Summary
Nous présentons ici un protocole de propager les cellules de Homalodisca et HoCV-1 in vitro. Le milieu a été retiré de HoCV-1 et des cultures positives ARN extrait tous les 24 h pendant 168 h. Cellule de survie a été quantifiée par coloration au bleu trypan. Particules virales entières ont été extraits après l'infection. L'ARN extrait a été quantifiée par qRT-PCR.
Abstract
Le tireur vitreux ailé (Homalodisca vitripennis) est un insecte extrêmement polyphage et vagile trouvé dans tout le sud-ouest des États-Unis. Ces insectes sont les vecteurs prédominants de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), une bactérie du xylème limitée qui est l'agent causal de la maladie de Pierce (PD) de vigne. La maladie de Pierce est économiquement dommageable; Ainsi, H. vitripennis sont devenus une cible pour des stratégies de gestion de l'agent pathogène. Un dicistrovirus identifié comme virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) a été associée à une mortalité accrue chez H. populations vitripennis. En raison d'une cellule hôte est nécessaire pour la réplication HoCV-01, la culture de la cellule fournit un environnement uniforme pour la réplication qui est ciblé sur le plan logistique et une valeur économique pour la production de bio-pesticide. Dans cette étude, un système de propagation à grande échelle de H. vitripennis cellules via la culture de tissus a été développé, pournir un mécanisme de réplication virale. HoCV-01 a été extrait des insectes de tout le corps et utilisée pour inoculer H. culture vitripennis cellules à différents niveaux. Le milieu de culture a été prélevé toutes les 24 h pendant 168 heures, l'ARN extrait et analysé par qRT-PCR. Les cellules ont été colorées avec du bleu trypan et on les compte pour quantifier la survie des cellules en utilisant la microscopie optique. Particules virales entières ont été extraites jusqu'à 96 heures après l'infection, qui a été le point d'être déterminé avant l'effondrement total de culture cellulaire a eu lieu de temps. Les cellules ont été également soumis à coloration fluorescente et visualisés en utilisant la microscopie confocale pour étudier l'activité virale sur l'intégrité de l'attachement et des noyaux F-actine. La conclusion de cette étude est que H. cellules vitripennis sont capables d'être cultivées et utilisées pour la production de masse de HoCV-01 à un niveau approprié pour permettre la production d'un biopesticide.
Introduction
Le vitreux ailé tireur (Homalodisca vitripennis Germar 1821) a été identifié comme le vecteur principal de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l'agent causal de la maladie de Pierce de la vigne (PD) en Amérique du Nord 1. Gestion des populations d'insectes est rapidement devenu le centre de recherche pour lutter contre ce problème dévastateur pour l'industrie de la viticulture en Californie et dans le sud des États-Unis. Un sens positif, virus à ARN simple brin appartenant à la famille Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) a été identifié dans H. sauvage populations vitripennis et démontré que l'augmentation de la mortalité chez les populations de 2-4, tout en réduisant la résistance de l'insecte aux insecticides.
Développement de méthodes de manière efficace arrière infecté H. vitripennis à l'âge adulte dans un environnement de laboratoire ont été difficiles car
L'objectif global des procédures suivantes est de produire une forte concentration de HoCV-01 convient pour une utilisation comme agent de lutte biologique. La réplication virale nécessite une cellule vivante, ce qui explique pourquoi cultiver avec succès et l'optimisation de H. vitripennis cultures est vitale pour le progrès de produire des niveaux rentables de virus.
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Protocol
1 Culture Cellulaire
REMARQUE: les lignées cellulaires de Homalodisca établies par le laboratoire Dr. Wayne Hunter au USDA Agricultural Research Service (Ft. Pierce, FL USA) ont été utilisés pour initier un stock de laboratoire composé de stades cellulaires mixtes incluant les fibroblastes initiales et monocouches.
- Effectuez les procédures suivantes dans un environnement de laboratoire stérile maintenue dans une plage de température de 20-24 ° C avec 25 cm 2 flacons de culture.
- Cultiver et maintenir les cultures dans 25 cm 2 flacons de culture de tissu en utilisant un milieu H2G + cicadelle, un média d'abeilles WH2 modifié 10 (tableau 1).
- Incuber des flacons de culture à 24 ° C avec ~ 53% d'humidité.
- Utilisez un microscope inversé à un grossissement total (TM) de 100X pour surveiller la croissance de la culture, par exemple, vérifier toute croissance cellulaire anormale, surveiller les contaminants potentiels, et vérifier les progrès de la croissance dans le culsurface ture.
- Effectuer un changement de milieu complet (~ 4 ml de milieu de culture par flacon) tous les 7 - 10 jours sans perturber la surface de culture.
- Faire passer les cultures lorsque la surface de culture est d'environ 80% couvert par une croissance cellulaire (confluent) en utilisant 0,25% de trypsine contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour dissocier les cellules. Ajouter ~ 2 - 3 ml de trypsine à chaque flacon de culture et d'exposer la culture (s) de l'enzyme de courtes périodes de temps (5-10 minutes) pour réaliser une dissociation complète des cellules.
