Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Homalodisca vitripennis Zellen und HoCV-1 in vitro zu propagieren. Medium wurde von HoCV-1-positiven Kulturen entfernt und RNA extrahiert alle 24 h für 168 Stunden. Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Färbung quantifiziert. Gesamtvirus-Partikel wurden nach der Infektion extrahiert. Extrahierte RNA wurde durch qRT-PCR quantifiziert.
Abstract
Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis) ist ein hoch vagile und polyphagen Insekten gesamten Südwesten der Vereinigten Staaten gefunden. Diese Insekten sind die vorherrschenden Vektoren Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), eine Xylem-Bakterium, das begrenzt die Erreger der Pierce-Krankheit (PD) der Weinrebe ist. Pierce-Krankheit ist wirtschaftlich schädlich; damit, H. vitripennis haben ein Ziel für Erreger-Management-Strategien geworden. Ein dicistrovirus als Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) identifiziert, mit einer erhöhten Mortalität in Verbindung gebracht H. vitripennis Populationen. Da eine Wirtszelle für HoCV-01-Replikation benötigt, stellt der Zellkultur eine gleichförmige Umgebung für die gezielte Replikation logistisch und Biopestizid Produktion wirtschaftlich wertvoll ist. In dieser Studie wurde ein System für großflächige Ausbreitung von H. vitripennis Zellen durch Gewebekultur entwickelt, providing einen viralen Replikationsmechanismus. HoCV-01 wurde aus den ganzen Körper Insekten extrahiert und verwendet, um kultivierte H. inokulieren vitripennis Zellen auf verschiedenen Ebenen. Das Kulturmedium wurde alle 24 h für 168 h, RNA extrahiert und mit qRT-PCR analysiert entfernt. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und gezählt, um die Überlebensfähigkeit Zelle quantifizieren mittels Lichtmikroskopie. Ganzvirus-Partikel wurden bis zu 96 Stunden nach der Infektion, die das bestimmt zu sein, bevor die Gesamtzellkultur Zusammenbruch aufgetreten Zeitpunkt war extrahiert. Die Zellen wurden auch Fluoreszenzfärbung unterzogen und unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um virale Aktivität auf F-Actin-Bindung und Kerne Integrität zu untersuchen. Das Fazit dieser Studie ist, dass H. vitripennis Zellen, die kultiviert und zur Massenproduktion von HoCV-01 auf einen geeigneten Pegel zur Herstellung eines Biopestizids ermöglichen.
Introduction
Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis Germar 1821) hat als vorherrschende Vektor Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) in Nordamerika 1 identifiziert worden, die Erreger der Pierce-Krankheit der Weinrebe (PD). Insektenpopulation Management hat sich schnell zum Mittelpunkt der Forschung werden in Kalifornien und über den Süden der Vereinigten Staaten gegen diese verheerende Problem für den Weinbau Industrie. Ein positiv Sinn, Einzelstrang-RNA-Virus aus der Familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) bei Wild H. identifiziert vitripennis Bevölkerung und gezeigt, dass die Sterblichkeit in diesen Bevölkerungsgruppen 2-4 zu erhöhen, bei gleichzeitiger Senkung des Insekts Widerstand gegen Insektizide.
Entwicklung von Methoden, um effektiv hinten infiziert H. vitripennis in einer Laborumgebung Erwachsenenalter schwierig gewesen, weil
Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, eine hohe Konzentration von HoCV-01 eignet sich für den Einsatz als biologische Bekämpfungsmittel zu produzieren. Virale Replikation erfordert eine lebende Zelle, weshalb erfolgreich zu kultivieren und zu optimieren H. vitripennis Kulturen ist von entscheidender Bedeutung für den Fortschritt der Herstellung eine gewinnbringende Virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zellkultur
HINWEIS: Homalodisca vitripennis von der Dr. Wayne Hunter Labor an der USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) etablierten Zelllinien wurden verwendet, um einem Labor stock gemischten Zellstadien einschließlich Anfangs Fibroblasten und Monoschichten zu initiieren.
- Führen Sie die folgenden Verfahren in einer sterilen Laborumgebung in einem Temperaturbereich von 20-24 ° C mit 25 cm 2 Kulturflaschen gehalten.
- Kultivieren und Kulturen mit H2G + Leafhopper Medium, eine modifizierte WH2 Honigbiene Medien 10 (Tabelle 1) zu halten in 25 cm 2 Zellkulturflaschen.
- Kulturkolben inkubieren bei 24 ° C mit ~ 53% Luftfeuchtigkeit.
- Verwenden Sie einen umgekehrten Mikroskop bei einer Gesamtvergrößerung (TM) von 100X zu Kultur Wachstum zu überwachen, zB auf eventuelle abnorme Zellwachstum überwachen für eventuelle Verunreinigungen und prüfen Wachstum Fortschritte in der Sackgassetur Oberfläche.
- Führen Sie eine vollständige Mediumwechsel (~ 4 ml Kulturmedium pro Kolben) alle 7 - 10 Tagen, ohne die Kulturfläche zu stören.
- Kulturen passieren, wenn das Kulturfläche von etwa 80% des Zellwachstums (konfluent) unter Verwendung von 0,25% Trypsin enthält, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um Zellen zu dissoziieren bedeckt. Fügen ~ 2 - 3 ml Trypsin zu jeder Kulturflasche und setzen Kultur (en) für das Enzym für kurze Zeit (5 - 10 min), um eine vollständige Zell-Dissoziation zu erzielen.
