장. (A) 세포 이일 (48 시간) 부착과 섬유 아세포 개발을 전시 후 통과. 세포 넷, 여섯, 팔과 십일 문화 표면을 가로 질러 계속 성장 후 통로 (BE). (F) 단일 플라이 형성은 발생 ~ 10 십사일. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 H. 감염 100X TM에 군데 vitripennis 세포는 형태 학적 변화를 포착합니다. 이전 접종에 (A) 섬유 아세포 성장. (B) 셀 24 시간 후 감염. (C) 세포를 48 시간 게시물 감염. (D) 96 시간 후 감염 세포가대부분의 문화 표면에서 분리 및 매체는 흐린되고있다. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
바이러스 부하가 실험 기간 동안 매일 수신 및 표준 편차 막대 여기에 표시됩니다에 의해 실험 샘플에 대한 평균 살아있는 세포 수를 보여주는 그림 3 막대 차트. 살아있는 세포 수의 평균은 실험 샘플에 대한 계산 하였다. 세포 수는. 낮은 바이러스 부하와 함께 ~ 144 시간 게시물 감염에서 살아있는 세포 수에서 높은 바이러스 부하와 유의 한 감소와 살아있는 세포에서 유의 한 감소 ~ 72 시간 게시물 감염을 보여 평균 하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
H.에 감염되지 않은 대조군에 비해 다섯 가지 HoCV-01 치료의 그림 4 Kaplan-Meier 생존 분석 vitripennis 세포 배양. 제어 배양 오 처리 군에 비해 100 %의 생존율을 유지 하였다. 가장 낮은 생존 확률이 높은 치료 그룹에서 관찰되었다 모든 치료 그룹이 168 시간 N = 10에서 0 생존 확률 향한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Figu. 24 시간 간격으로 100,000 농도 : Homalodisca vitripennis 셀이 직렬로 감염된 5 제어 공 초점 이미지와 감염 H.vitripennis 세포 재 1:10 일에 HoCV-01를 희석. 세포는 문화 내에서 F-액틴과 핵을 시각화 로다 민 phalloidin 및 DAPI 얼룩으로 처리 하였다. 공 초점 이미지는 63X에서 캡처 낮고 높은 바이러스 성 희석 모두에서 72 시간에 세포 형태에서 휴식을 표시했다. 스케일 바 :. 1 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
침략 농업 종의 유입에 대한 상승 우려는 새로운 해충과 병원균에 대한 방어 할 수있는 새로운 방법론에 대한 수요 증가로 이어질했다. 질병 예방과 관리의 초점은 병원체 벡터의 관리를 포함하고이 연구의 주된 목표였다. 경제적 실용화가 큰 영역 위에 있지만 저비용 12에서 대량으로 필요하기 때문에 농업용 병원체 경로를 관리하는 생물 농약이 유형을 생성하는 결정에 중요한 역할을한다. 연구 및 개발을위한 세포 배양을 이용하는 방법은 점점 일반화되고있다 이와 같이, 본 연구의 영향은 중요합니다. 경제적으로 통합 해충 관리 (IPM) 전략을 확인하는 것은 전 세계적으로 계속 성공적인 농업 생산의 핵심이며, 본 연구의 결과는 IPM 전략을 개선하고 소문의 PD의 발생을 감소시키는 발전에 기여한다.
H. vitripennis 세포 배양은 전파와 눈에 보이는 형태 저하없이 년 이상 유지되었다. 통로 번호 대폭 세포 대사 및 성장 특성 (13)을 변경하여 포유 동물 세포에 시험 관내 시험의 결과에 영향을 줄 수있다. 세포는 생체 내 및 시험 관내 복제로서, 텔로미어 세포 복제의 각 라운드로 단축하고 결국 너무 짧아 텔로미어 임계 한계에 도달하고 세포 노화를 유발 14. 심각한 텔로미어의 단축이 발생하면 유전 적 불안정성 그리고 마지막으로 위기 또는 대규모 세포 죽음은 15을 발생합니다. 이 현상의 문화는 거의 50 subcultivations 또는 일년 이상 생존하지 않기 때문에, 다음과 같은 기준에 따라, 헤이 플릭 한계를 인정 : 성 염색질, histotypical 차별화, 적응성의 유지를 문화, 비 악성 생체 내 특성, 재배의 유한 한 한계를 일시 중단일차 조직과 유사한 세포 형태는, 세포주, 콕 사키 A9 수용체 물질의 보존 및 균주 16 개발 될 수있는 용이성과 비교하여 산의 생산을 증가시켰다. 통로 번호의 합병증은 세포주의 증식이 방법은 오랜 기간 동안 지속적인 생산이 가능한 것을 나타내는 본 연구 기간 동안 관찰되지 않았다. 살아있는 곤충 사육 또는 다른 고가의 복잡한 제조 방법을 통해 세포 배양의 활용도가 급격히 다방면 일반화되고 있기 때문에, 세포주 이러한 유형의 장수는 많은 실용적인 응용을 갖는다. 적절히 유지되면, 하나의 일차 세포주는 바이러스 생산의 여러 차례에 사용될 수있다.