- Ajouter une quantité égale de milieu frais au récipient de culture (s) (~ 2 - 3 ml) pour arrêter l'activité enzymatique et de transférer l'ensemble de la solution dans un tube conique de centrifugation.
- cellules de pellets par centrifugation à 4 ° C pendant 6 minutes à 350 x g.
- Eliminer le surnageant sans perturber le culot de cellules et ajouter ~ 8 ml de milieu frais à chaque tube. Homogénéiser doucement cellules à l'aide d'une pipette.
- cultures de Split à un ratio 1: 2 pour 25 cm 2 flacons (~ 4 ml de soluti cellulairepar ballon sur) et laisser les cultures fraîchement passés au repos pendant 48 heures pour permettre aux cellules en suspension à attacher à la surface du ballon.
REMARQUE: La culture de cellules de 48 puits stériles, des plaques de culture de tissu avec une surface de 1 cm 2 de croissance est également possible et on peut être maintenue de la même façon que les flacons de culture à une réduction de volume du milieu de culture à ~ 250 ul.
2 Extraction de virus entier
- Homogénéiser corps entiers de virus H. positif vitripennis dans un tampon phosphate, pH ~ 7,2, avec diéthyldithiocarbamate de sodium à 0,02% trihydrate (DETCA) par vortex pendant ~ 10 secondes d'intervalle jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de grosses touffes de tissus présents. Extrait virus via superspeed centrifugation à 124 500 g pendant 4 heures à 4 ° C ou 22 000 g pendant 16 heures à 4 ° C. Si un précipité se forme à la surface, les retirer avec un coton-tige stérile 11.
- Jeter le surnageant.
- Recueillir le culot etdissoudre avec 5 ml de tampon phosphate 10 mM (pas de DETCA), pH ~ 7,2, contenant 0,4% d'acide désoxycholique et Na-éther de polyéthylène glycol d'hexadécyle de 4% (Brij 52).
- Pour bien mélanger le culot, retirez la boulette du côté du tube et écraser jusqu'à en solution si nécessaire.
- Ajouter plus de tampon phosphate 10 mM dans ~ 5 ml incréments pour aider le culot aller dans une solution en cas de besoin et de les combiner en 2 tubes 11.
- Centrifuger la solution à 300 g pendant 15 min 11.
- Enlever le surnageant et passer la solution à travers un filtre de 0,45 um, et recueillir le filtrat dans un tube à grande collection 11.
- Transférer le filtrat sur une membrane de dialyse avec un poids moléculaire coupée (MWCO) de 3,5 kD, en utilisant de petites quantités de tampon phosphate 10 mM (pH 7) contenant aucun DETCA 11 si nécessaire.
- Placer la membrane de dialyse dans un grand bol rempli de trou DDH 2 O à 4 ° C. Changer le trou DDH 2 O chaque heure fou 5-6 heures, jusqu'à ce qu'un précipité blanc se forme dans la membrane 11.
- Recueillir le virus purifié à partir de l'intérieur de la membrane et de soumettre la solution de virus à 100% pour une série de dilutions de 10 fois par l'ajout de 10 ul de solution de 90 pl de trou DDH 2 O. Ensuite ajouter 10 ul de la dilution d'un autre 90 ul de trou DDH 2 O jusqu'à une dilution de 1: 100 000.
- solution de virus de magasin à -80 ° C.
3. réplication virale
- cellules de semences dans des plaques de culture de 48 puits et se développent toutes les lignes jusqu'à ce que la croissance des cellules est de 80% de confluence (environ post-passe 72 heures si les cellules se développent à un taux moyen).
- Inoculer chaque rangée de cellules par le virus dilué en série lorsque la croissance cellulaire atteint la confluence, c'est à dire, une ligne d'une dilution de 1:10, une ligne d'une dilution de 1: 100, etc, à l'exception de la rangée du haut. Utilisez la rangée du haut comme témoin et ajouter 10 ul de ddH 2 O dans chaque puits comme un contrôle de volume.
- Afin d'établir une concentration de cellules de base de départ pour la comparaison avec le nombre de cellules expérimentales, de dissocier et de compter le premier puits de chaque rangée avant l'inoculation initiale de tous les puits dans les cultures infectées par le virus.
- Surveiller les plaques de culture toutes les 24 h après l'inoculation virale de tout changement de couleur dans le milieu indiquant un changement de pH et des éventuelles modifications de la morphologie des cellules.
- L'image d'une colonne de la plaque d'essai à chaque point de temps, à l'aide d'un microscope inversé à 100X TM.
- Retirez tout support de la colonne qui a été reproduite à chaque point de temps de 24 heures et le stocker à court terme à -20 ° C pour l'extraction de l'ARN et la quantification virale ou à long terme à -80 ° C.