- Füge eine gleiche Menge an frischem Medium zu dem Kulturgefäß (en) (~ 2 - 3 ml) auf die Enzymaktivität zu stoppen und übertragen die gesamte Lösung in ein konisches Rohr zum Zentrifugieren.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C für 6 min bei 350 x g beträgt.
- Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und fügen ~ 8 ml frisches Medium zu jedem Röhrchen. Sanft homogenisieren Zellen mit einer Pipette.
- Split Kulturen bei einem 1: 2-Verhältnis von 25 cm 2-Kolben (ca. 4 ml Zell solutiauf pro Kolben) und lassen frisch geleitet Kulturen ungestört für 48 Stunden, sodass die Zellen in Suspension zu fest an der Oberfläche des Kolbens verbinden.
HINWEIS: Die Kultivierung der Zellen in 48-Well-Gewebekulturplatten mit sterilen mit einer Wachstumsfläche von 1 cm 2 ist ebenfalls möglich, und sie können in der gleichen Weise wie Kulturflaschen mit einer Verringerung des Volumens des Kulturmediums auf ~ 250 ul gehalten werden.
2. Ganzvirus-Extraktion
- Homogenisieren ganzen Körper des Virus positive H. vitripennis in Phosphatpuffer, pH ~ 7,2, mit 0,02% Natrium-Trihydrat (DETCA) durch Vortexen für ~ 10 Sekunden-Intervallen, bis es keine weitere große Klumpen von Gewebe vorliegen. Extrahieren Virus durch Super Zentrifugation bei 124.500 xg für 4 h bei 4 ° C oder 22.000 × g für 16 h bei 4 ° C ist. Wenn ein Niederschlag bildet an der Spitze, entfernen Sie sie mit einem sterilen Wattestäbchen 11.
- Überstand verwerfen.
- Sammeln Sie die Pellet-undAuflösen mit 5 ml 10 mM Phosphatpuffer (kein DETCA), pH ~ 7,2, die 0,4% Na-Desoxycholsäure und 4% Polyethylenglykol Hexadecylether (Brij 52).
- Um das Pellet gut mischen, entfernen Sie das Pellet von der Seite der Röhre und zerquetschen, bis in der Lösung, wenn nötig.
- Noch 10 mM Phosphat-Puffer in ~ 5 ml-Schritten zu helfen, das Pellet in Lösung gehen, wenn nötig und kombinieren in 2 Röhren 11.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 g für 15 min 11.
- Entfernen Sie den Überstand und die heiße Lösung durch einen 0,45-um-Filter, und das Filtrat in großen Sammelrohr 11.
- Übertragungs Filtrat einer Dialysemembran mit einer Molekulargewichtstrenngrenze (MWCO) von 3,5 kD, mit kleinen Mengen von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) nicht enthält, wenn nötig DETCA 11.
- Platzieren der Dialysemembran in ein großes Becherglas mit ddH 2 O bei 4 ° C gefüllt. Ändern Sie die ddH2O jede Stunde foder 5 - 6 Stunden, bis sich ein weißer Niederschlag bildet in der Membran 11.
- Sammeln des gereinigten Virus in der Membran und unterziehen die 100% Virus-Lösung zu einer 10-fachen Verdünnungsreihe durch Zugabe von 10 ul der Lösung zu 90 ul ddH 2 O. Anschließend weitere 90 ul ddH2O hinzufügen 10 ul der Verdünnung bis zu einer Verdünnung von 1: 100.000.
- Shop-Virus-Lösung bei -80 ° C.
3. Virusreplikation
- Samenzellen in 48-Well-Kulturplatten wachsen, bis alle Zeilen Zellwachstum beträgt 80% konfluent (etwa 72 Stunden nach der Pass, wenn Zellen mit einer durchschnittlichen Rate wächst).
- Impfen jede Zeile von Zellen mit der Serien verdünnten Virus einmal das Zellwachstum erreicht Konfluenz, dh eine Zeile einer Verdünnung von 1:10, eine Zeile einer 1: 100 Verdünnung, usw., mit Ausnahme der oberen Reihe. Verwenden Sie die obere Reihe als Kontrolle und fügen Sie 10 ul ddH 2 O in jede Vertiefung als Lautstärkeregler.
- Um eine Ausgangsbasis erhoben Zellkonzentration für den Vergleich mit experimentellen Zellzahl vor der ersten Impfung aller Brunnen in den Kulturen mit dem Virus zu schaffen, distanzieren und zählen Sie die erste gut jeder Zeile.
- Überwachen Kulturplatten alle 24 h nach der Virusimpfung für eine Farbänderung in dem Medium, das eine pH-Veränderung und Änderung in der Zellmorphologie.
- Bild einer Spalte der Testplatte zu jedem Zeitpunkt, mit einem inversen Mikroskop bei 100-facher TM.
- Entfernen Sie alle Medium aus der Spalte, die bei jedem 24-Stunden-Zeitpunkt abgebildet wurde und speichern sie kurzfristig bei -20 ° C für die RNA-Extraktion und Quantifizierung viraler oder langfristig bei -80 ° C.
- Distanzieren Zellen aus den Vertiefungen nach der Entfernung des Mediums, wie zuvor beschrieben, in den Schritten 1.6 - 1.9 mit nur ~ 250 ul 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität und ~ 250 ul frisches Medium zu stoppen zum Resuspendieren der Zell Pellet.