이러한 세포의 성공적인 장기 유지 보수 분야의 두 가지 주요 요소는 갓 시드 문화와 적절한 매체 준비를위한 장애 시간이었다. 4 첫번째에 그대로 남아 문화통과 후 8 시간은 초기 화면 내에서 이동 한 것과 비교 크로스 플라스크 성장의 현저한 증가를 보였다. 방해받지 않고 떠날 때, 세포의 빠른 복제 배양 플라스크에 적은 최대 10 일 후 통과를 단일 층을 달성했다. 중간 준비까지 일반적인 배양 건강에 관한 한 외란 시간과 같은 중요한 연구 기간 동안이었다. 심지어 매체에 존재하는 항생제로 세균의 오염은 매체를 준비 할 때 고려해야 할 중요한 요인이었다. 박테리아 오염으로 거의 존재하지 않는 요인으로 감소 되었기 때문에 배양에 사용하기 전에 몇 일 동안 RT에 남아 매체의 분액을 허용함으로써, 문화의 파괴적인 일련의 가능성은 축소. 겐타 마이신 및 스트렙토 마이신과 같은 항생제, 일반적으로 세포와 임의의 외부에서 발견 박테리아 오염을 방지하기 위해 세포 배양 배지에서 사용된다. 이들 항생제는 모두 포유 동물 배양 세포 성장의 우울증에 링크 된17,18 박테리아의 항생제 내성 균주 개발의 가능성을 증가시키기위한 무균 기술의 사용의 감소와 우려 D. 항생제를 과도하게 사용하지 않아야합니다; 그러나, 이들의 사용은 세포 배양 오염 문제를 방지하기 위해 필요하다.
이러한 요소의 의미는 세포의 업 스케일링 생산 세포 배양의 질을 보장하기 위해 약간의 단계를 생물 농약 물질의 신속한 대량 생산을위한 실행 가능한 옵션이되도록한다. 생물 반응 장치는 1950 년대와 1960 년대에 등장, 시간 19의 매우 짧은 시간에 세포의 수십억을 생산하는 효율적인 수단을 제공하기 위해 진화하기 때문에이있다. 생물 반응기의 많은 종류가 극적 H.의 수를 증가하기 위해 이용 될 수있을 vitripennis 셀은 한번에 제조 및 생산이 유형의 시스템을 개발하는 과정 이리저리 전단 않도록 세포를 치료하는 방법의 개발이 필요m의 성장은 생물 반응기에서 표면.
세포주를 성공적으로 계속 성장 바이러스 배양 내를 유지하도록 허용하여야한다 관내 복제 및 기간의 정량화를 위해 필요한 양 바이러스의 문제를 해결하는 데 사용될 수 HoCV-1 복제에 중요 한번 달성된다. 명확한 상관 관계가 셀에 의해 수신 된 초기 바이러스 부하의 양 및 시간 바이러스 입자의 재생 시간 사이에서 발견되었다가 셀들 내에 배양 허용 하였다. 빠른 바이러스 복제를 나타내는 세포 사멸에 대한 시간 요건, 하부, 바이러스 부하가 수신 높은. 그러나 모든 치료를 통해 세포 수는 무엇보다 중요한 세포 배양 생존 임계 값을 보여 약 25 × 10 4 세포 / ml의 임계 값 144 시간의 감염 후 아래로 떨어졌다. 결과는 더 많은 양의 바이러스가 감염 초기 쉽게 사용할 경우 바이러스 다량 빠르게 제조 할 수 있다는 것을 예시, 또는 그 incre바이러스 ased 양은 낮은 초기 투여 량으로 장기간에 걸쳐 제조 할 수있다. 농도와 시간 요소 사이의 관계의 변동성은 72-96 시간 게시물 감염의 최적 바이러스 추출 시간과 더 큰 규모의 연구 제작 옵션에 약간의 유연성을 제공합니다.