- Dissocier les cellules des puits après l'élimination du milieu tel que décrit précédemment dans les étapes 1.6 à 1.9, en utilisant seulement ~ 250 pl de 0,25% d'EDTA à la trypsine et du milieu frais pour arrêter l'activité enzymatique et ~ 250 pl de milieu frais pour remettre en suspension la pelle cellulairet.
- Ajouter 10 ul de 0,4% trypan bleuissement à chaque tube contenant des cellules pour effectuer des comptages de cellules après dissociation de cellule pour chaque période de 24 heures sur une semaine. Laisser tache à reposer pendant 10 min avant d'effectuer la numération des cellules.
- Effectuer le nombre de cellules dans 1 heure d'exposition à tacher ou cellules viables va commencer à absorption tache ainsi que les cellules non-viables.
- Ajouter lentement 10 ul de la solution de cellules colorées de chaque côté d'un hémocytomètre standard à l'aide d'une micropipette. Laisser la solution pour être repris par une action capillaire pour éviter les bulles d'air.
- Compter le nombre de cellules viables (non colorées) des deux côtés de l'hématimètre (l'équivalent de 4 chefs d'accusation de 16 places dans le hématimètre). Effectuer le nombre de cellules de chaque puits de la colonne qui a été supprimé.
- En moyenne le nombre de cellules de chaque colonne et utiliser la formule suivante pour obtenir le nombre total de comptage cellulaire: (nombre moyen de cellules / 4) x facteur de dilution = nombre de cellules x 10
4. Virus Extraction de culture cellulaire
- Retirer H. traité vitripennis cellules provenant des flacons de culture tel que décrit précédemment dans les étapes 1.6 à 1.8, en utilisant seulement ~ 250 ul d'EDTA 0,25% de trypsine et du milieu frais pour arrêter l'activité enzymatique.
- Jeter le surnageant.
- Extrait virus à partir des cellules de culture en suivant le protocole précédemment décrit dans les étapes 2.3 à 2.8.
5 Extraction de l'ARN
- Extraire l'ARN à partir d'échantillons prélevés au cours de chaque moyen d'essai de virus d'une semaine à l'aide d'une extraction thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium conçu pour des échantillons liquides par le protocole du fabricant.
- Magasin extrait des échantillons à -80 ° C.
6. RT-PCR
- Établir des normes viraux pour la RT-PCR en exécutant PCR traditionnelle utilisant lepaire d'amorces primaire HoCV RT-PCR 1 (avant 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-inverser ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') par le virus isoler de tout corps H. vitripennis.
- Sous réserve de produit de PCR à une électrophorèse sur gel de 60 min à 120 V dans un gel d'agarose à 2% contenant 0,1% de bromure d'éthidium.
- Exciser les bandes à partir du gel et on purifie en utilisant un kit d'extraction de gel selon le protocole du fabricant.
- Piscine toute excisée et le produit purifié sur gel et purifier davantage par précipitation à l'éthanol de base. On élue le produit de précipitation dans environ 30 ul de Tris EDTA (TE) pour augmenter la concentration de l'échantillon global.
- Quantifier le niveau de l'ADNc dans les échantillons mis en commun par spectrophotométrie en utilisant les paramètres de longueur d'onde 260/230 pour la détection d'acide nucléique.
- Effectuer une série de dilution en série de dix fois de l'échantillon purifié allant de 57 ng / ul à 57 ag / ul (10 -18). Réaliser des dilutions en série du même type que celui décrit in 2.8 avec des ajustements effectués pour la différence dans les exigences de concentration.
- Déterminer les limites de détection de la série de dilutions en effectuant qRT-PCR en utilisant un kit de qRT-PCR avec une quantification fiable de transcrits de faible abondance.
REMARQUE: Les concentrations virales inférieure à 5 x 10 -3 copies ne sont pas détectables. - Extraire l'ARN à partir d'échantillons expérimentaux comme décrit précédemment à l'étape 5.1 et de quantifier par spectrophotométrie.
- Normaliser tous les échantillons prélevés à 5 ng / ul avec de l'eau sans nucléase.
- Effectuer qRT-PCR sur tous les échantillons, en double, que les réactions 25 ul en utilisant un kit qRT-PCR en une seule étape avec la possibilité de détecter un faible nombre de copies de la manière suivante: 50 ° C pendant 10 min tenir; 95 ° C pendant 5 min; 30 cycles de 95 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 s; faire fondre de 50 à 99 ° C pendant 5 secondes à chaque étape.
- Faire le mélange maître de sorte que chaque mélange réactionnel contient 12,5 pi de maste 1xr mélange, 1,0 pi (0,3 M) de l'amorce de l'avant, 1,0 pi (0,3 M) de l'amorce inverse, 0,25 ul de la transcriptase inverse et des quantités variables de modèle basé sur des valeurs de normalisation.
- Amener le volume réactionnel total de 25 ul avec de l'eau libre de la RNase.