- Fügen Sie 10 ul von 0,4% Trypanblau-Färbung zu jedem Röhrchen mit Zellen zu Zellzahlen nach der Zell Dissoziation für jeden Zeitraum von 24 h über eine Woche durchzuführen. Ermöglichen Fleck für 10 min, bevor Zellzahlen zu sitzen.
- Führen Zellzahlen innerhalb 1 h der Exposition gegenüber Flecken oder lebensfähige Zellen zu färben beginnt und nicht lebensfähigen Zellen Aufnahme.
- Langsam 10 ul der gefärbten Zelllösung zu jeder Seite eines Standard-Hämozytometer unter Verwendung einer Mikropipette. Lassen Sie die Lösung durch Kapillarwirkung aufgenommen werden, um Luftblasen zu vermeiden.
- Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen (nicht fleckig) Zellen auf beiden Seiten der Zählkammer (das Äquivalent von 4 zählt der 16 Plätze in der Zählkammer). Führen Zellzahlen für jede Vertiefung der Spalte, die entfernt wurde.
- Der Mittelwert der Zellzahlen aus jeder Spalte und verwenden Sie die folgende Formel, um die Gesamtzellzahl-Nummer zu erhalten: (Anzahl der Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor = Anzahl der Zellen x 10
4. Virus Extraktion aus Zellkultur
- Entfernen behandelt H. vitripennis Zellen aus Kulturflaschen wie zuvor in den Schritten 1.6 beschrieben - 1.8, mit nur ~ 250 ul von 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität zu stoppen.
- Überstand verwerfen.
- Auszug Virus von Kulturzellen nach dem Protokoll zuvor in Schritten 2.3 - 2.8.
5. RNA-Extraktion
- Extrahieren von RNA aus Proben, die während jedes Medium eine Woche Virus Versuch unter Verwendung eines Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion für flüssige Proben nach Herstellerprotokoll, gesammelt.
- Speicher extrahierten Proben bei -80 ° C.
6. RT-PCR
- Virus etablieren Standards für RT-PCR, indem Sie traditionelle PCR unter Verwendung derPrimerpaar HoCV RT-PCR-Primer 1 (vorwärts 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-Reverse ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3'), mit einem Virus zu isolieren, aus ganzen Körper H. vitripennis.
- Gegenstand PCR-Produkts einer Elektrophorese für 60 min in einer 2% igen Agarose-Gel, enthaltend 0,1% Ethidiumbromid-Gel bei 120 V.
- Auszuschneiden die Bands aus dem Gel und reinigt mit einem Gel-Extraktions-Kits nach dem Protokoll des Herstellers.
- Pool alle ausgeschnitten und aufgereinigt Produkt weiter zu reinigen und durch Grundethanolfällung. Zugeben und das Fällungsprodukt in etwa 30 ul Tris EDTA (TE), um die Gesamtprobenkonzentration zu erhöhen.
- Quantifizierung der Ebene der cDNA in gepoolten Proben über Spektrophotometrie mit 260/230 Wellenlänge Einstellungen für Nukleinsäure-Nachweis.
- Führen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe des gereinigten Probe von 57 ng / ul bis 57 ag / ul (10 -18). Führen die Verdünnungs ähnlich der beschriebenen in 2,8 Anpassungen für den Unterschied in der Konzentration Anforderungen gestellt.
- Bestimmen Nachweisgrenzen der Verdünnungsreihe, indem qRT-PCR unter Verwendung eines qRT-PCR-Kit mit zuverlässige Quantifizierung von Low-Fülle-Transkripte.
HINWEIS: Viral-Konzentrationen von weniger als 5 x 10 -3 Kopien sind nicht nachweisbar. - Extrahieren von RNA aus Versuchsproben, wie zuvor in Schritt 5.1 beschrieben und quantifiziert unter Verwendung von Spektrophotometrie analysiert.
- Normalisieren alle extrahierten Proben bis 5 ng / ul mit Nuklease freiem Wasser.
- Führen qRT-PCR bei allen Proben, in Dubletten, 25 ul Reaktionen mit Hilfe eines Ein-Schritt-qRT-PCR-Kit mit der Fähigkeit zu einer geringen Kopienzahl spüren wie folgt: 50 ° C zu halten für 10 min; 95 ° C halten für 5 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec; schmelzen 50-99 ° C für 5 s auf jedem Schritt.
- Machen Sie den Master-Mix, so dass jeder Reaktionsgemisch enthält 12,5 ul 1x Master-Mix, 1,0 ul (0,3 uM) von Vorwärts-Primer, 1,0 ul (0,3 uM) der Reverse-Primer, 0,25 ul der reversen Transkriptase und variable Mengen an Template auf Basis von Standardisierung Werte.
- Bringen die Gesamtreaktionsvolumen auf 25 ul mit RNase freiem Wasser.
- Gehören fünf Standard-Konzentrationen in jedem PCR-Lauf mit den folgenden Kopienzahl: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 und 5 x 10 -2 Exemplaren. Die Schwelle für jeden Durchgang, um nur unter einem Fluoreszenz von -2,5 bis 10x Rauschen während frühen Erwerb zu Beginn jedes Durchlaufs zu verringern.
7. konfokale Mikroskopie
- Wachsen Homalodisca vitripennis Zellen in einem zwölf Well-Platte mit Deckgläschen Mess 18 mm Durchmesser in jede Vertiefung.
- Beimpfen von einer Spalte auf der Platte alle 24 Stunden für einen Zeitraum von vier Tagen, wenn eine Monoschicht erreicht wird. Sicherzustellen, dass jedes cPALTE auch eine Steuer, eine niedrige Virusverdünnung (1:10) gut und eine hohe Virusverdünnung (1: 100.000) gut. Verwenden von Schritt 2.8 erhalten Virus-Lösungen.