바이러스 성 연구에 세포 배양 물을 사용하여 대상을 검출 및 바이러스 연구의 결과를 정량화 할 수있는 능력에 의존한다. 이것에 대한 신뢰할 수있는 방법은 실험 샘플 내의 바이러스 RNA 서열의 존재를 확인하기 위해 PCR을 사용하는 것이다. 이 연구에서 PCR 데이터로부터 코네티컷 값의 분석은 바이러스의 최적의 추출 시간이 무엇인지에 대한 명확한 답을 제공하지 않습니다; 그러나, 최종 추출 시간의 부족 HoCV-01 체외에서 복제 무능력을 나타내는 것이 아니라 바이러스 연구의 중요한 자연의. 트리 판 블루를 사용하여 셀 수는 최적의 추출 시간을 명확하게보기로 빌려하지만이 definitiv 의미가 없습니다 않는다전자 대답. 세포 사멸 데이터는 매우 72 시간 후 세포 생존 감소에 높은 바이러스 부하가 문화에 세포가 죽기 시작하면서 48 시간, 72 시간 게시물 감염과 바이러스 추출 바이러스 입자의 세포 파괴를 줄이기 위해 이상적 일 수 있음을 나타내는 이어질 것으로 보여 기하 급수적. 낮은 초기 바이러스 부하에서 추출 시간은 더 모호하지만, 144 시간 후 세포 생존에 극적인 감소와 함께, 그것은 최적의 추출 시간은 24이 될 것이라고 추측 할 수있다 - 그 시점 이전에 48 시간. 최적의 바이러스 추출 시간의 결정은 H.에 대한 사용을위한 생물 농약의 효과적인 생산에 매우 중요합니다 vitripennis 침략이 연구는 그 시간의 결정을위한 중요한 단계를 촬영하고있다.
현미경은 세포 배양 분석을위한 핵심 도구이며,이 연구는 H.와 공 촛점 현미경을 사용하는 최초의 하나이다 vitripennis 세포. 이미징 단백질 부착 증가 또는 감소와 풍부한세포 핵은 체외에서 HoCV-01의 세포 내 활동에 대한 자세한 연구를위한 첫 단계입니다. 본 연구를 통하여, 세포 배양은 눈에 보이는 형태 열화로 유지 하였다. 각각의 후속 셀 통로 후 정상 섬유 아세포 성장은 단층을 형성 한 후, 관찰 하였다. 세포는 모양과 크기가 균일 남아 있었다. 감염된 배양은 공 촛점 현미경으로 촬상 한 경우에는, 세포 형태의 감소는 높은 및 낮은 초기 바이러스 부하 함께, 특히 72 시간의 시점에서 관찰되었다. 작은 구멍 형 구조 아마도 세포 사멸로 인한 세포 내 물질 추방 세포의 표면에서 볼 수 있었다. 플라스크 표면에서 세포는 말라 비틀어 결국 표면에서 분리하기 시작했다. 고해상도 현미경이 처음 사용에서 의미가 세포 생존 분석에서 볼 수있는 결과에 상관 증가 바이러스 연구에 대한 다른 가능한 용도를 일으킨다. 고급 마일HoCV-01에 대한 항체 개발이 수행 된 경우 croscopy 기술은 최대 기능에 활용 될 수있다. 바이러스에 대한 항체는 바이러스 입자의 세포 간 동작의 시각화를 허용 할뿐 아니라 확산 속도를 결정하고 더 정확한 추출 시간이 도움이 될 수.
세포의 바이오 매스가 큰 바이러스를 수확 한 다음 필드에 적용되는 지점으로 효과적인 생물학적 방제 제를 생산하기 위해 본 연구에서 개발 된 생산 방법을 스케일링 과정은 주로 비용의 문제이다. 대규모 시스템 구축의 초기 비용이 높고, 많은 요소들은 같은 고려해야한다 : 수익성, 세포 및 바이러스 생산, 세포 배양 배지 비용, 적용율, 생산 규모 및 배치 제작비 12. 초기 비용에도 불구하고, 잠재적 인 지불 오프는 투자 가치가있다. 스트림 정화 문제 아래, 세포 배양 기술을 이용함으로써 크게 감소 될장내 미생물 및 몸 전체의 곤충에서 발견 다른 바이러스의 가능성이 훨씬 살아있는 곤충 유지 보수 및 양육 시설 비용뿐만 아니라, 감소 원인이된다.
이미 단백질, 생물 농약 및 기타 의약품의 생산에 사용되는 세포 배양으로,이 분야의 연구에 대한 경제적 가치가 증가하고있다. 농업 생물 농약의 대량 생산의 경우, 하나의 여기 완료되었지만 더 큰 세포 성장 시스템을 사용하는 유사한 연구를 시도하는 것이 유익 할 것이다. 생물 반응기 및 3D 행렬 세포 성장 시스템의 새로운 방법론은 동일한 점에서 더 큰 볼륨의 생산 및 세포, 바이러스 생산 (20)의 큰 볼륨을 허용한다. 대규모 시스템 구축의 초기 비용이 높지만, 제조 할 수 물량의 보수는 더욱 커질 가능성이있다. 크게 대규모 시스템 describ에 전송 연구를 발전 빌려 것이다 연구의 영역에드 위의 항체 디자인이다. 항체 디자인은 HoCV-01에 대한 소비 시간과 자세한 과정 동안은 공 초점 현미경 시험 관내에서 바이러스 활동의 시각화를 허용 것, HIV 및 C 형 간염과 같은 질병에 대한 바이러스 연구에서 사용이 증가하고있다 및 기타로 이어질 수 조사 지역.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
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