- Inclure les cinq concentrations standard dans chaque PCR effectuées avec les nombres de copies suivantes: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 et 5 x 10 -2 copies. Régler le seuil pour chaque course juste au-dessous d'une fluorescence de 10x -2,5 à réduire le bruit lors de l'acquisition précoce au début de chaque course.
7. microscopie confocale
- Cultiver les cellules Homalodisca de douze dans une même plaque contenant des lamelles de verre mesurant 18 mm de diamètre dans chaque puits.
- Inoculer une colonne sur la plaque toutes les 24 heures pendant une période de quatre jours, une fois par monocouche est obtenue. Veiller à ce que chaque cOLONNE puits contient un contrôle, une faible dilution virale (1:10) et ainsi une dilution virale élevée (1: 100.000) bien. Utiliser des solutions de virus obtenus à l'étape 2.8.
- Retirez tous les supports sur le cinquième jour et laver les cellules deux fois avec 1x PBS (pH 7,4).
- Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% à froid à 4 ° C pendant 30 min.
- Ajouter 500 ul de 1x tampon phosphate salin (PBS) pour les cellules et les laver pendant 10 min à température ambiante sur un agitateur à faible vitesse. Laver les cellules trois fois.
- Ajouter 500 ul de 0,1% de Triton X-100 aux cellules pour les perméabiliser. Laisser reposer pendant 10 min à température ambiante.
- Laver les cellules de nouveau tel que décrit précédemment à l'étape 7.5.
- Ajouter 500 ul d'une albumine de sérum bovin (BSA), une solution à 5% pour bloquer les cellules à température ambiante. Laisser reposer pendant 2 h puis retirez.
- Diluer actions rhodamine phalloïdine conjugué à du rouge (RCP) 1: 250 dans du PBS 1X contenant 5% de BSA et ajouter 250 microlitres de la dilution à chaque puits pour tache de F-actine.
- Plaque de couverture en aluminium fhuile pour empêcher le colorant de blanchiment et incuber les cellules à 4 ° CO / N.
- Retirez le RCP après 12 heures d'incubation et le remplacer par 250 pi de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (250 pg / ml) dilué dans du PBS 1X contenant 5% de BSA, pour colorer les noyaux des cellules .
- Incuber les cellules contenant du DAPI à la température ambiante pendant 1 heure.
- Laver les cellules trois fois avec du PBS 1x, comme décrit précédemment à l'étape 7.5.
- Retirez délicatement les lamelles des puits et installer des lames de microscope à l'aide d'un milieu de montage avec un réactif anti-fade.
- Laisser sécher les lames en opaque boîtes à être examinés au microscope confocal. Voir préparé diapositives dès que possible en tant que colorants peuvent s'estomper rapidement.
- Images colorées cellules en utilisant un système confocal équipé d'un microscope contenant une lentille 63X (huile) Plan-apochromate.
- Définissez les longueurs d'onde laser à 543 ± 10 nm excitation et 575 ± 10 nm émission pour Rhoadmine phalloïdine rouge-conjucated, Et 369 ± 10 nm excitation et 450 ± 30 nm émission pour DAPI.
- Utilisation gain identique et les paramètres pour compenser le détecteur afin d'obtenir toutes les images.
- Traiter les images en utilisant un logiciel approprié pour le traitement de l'image et de tri et d'importer des images de votre choix dans un logiciel de gestion d'image.
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Representative Results
attachement cellulaire et la croissance a été observée dans les 48 heures de passage dans les deux petites et grandes flacons de culture, de cultures primaires et les passages continus. la croissance des fibroblastes et le développement a également été observée dans ce laps de temps. Lorsque flacons nouvellement ensemencées ont été perturbés avant 48 h, il y avait un déclin visible dans la fixation des cellules, conduisant à des cultures à croissance plus lente et parfois pas de fixation ou de croissance du tout. Les cellules ont été d'environ 80% de confluence en une semaine de passage et forment une monocouche de 10 à 14 jours (figure 1). Les cultures primaires qui ont été cultivées au début de cette étude, ont survécu plus de 30 passages de cellules sans aucune détérioration morphologique ou baisse globale de la viabilité cellulaire.
l'attachement des cellules et la croissance a été observée dans les 48 heures de passage de flacons à plaques. la formation de monocouche a été réalisée dans une période de temps plus courte, environ 5 à 6 jours, comme il s'agit d'une surface de croissance plus faible. Cultures infectées photographié unt 100X en microscopie optique a montré des signes de déclin de l'intégrité de la forme des cellules. A 48 heures post-infection, ce qui semble être de grands trous étaient présents à la surface des cellules. Partout des flacons de culture, les cellules rétréci et détachés de la surface de culture d'environ 72-96 heures après avoir été infectées par le non-dilué HoCV-01 (Figure 2).