- Entfernen Sie alle Medien auf dem fünften Tag und waschen die Zellen zweimal mit 1x PBS (pH 7,4).
- Fixierung der Zellen mit kaltem 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 30 min.
- Gib 500 ul 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu den Zellen und waschen sie für 10 min bei RT auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. Dreimal Waschen Sie die Zellen.
- Gib 500 ul 0,1% Triton X-100 zu den Zellen, um sie zu permeabilisieren. Lassen Sie sich für 10 min bei RT.
- Wasche die Zellen erneut, wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben.
- Gib 500 ul einer 5% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung zu den Zellen bei RT blockieren. Lassen Sie sitzen für 2 Stunden und dann zu entfernen.
- Verdünnen Lager Rhodamin rot-Phalloidin (RCP) 1: 250 in 1x PBS mit 5% BSA und 250 ul der Verdünnung auf jeweils gut Färbung für F-Aktin.
- Abdeckplatte aus Aluminium fÖl, um den Farbstoff aus Bleich verhindern und Inkubation Zellen bei 4 ° CO / N.
- Entfernen Sie die RCP nach 12 h Inkubation und ersetzen Sie es mit 250 ul 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (250 ug / ml) in 1x PBS mit 5% BSA, um die Kerne der Zellen zu färben .
- Inkubieren der Zellen mit DAPI bei RT für 1 Stunde.
- Waschen Zellen dreimal mit 1x PBS wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben.
- Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser aus den Vertiefungen und montieren auf Objektträger mit einer Montage Medien mit einer Anti-Fade Reagenz.
- Die Objektträger trocknen in lichtdichten Kästen, bis unter dem konfokalen Mikroskop betrachtet. Ansicht Präparate so bald wie möglich als Farbstoffe schnell verblassen.
- Bild gefärbten Zellen mit einem konfokalen System mit einem Mikroskop, das eine 63X (Öl) Plan-apochromate Objektiv ausgestattet.
- Stellen Sie die Laserwellenlängen um 543 ± 10 nm Anregung und 575 ± 10 nm Emissions für Rhoadmine rot-conjucated Phalloidin, Und 369 ± 10 nm Anregung und 450 ± 30 nm Emissions für DAPI.
- Identische Verstärkung und Offset-Einstellungen für den Detektor, um alle Bilder zu erhalten.
- Prozessbilder mit Hilfe geeigneter Software für die Bildverarbeitung und Sortierung und Import gewünschten Bilder in eine Bildverwaltungssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zellwachstums wurde innerhalb von 48 h Durchgang in kleinen und großen Kulturflaschen aus Primärkulturen und setzte Passagen gesehen. Fibroblasten-Wachstum und die Entwicklung wurde auch innerhalb dieses Zeitrahmens beobachtet. Wenn neu ausgesät Kolben wurden vor 48 Stunden gestört, gab es eine sichtbare Rückgang der Zellhaftung, was zu langsameren wachsenden Kulturen und manchmal keine Bindung oder das Wachstum überhaupt. Zellen wurden etwa 80% konfluente innerhalb einer Woche nach der Übergabe und eine Monoschicht gebildet wird in 10-14 Tagen (Abbildung 1). Primärkulturen, die zu Beginn der Studie wurden kultiviert, haben mehr als 30 Zellpassagen ohne morphologische Verschlechterung oder Gesamtzelllebensfähigkeit Rückgang überlebt.
Zellwachstums wurde innerhalb von 48 h Passage aus Flaschen, Platten gesehen. Monoschichtbildung wurde in einer kürzeren Zeitdauer erreicht wird, etwa 5-6 Tage, da es eine kleinere Wachstumsoberfläche. Infizierten Kulturen fotografiert eint 100X unter dem Lichtmikroskop zeigte Anzeichen von rückläufigen Zellform Integrität. 48 h nach der Infektion, was zu sein scheinen große Löcher auf der Oberfläche der Zellen vorhanden waren. Über Kulturflaschen, Zellen geschrumpft und etwa 72-96 Stunden, nachdem er mit nicht-verwässerten HoCV-01 (Abbildung 2) infiziert losgelöst von der Kulturfläche.
Bedeuten Lebendzellzahl zur Steuerung und experimentellen Proben wurden berechnet und aufgetragen, um Unterschiede in der Abundanz von lebenden Zellen zwischen Viruslast über die Zeit (3) darzustellen. Eine konsequente Erhöhung der lebenden Zellen in der Kontrollgruppe vorhanden ist, was anzeigt, gesunden Zellen. Vergleichsweise hatten alle Behandlungsgruppen einen deutlichen Rückgang bei der Zahl der im Laufe der Zeit lebenden Zellen vorhanden. Die höheren Virusbehandlungsgruppen zeigen eine viel deutlichere Rückgang der Kultur Gesundheit mit einem starken Rückgang in lebenden Zellen zwischen 48-72 Stunden, während die unteren Virusgruppen langsam abnehmen, bis Abwurf rund 144 Stunden. Ein Zwei-Wege-ANOVA with Bonferroni Post-hoc-Analyse wurde verwendet, um die Unterschiede in der Zellkultur Abtötungsraten von HoCV-01 testen, basierend auf Live-Zellzahlen in jeder Behandlungsgruppe im Vergleich zu jedem Zeitpunkt in der Studie, als auch zwischen den Gruppen. Die Zwei-Wege-Varianzanalyse einen signifikanten Haupteffekt der Zeitfaktor, F (7, 432) = 82,5, p <0,0001, was darauf hindeutet, dass die Länge der Zeit Kulturen wurden einer Behandlung beeinflußt Kultur Langlebigkeit ausgesetzt. Die Wirkung von der Art der Behandlung Kulturen erhielten, war signifikant und F (5, 432) = 170,6, p <0,0001, was anzeigt, daß die Menge der Viruslast eine Kultur anfänglich empfängt betrifft Kultur überleben. Ein signifikanter Effekt auf die Wechselwirkung zwischen der Zeitfaktor und Behandlungsfaktor ist auch vorhanden, F (35, 432) = 17.63, p <0,0001, und betont, dass je höher die Viruslast erhielt den kürzeren Zeit benötigt, um Kultur Fitness zu reduzieren und umgekehrt je niedriger die Viruslast, dielängere Zeit für den gleichen Effekt erforderlich ist. Bonferroni Post-hoc-Tests zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen und Kontroll, was einen bemerkenswerten Dosis-Antwort.