Moyenne du nombre de cellules vivantes pour le contrôle et les échantillons expérimentaux ont été calculés et tracés pour illustrer les différences dans l'abondance de cellules vivantes entre les charges virales dans le temps (figure 3). Une augmentation constante des cellules vivantes pour le groupe de contrôle est présent, ce qui indique des cellules saines. En comparaison, tous les groupes de traitement ont eu une diminution marquée du nombre de cellules vivantes présentes dans le temps. Les groupes de traitement virales plus élevées indiquent une baisse beaucoup plus marquée en matière de santé de la culture avec une baisse importante dans les cellules vivantes entre 48-72 heures, tandis que les groupes viraux inférieurs diminuent lentement jusqu'à déposer autour de 144 h. Une ANOVA à deux voies wie Bonferroni analyse post-hoc a été utilisé pour tester les différences de culture cellulaire taux de destruction par HoCV-01 basé sur le nombre de cellules vivantes dans chaque groupe de traitement par rapport à chaque point de temps à l'étude, ainsi qu'entre les groupes. L'analyse bidirectionnelle de la variance a eu un effet principal significatif du facteur temps, F (7, 432) = 82,5, p <0,0001, ce qui suggère que la longueur de temps de cultures ont été exposées à un traitement affecté culture longévité. L'effet du type de traitement reçu cultures est significative ainsi, F (5, 432) = 170,6, p <0,0001, ce qui indique que le montant de la charge virale d'une culture reçoit d'abord affecte la survie de la culture. Un effet significatif de l'interaction entre le facteur temps et le facteur de traitement est également présent, F (35, 432) = 17,63, p <0,0001, ce qui souligne que plus la charge virale a reçu le court laps de temps nécessaire pour réduire la culture remise en forme et inversement la partie inférieure de la charge virale, laplus longue période de temps nécessaire pour le même effet. Tests post-hoc de Bonferroni montrent une différence significative entre les groupes de traitement et de contrôle, indiquant une réponse de dose notable.
La probabilité de survie de cellules inoculées avec des traitements viraux plus élevés a été plus faible que testé par des courbes de Kaplan-Meier (figure 4), en corrélation avec les conclusions tirées de l'analyse du nombre moyen de cellules vivantes. Il y avait un taux de survie de 100% pour le contrôle ou des cellules non-infectées. Les cellules exposées à des traitements viraux élevés eu une baisse marquée de la probabilité de survie au fil du temps, alors que les traitements viraux inférieurs ont une plus grande probabilité de survie jusqu'à l'heure 144, puis une baisse de la probabilité de survie est présent. Risques proportionnels de Cox analyse du modèle n'était pas significative, le traitement coeff = 0.8812 (IC 95% [0,76, 1,02]), p> 0,05. Bien que n'étant pas significative, les données suggèrent que les cellules exposées au virus sont 88% plus susceptibles de présenter des taux de survie inférieurs au fil du temps.
Pour chaque passage qRT-PCR, les normes plus élevées virales ont accéléré plus tôt que les normes virale est plus faible et les échantillons expérimentaux. De chaque terme, de reproduire les valeurs de Ct ont été analysés en utilisant une ANOVA à deux voies pour tester les différences dans l'abondance de HoCV-01 ARN présent dans les échantillons expérimentaux et comparer des valeurs à des valeurs de contrôle multiples. L'analyse bidirectionnelle de la variance a montré aucun effet significatif principal du facteur temps, F (7, 289) = 0,38, p> 0,05, ou dans l'interaction entre les groupes de temps et de traitement, F (63, 289) = 0,14, p > 0,05. Un effet principal significatif entre les groupes de traitement, F (9, 289) = 135,7, p <0,0001, ce qui indique la quantité de virus initialement introduit à la culture cellulaire affecte la quantité d'ARN viral détecté a été observée. Tests post-hoc de Bonferroni ont été effectués et montrent des interactions significatives entre les groupes de traitement et les mesures de contrôle, mais aucune interaction significative entre le traitement groupes seul, indiquant l'absence de réponse de la dose mesurable.
Les différences de morphologie des cellules en bonne santé et de HoCV-01 infectées par H. vitripennis cellules à 24 et 72 heures ont été observés sous fluorescence. La baisse de nombre de noyaux présents ainsi que l'aspect difforme de F-actine dans les cellules exposées à HoCV-01 par rapport aux témoins indiquent que le virus a un impact majeur sur la santé de la culture. Les cellules exposées à la plus élevée de la charge virale 01:10 montré une plus grande détresse que les cellules exposées au traitement viral inférieur. Les cellules témoins apparaîtront plus abondante et à avoir une morphologie normale entre les deux points dans le temps (figure 5).
| Du milieu des insectes de Grace (complété, 1x) | 210 ml |
| 0,06 M de L-histidine monohydraté solution (pH = 6,5) | 290 ml |
| Milieu 199 (10x) | 10 ml |
| Moyenne 1066 (1x) | 17 ml |
| Les sels équilibrée de Hank (1x) | 33 ml |
| L-Glutamine (100x) | 1,5 ml |
| MEM, mélange d'acides aminés (50x) | 1,5 ml |
| Solution 1 M de MgCl | 6 ml |
| Pen-Strep (w / glutamine) | 2,5 ml / 500 ml |
| Nystatine | 1,0 ml / 500 ml |
| Gentamycin | 1,5 ml / 500 ml |
| Dextrose | 1,8 g |
| De sérum bovin foetal | 10% du volume final |
Tableau 1 H2G + moyennes de la cicadelle composants.