Überlebenswahrscheinlichkeit von Zellen mit höheren Virus Behandlungen geimpft war niedriger als von Kaplan-Meier-Kurven (Abbildung 4) getestet, in Korrelation zu den Schlussfolgerungen aus den Mittel Live-Zellzahl-Analysen erstellt. Es gab eine 100% ige Überlebensrate für die Kontrolle oder nicht-infizierten Zellen. Zellen an den hohen Virus Behandlungen ausgesetzt hatte einen deutlichen Rückgang der Überlebenswahrscheinlichkeit im Laufe der Zeit, während niedrigere Virus Behandlungen haben eine größere Überlebenswahrscheinlichkeit bis zum 144 h, dann ein Rückgang der Überlebenswahrscheinlichkeit vorhanden ist. Cox-Proportional-Hazards-Modell-Analyse nicht signifikant war, die Behandlung coeff = 0,8812 (95% CI [0,76, 1,02]), p> 0,05. Obwohl nicht signifikant, die Daten nahe, dass Zellen, die Virus ausgesetzt sind 88% eher zu niedrigeren Überlebensraten im Laufe der Zeit zeigen.
Für jeden qRT-PCR-Lauf, gefahren die höheren Virus Normen früher als geringer Virus Standards und experimentellen Proben. Von jedem Versuch replizieren Ct-Werte wurden unter Verwendung eines Zwei-Wege-ANOVA, um Unterschiede in der Abundanz von HoCV-01 RNA in der vorliegenden experimentellen Proben zu testen und Werte, die mehreren Steuerwerten zu vergleichen analysiert. Die Zwei-Wege-Varianzanalyse zeigte keinen signifikanten Haupteffekt der Zeitfaktor, F (7, 289) = 0,38, p> 0,05, oder in der Interaktion zwischen der Zeit und den Behandlungsgruppen, F (63, 289) = 0.14, p > 0,05. Eine signifikante Hauptwirkung zwischen den Behandlungsgruppen, F (9, 289) = 135,7, p <0,0001, was anzeigt, dass Virusmenge zunächst auf Zellkultur eingeführt beeinflußt die Menge der viralen RNA nachgewiesen wurde beobachtet. Bonferroni Post-hoc-Tests wurden durchgeführt und zeigen signifikante Wechselwirkungen zwischen den Behandlungsgruppen und Kontrollmaßnahmen, aber keine signifikanten Wechselwirkungen zwischen den Behandlungs gRUPPEN allein, was keine messbare Dosis Antwort.
Unterschiede in der Zellmorphologie von gesunden und HoCV-01 infiziert H. vitripennis Zellen bei 24 und 72 Stunden wurden unter Fluoreszenz gesehen. Der Rückgang der Anzahl der vorhandenen Kerne sowie die unförmigen Aussehen der F-Aktin in den Zellen zu HoCV-01 ausgesetzt, im Vergleich mit den Kontrollen zeigen, dass das Virus hat einen großen Einfluss auf die Kultur der Gesundheit. Zellen der höheren 1.10 virale Belastung ausgesetzt waren, zeigten mehr Schwierigkeiten als die Zellen auf der unteren viralen Behandlung ausgesetzt. Kontrollzellen erscheinen häufiger und normale Morphologie zwischen den beiden Zeitpunkten (5) aufweisen.
| Grace Insect Medium (ergänzt 1x) | 210 ml |
| 0,06 M L-Histidin-Monohydrat-Lösung (pH = 6,5) | 290 ml |
| Medium 199 (10x) | 10 ml |
| Medium 1066 (1x) | 17 ml |
| Hanks Balanced Salts (1x) | 33 ml |
| L-Glutamin (100x) | 1,5 ml |
| MEM, Aminosäuremischung (50x) | 1,5 ml |
| 1 M MgCl Lösung | 6 ml |
| Pen-Strep (w / Glutamin) | 2,5 ml / 500 ml |
| Nystatin | 1,0 ml / 500 ml |
| Gentamycin | 1,5 ml / 500 ml |
| Traubenzucker | 1,8 g |
| Fötales Rinderserum | 10% des Endvolumens |
Tabelle 1. H2G + leafhopper Mittelkomponenten.