Figure 1. Images de H. vitripennis CEla croissance ll in vitro capturé à 100X TM. (A) des cellules deux jours (48 heures) après le passage présentant attachement et le développement des fibroblastes. (BE) Cellules quatre, six, huit et dix jours après passage continue de croître sur toute la surface de culture. Formation (F) monocouche survenant ~ 10 14 jours. Les barres d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Infected H. vitripennis cellules imagées à 100X TM pour capturer les changements morphologiques. (A) la croissance des fibroblastes avant l'inoculation. (B) des cellules 24 heures après l'infection. (C) Les cellules après l'infection de 48 heures. (D) des cellules après l'infection de 96 h ontla plupart du temps détaché de la surface de milieu de culture et est devenue trouble. Les barres d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Diagramme à barres montrant le nombre de cellules vivantes moyennes pour les échantillons expérimentaux. Moyenne du nombre de cellules vivantes ont été calculés pour les échantillons expérimentaux par la charge virale a reçu pour chaque jour au cours de la période expérimentale et sont présentés ici avec des barres d'écart-type. Le nombre moyen de cellules montrent une diminution significative dans les cellules vivantes ~ 72 heures post-infection avec une charge virale élevée et une diminution significative du nombre de cellules vivantes à ~ 144 heures post-infection avec des charges virales inférieures. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 Analyse de Kaplan Meier de la survie de cinq différents traitements HoCV-01 par rapport à un témoin non infecté en H. des cultures de cellules. vitripennis cultures témoins ont maintenu un taux de survie de 100% par rapport aux cinq groupes de traitement. La probabilité de survie plus faible a été observée dans le groupe de traitement élevée et tous les groupes de traitement tête vers zéro la probabilité de survie à 168 h lorsque n = 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figu. re 5. images confocale de contrôle et les cellules infectées H.vitripennis Homalodisca cellules vitripennis ont été infectées par dilué en série HoCV-01 à 01h10 et 1: 100.000 concentrations à intervalles de 24 heures. Les cellules ont été traitées avec de la rhodamine phalloïdine DAPI et les taches de visualiser la F-actine et des noyaux dans les cultures. Les images confocales ont été capturés à 63X et montrent une rupture dans la morphologie des cellules à 72 heures à deux dilutions virales basses et hautes. Les barres d'échelle:. 1 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Préoccupations croissantes concernant l'introduction d'espèces invasives agricoles ont conduit à une demande accrue de nouvelles méthodes pour se défendre contre les ravageurs et agents pathogènes émergents. Un centre de prévention et de gestion de la maladie implique la gestion des vecteurs de pathogènes et était la cible principale de cette étude. Economie jouent un rôle essentiel dans la décision de produire ce type de biopesticide pour gérer les vecteurs de pathogènes dans l'agriculture parce que l'application pratique doit être de grandes quantités sur de grandes surfaces, mais à un faible coût 12. La pratique de l'utilisation de la culture de cellules pour la recherche et le développement est devenu de plus en plus commun et en tant que tel, les impacts de cette étude sont importantes. Identifier des stratégies économiquement viables de lutte antiparasitaire intégrée (LAI) est un élément clé de la poursuite de la production agricole dans le monde entier avec succès et les résultats de cette étude contribuent aux progrès réalisés dans l'amélioration des stratégies de lutte intégrée et de réduire l'occurrence de PD de la vigne.
H. primaire cultures cellulaires vitripennis ont été propagées et maintenues pendant plus d'un an sans aucune détérioration morphologique visible. numéros de passage peut affecter considérablement les résultats des études in vitro sur des cellules de mammifères en modifiant le métabolisme cellulaire et les caractéristiques de croissance 13. Comme les cellules se répliquent in vivo et in vitro, les télomères raccourcissent à chaque cycle de réplication cellulaire et finissent par atteindre un seuil critique où télomères trop court et induisent la sénescence cellulaire 14. Dans les cas graves raccourcissement des télomères se produit, l'instabilité génétique et enfin crise, ou mort cellulaire massive se produit 15. En raison de ce phénomène, les cultures survivent rarement au-delà de 50 sous-cultures ou d'un an, considérée comme la limite Hayflick, sur la base des critères suivants: la conservation de la chromatine sexuelle, la différenciation histotypical, inadaptation de suspendre la culture, les caractéristiques non malignes in vivo, limite finie de la culture, La morphologie des cellules similaire à un tissu principal, l'augmentation de la production d'acide par rapport aux lignées cellulaires, la rétention de Coxsackie A9 substance réceptrice et la facilité avec laquelle des souches pourraient être développées 16. Les complications possibles de nombres de passages n'ont pas été observées pendant toute la durée de cette étude, ce qui indique que ce mode de propagation de la lignée cellulaire est capable d'une production continue pendant des périodes de temps prolongées. Parce que l'utilisation de la culture cellulaire sur l'élevage d'insectes vivants ou d'autres méthodes de production coûteuses et compliquées est rapidement devenue courante dans de nombreuses disciplines, la longévité de ce type de lignée cellulaire a de nombreuses applications pratiques. Si elle est maintenue correctement, une seule lignée cellulaire primaire peut être utilisé pour plusieurs cycles de production de virus.