Abbildung 1. Bilder von H. vitripennis cell Wachstum in vitro bei 100X TM eingefangen. (A) Zellen, die 2 Tage (48 Stunden) nach der Passage und Fibroblasten-Anbringung Entwicklung aufweisen. (BE) Zellen vier, sechs, acht und zehn Tage nach dem Durchgang weiterhin in Kulturfläche wachsen. (F) Monoschichtbildung auftritt ~ 10- 14 Tage. Maßstabsbalken:. 100 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Infizierte H. vitripennis Zellen bei 100-facher TM abgebildet, um morphologische Veränderungen zu erfassen. (A) Fibroblasten-Wachstums vor der Impfung. (B) Zellen 24 Stunden nach der Infektion. (C) Zellen 48 Stunden nach der Infektion. (D) 96 Stunden nach der Infektion Zellen habenmeist von der Kulturfläche abgelöst und Medium geworden ist bewölkt. Maßstabsbalken:. 100 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Balkendiagramm mit Mittelwert Live-Zellzahlen für Versuchsproben. Mittlere Lebendzellzahlen wurden für experimentelle Proben berechnet, indem die Viruslast für jeden Tag erhalten während der Versuchsdauer und werden hier mit einer Standardabweichung Balken angezeigt. Mittlere Zellzahlen zeigen eine signifikante Abnahme in lebenden Zellen ~ 72 Stunden nach der Infektion mit hoher Viruslast und einer signifikanten Abnahme der Lebendzellzahl bei ~ 144 Stunden nach der Infektion mit niedriger Viruslast. BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von fünf verschiedenen HoCV-01 Behandlungen im Vergleich zu einer nicht-infizierten Kontroll in H. vitripennis Zellkulturen. Kontrollkulturen erhalten eine 100% ige Überlebensrate im Vergleich zu den fünf Behandlungsgruppen. Die niedrigste Überlebenswahrscheinlichkeit wurde in der hohen Behandlungsgruppe gesehen und alle Behandlungsgruppen fahren in Richtung Null Überlebenswahrscheinlichkeit bei 168 h bei n = 10. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figubei 24 Stunden Abständen 100.000 Konzentrationen. Wieder 5. konfokale Bilder von Kontrolle und infizierten Zellen H.vitripennis Homalodisca vitripennis Zellen wurden mit Serien infiziert verdünnt HoCV-01 in 1:10 und 1. Die Zellen wurden mit Rhodamin-Phalloidin und DAPI Flecken behandelt, um F-Actin und Kerne innerhalb der Kulturen sichtbar zu machen. Konfokalen Bilder wurden bei 63X gefangen genommen und zeigen eine Pause in der Zellmorphologie bei 72 h bei niedrigen und hohen Virusverdünnungen. Maßstabsbalken:. 1 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Steigende Besorgnis über den Zustrom von invasiven landwirtschaftlichen Arten haben zu einer erhöhten Nachfrage nach neuen Methoden, um gegen neue Schädlinge und Krankheitserreger zur Wehr zu führen. Ein Schwerpunkt der Krankheitsprävention und-Management umfasst die Verwaltung von Vektoren und Krankheitserreger war das primäre Ziel dieser Studie. Wirtschaft spielen eine wichtige Rolle bei der Entscheidung, diese Art von Erreger zu Biopestizid Vektoren in der Landwirtschaft verwalten, weil die praktische Anwendung, um große Mengen über große Flächen, aber zu niedrigen Kosten produzieren 12 sein muss. Die Praxis der Verwendung von Zellkultur für Forschung und Entwicklung ist zunehmend üblich geworden, und als solche sind die signifikanten Auswirkungen dieser Studie. Erkennung wirtschaftlich vertretbarer integrierten Schädlingsbekämpfung (IPM) Strategien ist der Schlüssel zur erfolgreichen Fortsetzung der landwirtschaftlichen Produktion weltweit und die Ergebnisse dieser Studie dazu beitragen, bei der Verbesserung der IPM Strategien und Verringerung des Auftretens von PD der Weinrebe Fortschritt.
H. vitripennis Zellkulturen wurden vermehrt und seit über einem Jahr ohne sichtbare morphologische Verschlechterung gehalten. Passage Zahlen drastisch auf die Ergebnisse der in-vitro-Untersuchungen in Säugerzellen durch Veränderung des Zellstoffwechsels und Wachstumsmerkmalen 13. Als Zellen replizieren in vivo und in vitro, Telomere verkürzen mit jeder Runde der Replikation der Zellen und schließlich eine kritische Grenze, bei der Telomere zu kurz werden und induzieren zelluläre Seneszenz 14. Wenn schwere Verkürzung der Telomere auftritt, genetische Instabilität und schließlich Krise oder massiven Zelltod auftritt 15. Aufgrund dieses Phänomens, Kulturen nur selten über 50 subcultivations oder ein Jahr zu überleben, als das Hayflick Limit, basierend auf den folgenden Kriterien: Eigentums Sex Chromatin, histotypical Differenzierung, inadaptability zu Kultur, nicht-malignen Eigenschaften in vivo, Finite Anbaugrenze aussetzen, Ähnlich wie Zellmorphologie auf Primärgewebe, im Vergleich zu Zelllinien, die Erhaltung der Coxsackie A9-Rezeptor-Substanz und Leichtigkeit, mit der Stämme konnte entwickelt werden 16 erhöhte Säureproduktion. Die möglichen Komplikationen der Passage Zahlen wurden während der Dauer der Studie darauf hinweist, dass dieses Verfahren der Zelllinie in der Lage, kontinuierliche Vermehrung der Produktion über längere Zeit beobachtet. Weil Nutzung der Zellkultur über Live-Insekten Aufzucht oder andere teure und komplizierte Herstellungsverfahren wird zunehmend alltäglich in vielen Disziplinen, die Langlebigkeit dieser Art der Zelllinie hat viele praktische Anwendungen. Wenn sie richtig gepflegt, kann ein einzelner Primärzelllinie für mehrere Runden von Virusproduktion verwendet werden.