Les deux principaux facteurs de succès d'entretien à long terme de ces cellules étaient temps perturbation des cultures nouvellement ensemencées et préparation milieu approprié. Les cultures qui n'ont pas été touchés pour la première 48 h après le passage a montré une augmentation marquée de la croissance transversale ballon par rapport à ceux qui ont été déplacés à l'intérieur de cette fenêtre initiale. Quand on le laisse tranquille, la réplication rapide des cellules monocouches réalisé en aussi peu que dix jours après passage dans des flacons de culture. Préparation du milieu était aussi vital lors de l'étude que le temps de la perturbation que ce qui concernait la santé de la culture générale. Même avec des antibiotiques présents dans le milieu, la contamination bactérienne était encore un facteur important à considérer lors de la préparation moyenne. En permettant à des aliquotes de milieu de rester à température ambiante pendant plusieurs jours avant de les utiliser dans des cultures, la probabilité d'une série de culture dévastateur s'effondre en raison de la contamination bactérienne a été réduit à un facteur près inexistante. Des antibiotiques tels que la gentamicine et la streptomycine, sont couramment utilisés dans le milieu de culture cellulaire pour lutter contre les bactéries présentes à l'intérieur des cellules et de toute contamination extérieure. Ces deux antibiotiques ont été liés à une dépression de la croissance des cellules de mammifères en culture uned à une diminution de l'utilisation des techniques aseptiques et le souci d'augmenter la probabilité de développer des souches résistantes aux antibiotiques de bactéries 17,18. Les antibiotiques ne doivent pas être utilisés de manière excessive; cependant, leur utilisation est nécessaire pour empêcher culture cellulaire problèmes de contamination.
Les implications de ces facteurs sont tels que la production mise à l'échelle des cellules est une option viable pour la production de masse rapide de matériaux de biopesticides avec des mesures mineures pour assurer la qualité des cultures cellulaires. Bioréacteurs émergé dans les années 1950 et 1960, et ont depuis évolué pour fournir des moyens efficaces de production de milliards de cellules dans une quantité de temps exceptionnellement bref 19. Il existe de nombreux types de bioréacteurs qui pourraient être utilisés pour augmenter considérablement le nombre de H. cellules vitripennis produits en même temps et le processus de développement de ce type de système de production, il faudrait le développement d'une méthode pour traiter des cellules pour empêcher cisaillement vientm la croissance des surfaces dans des bioréacteurs.
Croissance continue réussie de lignées cellulaires est cruciale pour HoCV-01 de réplication et une fois atteint, peut être utilisé pour traiter la question de combien de virus est nécessaire pour quantifiable dans la réplication in vitro et combien de temps devrait être permis au virus de rester dans les cultures. Une nette corrélation a été trouvée entre la quantité de la charge virale initiale reçue par les cellules et la durée de particules virales de temps ont été autorisés à incuber dans les cellules. Plus la charge virale reçue, la partie inférieure à l'exigence de temps de la mort cellulaire, ce qui indique la réplication virale rapide. Cependant, dans tous les traitements nombre de cellules deviennent inférieures à la valeur seuil de 25 x 10 4 cellules / ml à environ 144 heures après l'infection, ce qui démontre un seuil de survie de culture cellulaire globale. Les résultats montrent que de grandes quantités de virus peuvent être produits si rapidement de grandes quantités de virus sont facilement disponibles pour l'infection initiale, ou qui augelon quantités de virus peuvent être produites sur une longue période de temps avec une dose initiale plus faible. La variabilité de la relation entre la concentration et le temps des facteurs permet une certaine flexibilité dans les options de production pour des études de plus grande envergure avec un temps d'extraction virale optimale de 72-96 heures post-infection.
Utilisation de cultures de cellules pour des études virales dépend de la capacité à détecter le virus de la cible et de quantifier les résultats de l'étude. Une méthode fiable pour cela est d'utiliser la PCR pour vérifier la présence de séquences d'ARN viral dans les échantillons expérimentaux. L'analyse des valeurs de Ct à partir des données de PCR dans cette étude ne donne pas de réponse claire à ce que le temps d'extraction optimale des virus serait; Cependant, le manque de temps d'extraction définitive n'est pas indicative d'une incapacité à reproduire HoCV-01 in vitro, mais de la nature sensible des études virales. Les comptages de cellules à l'aide de bleu trypan ne prêtent à une vision plus claire de temps d'extraction optimales, mais ne sont nullement une definitive réponse. Données de la mort cellulaire montre que les charges virales élevées conduisent à fortement diminué la capacité de survie des cellules après 72 heures, indiquant que l'extraction virale entre 48 h et 72 h post-infection peut être idéale pour réduire la dégradation cellulaire de particules virales comme les cellules de la culture commencent à mourir exponentielle. temps d'extraction à des charges virales initiales plus faibles sont plus ambigus, mais avec des baisses spectaculaires de la survie des cellules après 144 h, on peut supposer que le temps d'extraction optimale serait de 24 - 48 heures avant à ce point de temps. Détermination du temps optimal d'extraction virale est essentielle à la production efficace de biopesticides pour les utiliser contre H. vitripennis infestations et cette étude a franchi une étape importante vers la détermination de ces temps.
La microscopie est un outil essentiel pour l'analyse de culture cellulaire et cette étude est la première à utiliser la microscopie confocale avec H. vitripennis cellules. protéines d'imagerie augmentation de fixation ou le déclin et l'abondance desnoyaux de cellules est la première étape vers des études plus approfondies sur l'activité intracellulaire de HoCV-01 in vitro. Tout au long de cette étude, les cultures cellulaires ont été maintenues sans altérations morphologiques visibles. Après chaque passage cellulaire subséquente, la croissance de fibroblastes normaux a été observée, suivie par la formation d'une monocouche. Cellules sont restées uniforme dans la forme et la taille. Cependant, lorsque les cultures infectées ont été imagées par microscopie à foyer commun, la baisse de la morphologie cellulaire ont été observées, en particulier au point de temps de 72 heures, avec deux charges virales initiales élevées et basses. De petites structures de trous comme on pouvait voir la surface des cellules, peut-être en raison de la mort cellulaire et d'expulsion de matériau intracellulaire. Les cellules sur la surface du ballon et, éventuellement, échaudés ont commencé à se détacher de la surface. Les implications de cette première utilisation de la microscopie à résolution plus élevée en corrélation avec les résultats observés dans l'analyse de la capacité de survie de cellules et donne lieu à d'autres utilisations possibles pour les études virales accrues. Avancée kmtechniques croscopy pourraient être utilisés pour ses capacités maximales si le développement d'anticorps pour HoCV-01 a été réalisée. Anticorps pour le virus ne serait pas seulement permettre la visualisation de fonctionnement intercellulaires des particules virales, mais pourraient également aider à déterminer les taux de prolifération et même des extractions plus précises fois.
Le processus de renforcement des méthodes de production développées dans cette étude pour produire un agent de lutte biologique efficace à un point où les grandes biomasses de cellules sont récoltées pour le virus et ensuite appliqués à des champs est surtout une question de coût. Les coûts initiaux de mise en place de grands systèmes à grande échelle est élevé et de nombreux facteurs doivent être pris en considération, tels que: la rentabilité, la cellule et la productivité de virus, de la culture cellulaire coûts de moyennes, le taux d'application, à l'échelle de la production et des coûts de production par lots de 12. Malgré le coût initial, les compromis possibles de rémunération valent l'investissement. En utilisant des techniques de culture cellulaire, en baisse de questions d'épuration des cours d'eau sont considérablement réduits soitcauser la possibilité d'intestin microbe et autres virus trouvés dans l'ensemble de un insecte corps sont considérablement réduits, ainsi que les coûts des installations pour l'entretien des insectes vivants et d'élevage.
Avec la culture cellulaire déjà utilisé pour la production de protéines, les biopesticides et d'autres produits pharmaceutiques, la valeur économique de ce domaine de recherche est en augmentation. Pour la production à grande échelle de biopesticides dans l'agriculture, il serait avantageux d'essayer une étude similaire à celle terminé ici, mais en utilisant un système de culture de cellules plus important. Bioréacteurs et la nouvelle méthodologie des systèmes de culture de cellules de la matrice 3D permettent une production accrue de cellules et, dans le même rapport, de plus grands volumes de production virale 20. Alors que le coût initial de construction de systèmes à grande échelle est élevé, le gain dans la quantité de produit pouvant être produit a le potentiel d'être encore plus grande. Un domaine d'étude qui grandement prêter à la poursuite des études de transmission à grande échelle des systèmes described-dessus est la conception anticorps. conception d'anticorps a été utilisé de plus en plus dans les études virales pour des maladies comme le VIH et l'hépatite C. S'il est un processus long et détaillé, pour HoCV-01, elle permettrait de visualisation de l'activité virale in vitro par microscopie confocale et pourrait conduire à d'autres domaines d'investigation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
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