Die beiden wichtigsten Faktoren für eine erfolgreiche langfristige Wartung dieser Zellen waren Störung Zeit für frisch ausgesät Kulturen und geeigneten Medium Vorbereitung. Kulturen, die für die ersten 4 unberührt8 Stunden nach dem Durchgang zeigte einen deutlichen Anstieg der grenzüberKolben Wachstum im Vergleich zu denen, die in diesem ersten Fenster verschoben wurden. Wenn ungestört, die rasche Vermehrung von Zellen erreicht Monoschichten in so wenig wie zehn Tage nach der Passage in Kulturflaschen. Medium Vorbereitung war so wichtig während der Studie als Störung Zeit so weit wie allgemeine Kultur Gesundheit betraf. Auch mit im Medium vorhandenen Antibiotika, bakterielle Kontamination war immer noch ein wichtiger Faktor bei der Vorbereitung Medium. Indem Aliquots von Medium bei Raumtemperatur für mehrere Tage vor dem Einsatz in Kulturen bleiben, ist die Wahrscheinlichkeit eines verheerenden Reihe von Kultur kollabiert aufgrund bakterieller Kontamination wurde zu einer fast nicht existent Faktor reduziert. Antibiotika wie Gentamicin und Streptomycin, werden üblicherweise in Zellkulturmedium zur Bekämpfung von Bakterien innerhalb der Zellen und außerhalb jeglicher Kontamination gefunden. Beide Antibiotika wurden in eine Vertiefung des Zellwachstums in Säugetierkulturen verknüpft eind zu einer Abnahme in der Verwendung von aseptischen Techniken und die Sorge um die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Antibiotika-resistenten Bakterienstämmen 17,18. Antibiotika sollten nicht übermäßig verwendet werden; Jedoch ist ihre Verwendung zur Verhinderung von Kontamination der Zellkultur Probleme notwendig.
Die Auswirkungen dieser Faktoren sind so, dass das Up-Scaling Produktion von Zellen ist eine praktikable Option für die schnelle Massenproduktion von Biopestizid Materialien mit kleineren Schritten, die Qualität der Zellkulturen zu gewährleisten. Bioreaktoren entstanden in den 1950er und 1960er Jahren, und seitdem weiterentwickelt, um eine effiziente Mittel zur Herstellung von Milliarden von Zellen in einer außergewöhnlich kurzen Zeit 19 liefern. Viele Arten von Bioreaktoren existieren, genutzt werden könnte, um die Anzahl von H. drastisch erhöhen vitripennis Zellen auf einmal produziert und der Prozess der Entwicklung dieser Art von Produktionssystem würde die Entwicklung einer Methode benötigen, um Zellen Scheren her, um zu verhindern behandelnm Wachstumsflächen in Bioreaktoren.
Erfolgreiche kontinuierliche Wachstum von Zelllinien ist entscheidend HoCV-01-Replikation und sobald dies erreicht ist, kann verwendet werden, um die Frage, wie viel Virus quantifizierbare in vitro-Replikation und wie lange benötigt, sollte das Virus erlaubt, in Kulturen bleiben. Eine klare Korrelation zwischen der Menge der anfänglichen Viruslast, die von Zellen empfangen und die Zeitdauer, Viruspartikeln gefunden wurde gestattet, in den Zellen inkubiert. Je höher die Viruslast erhalten, der untere der Zeitbedarf für den Zelltod, was auf eine schnelle Virusreplikation. Jedoch ging bei allen Behandlungen Zellzahlen unter den Schwellenwert von 25 x 10 4 Zellen / ml bei etwa 144 Stunden nach der Infektion und zeigt eine übergreifende Zellkulturüberlebens Schwelle. Die Ergebnisse zeigen, daß große Mengen des Virus kann schnell hergestellt werden, wenn größere Mengen des Virus für die anfängliche Infektion leicht verfügbar ist oder dass INCREased Mengen des Virus über einen längeren Zeitraum mit niedriger Anfangsdosis hergestellt werden. Variabilität in der Beziehung zwischen Konzentration und Zeitfaktoren ermöglicht eine gewisse Flexibilität in der Produktionsmöglichkeiten für größere Studien mit einer optimalen Virusextraktionszeit von 72-96 Stunden nach der Infektion.
Verwendung von Zellkulturen zur Virusstudien ist abhängig von der Fähigkeit, den Ziel-Virus zu erkennen und zu quantifizieren, die Ergebnisse der Studie. Eine zuverlässige Methode hierfür ist die PCR verwendet, um die Anwesenheit von viraler RNA-Sequenzen innerhalb der experimentellen Proben zu überprüfen. Die Analyse der CT-Werte von PCR-Daten in dieser Studie nicht geben eine klare Antwort auf das, was die optimale Extraktionszeit von Virus wäre; jedoch ist der Mangel an einer endgültigen Extraktionszeit kein Hinweis auf die Unfähigkeit, HoCV-01 in vitro zu replizieren, aber der sensiblen Natur der Virusstudien. Zellzahlen unter Verwendung von Trypanblau Sie sorgen für einen klareren Blick auf die optimale Extraktionszeiten, sind aber keineswegs eine Definitive Antwort. Zelltod Daten veranschaulichen, dass eine hohe Viruslast führen zu stark verringerten Zelllebensfähigkeit nach 72 Stunden, was darauf hinweist, dass die virale Extraktion zwischen 48 h und 72 h nach Infektion kann ideal, um zelluläre Abbau von Viruspartikeln zu verringern, wie die Zellen in der Kultur beginnen zu sterben exponentiell an. Extraktionszeiten bei niedrigeren Anfangsviruslast sind weniger eindeutig, aber mit dramatischen Rückgang der Zelllebensfähigkeit nach 144 Stunden, es kann spekuliert, dass eine optimale Extraktionszeit würde 24 sein werden - 48 Stunden vor diesem Zeitpunkt. Bestimmung der optimalen Virusextraktionszeit ist entscheidend für wirksame Produktion von Biopestiziden für den Einsatz gegen H. vitripennis Befall und diese Studie hat einen wichtigen Schritt in Richtung Feststellung der damaligen Zeit gemacht.
Mikroskopie ist ein wichtiges Instrument für die Zellkultur und Analyse dieser Studie ist die erste, die konfokale Mikroskopie mit H. benutzen vitripennis Zellen. Imaging Proteinanlage Zunahme oder Abnahme und Fülle vonZellkerne ist der erste Schritt hin zu mehr detaillierte Studien in der intrazellulären Aktivität HoCV-01 in vitro. In dieser Studie wurden die Zellkulturen ohne sichtbare Verschlechterungen morphologischen gehalten. Nach jedem weiteren Zellpassagen wurden normale Fibroblastenwachstum beobachtet, gefolgt von der Bildung einer Monoschicht. Zellen blieben einheitlich in Form und Größe. Allerdings, wenn infizierten Kulturen wurden mit der konfokalen Mikroskopie abgebildet wurden Zellmorphologie Rückgänge beobachtet, vor allem an der 72 Stunden Zeitpunkt, mit hohen und niedrigen Anfangsviruslast. Kleine lochartigen Strukturen könnten auf der Zelloberfläche, die möglicherweise durch Zelltod und Ausstoßen von intrazellulärem Material gesehen werden. Zellen über die Flaschenoberfläche geschrumpft und schließlich begann, von der Oberfläche lösen. Die Folgen aus dieser ersten Verwendung von höheren auflösende Mikroskopie korrelieren die Ergebnisse in der Zellüberlebensanalyse gesehen und gibt Anlass zu weiteren Verwendungsmöglichkeiten für eine erhöhte Virusstudien. Erweiterte miMikroskopie-Techniken konnte bis zu ihrer maximalen Möglichkeiten genutzt werden, wenn der Antikörperentwicklung für HoCV-01 wurde durchgeführt. Antikörper für das Virus würde nicht nur die Visualisierung der interzellulären Mechanismen der Viruspartikel, sondern könnte auch helfen, festzustellen Proliferationsraten und noch präziser Extraktionen Zeiten.
Der Prozess der Aufstockung in dieser Studie entwickelt, um eine wirksame biologische Bekämpfungsmittel bis zu einem Punkt, wo große Biomassen von Zellen für die Virus geerntet und dann auf Felder aufgebracht produzieren Produktionsmethoden ist vor allem eine Frage der Kosten. Anfangskosten für den Aufbau großer Systeme ist hoch, und viele Faktoren zu berücksichtigen, wie zB: Rentabilität, Zell-und Virusproduktivität, Zellkulturmedium Kosten, Verbrauch, Produktion Skala und Batch-Produktionskosten 12. Trotz der anfänglichen Kosten, sind die möglichen Auszahlungen die Investition wert. Durch die Verwendung von Zellkulturtechniken, die Aufbereitung möglich Fragen werden stark reduziert seibewirken, dass die Möglichkeit der Darm Mikroben und andere Viren innerhalb eines ganzen Körper Insekt gefunden werden stark reduziert, sowie Facility Kosten für Live-Insekten Wartung und Aufzucht.
Mit Zellkultur bereits für die Produktion von Proteinen, Biopestiziden und anderen Arzneimitteln verwendet wird, ist der wirtschaftliche Wert für diesen Bereich der Forschung zu. Für die Großproduktion von Biopestiziden in der Landwirtschaft, wäre es vorteilhaft, eine ähnliche Studie, die der hier abgeschlossen, aber mit einer größeren Zellwachstumssystem versuchen. Bioreaktoren und die neue Methodik der 3D-Matrix Zellkultursysteme erlauben größere Stückzahlen von Zellen und in derselben Hinsicht größere Mengen an Virusproduktion 20. Während die anfänglichen Kosten für den Aufbau von großen Anlagen ist hoch, die Auszahlung in Höhe des Produkts in der Lage, hergestellt werden muss, die sogar besser ist. Ein Bereich der Studie, die sich stark für die Förderung von Übertragungs Studium in Großanlagen describ verleihen würdeed oben ist Antikörper-Design. Antikörper-Design wurde zunehmend virale Studien für Krankheiten wie HIV und Hepatitis C verwendet werden, während es eine zeitaufwendige und detaillierte Verfahren für HoCV-01, das zur Visualisierung von viralen Aktivität in vitro mit der konfokalen Mikroskopie erlauben würde, und könnte auf andere führen Untersuchungsgebiete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
- Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
- Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
- Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
- Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
- Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
- Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
- Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
- Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
- Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
- Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
- Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
- Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
- Abbot, A., Cyranoski, D.
