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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Propagazione di Published: September 25, 2014 doi: 10.3791/51953
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

Summary

Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l'infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR.

Abstract

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis) è un insetto estremamente polifago vagili e presente in tutto il sud-ovest degli Stati Uniti. Questi insetti sono i vettori predominanti di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), un batterio xilema limitata che è l'agente causale della malattia di Pierce (PD) della vite. Malattia di Pierce è economicamente dannoso; così, H. vitripennis sono diventati un bersaglio per le strategie di gestione del patogeno. Un dicistrovirus identificato come virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) è stata associata a un aumento della mortalità in H. popolazioni vitripennis. Perché una cellula ospite è necessaria per la replica HoCV-01, coltura cellulare fornisce un ambiente uniforme per la replica mirato che è logisticamente ed economicamente importante per la produzione di bio-pesticida. In questo studio, un sistema per la propagazione su larga scala da H. vitripennis cellule tramite coltura tissutale è stato sviluppato, providing un meccanismo di replicazione virale. HoCV-01 è stato estratto da insetti di tutto il corpo e utilizzato per inoculare H. colta vitripennis cellule a diversi livelli. Il terreno di coltura è stato rimosso ogni 24 ore per 168 ore, RNA estratto e analizzato con qRT-PCR. Le cellule sono state colorate con blu trypan e contati per quantificare la capacità di sopravvivenza delle cellule mediante microscopia ottica. Particelle virali intere sono stati estratti fino a 96 ore dopo l'infezione, che è stato il punto di tempo determinato per essere prima totale coltura cellulare crollo si è verificato. Le cellule sono state inoltre sottoposte a colorazione fluorescente e visualizzati mediante microscopia confocale per indagare l'attività virale su attaccamento e nuclei integrità F-actina. La conclusione di questo studio è che H. vitripennis cellule sono in grado di essere colta e utilizzata per la produzione di massa di HoCV-01 a un livello adeguato a consentire la produzione di un biopesticida.

Introduction

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis Germar 1821) è stata identificata come il vettore predominante di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l'agente causale della malattia di Pierce della vite (PD) in Nord America 1. Insetto gestione della popolazione è rapidamente diventato il centro della ricerca per combattere questo problema devastante per il settore della viticoltura in California e in tutto il sud degli Stati Uniti. Un positivo-senso, virus a RNA a singolo filamento appartenente alla famiglia Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) è stata identificata in H. selvatici popolazioni vitripennis e dimostrato di aumentare la mortalità in quelle popolazioni 2-4, riducendo al contempo la resistenza degli insetti agli insetticidi.

Sviluppo di metodi per efficacemente posteriore infetto H. vitripennis all'età adulta in un ambiente di laboratorio sono stati difficili perché 5-8. Strutture specifiche sono richieste per posteriore H. vivo vitripennis negli Stati Uniti; Pertanto, coltura cellulare è più economico e una possibile alternativa, così come sempre più vitale per HoCV-01 rilevazione e replicazione 2,9. Mentre i metodi di base per stabilire colture cellulari di H. vitripennis sono descritti, questi metodi non sono ancora stati utilizzati per la produzione commerciale di agenti di controllo biologico, come ad esempio i virus 2.

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è quello di produrre una elevata concentrazione di HoCV-01 adatto per l'utilizzo come agente di controllo biologico. Replicazione virale richiede una cellula vivente, che è il motivo per cui coltiva con successo e l'ottimizzazione H. vitripennis culture è fondamentale per il progresso di produrre livelli redditizi di virus.

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Protocol

Cultura 1. cellulare

NOTA: linee cellulari Homalodisca vitripennis stabiliti dal laboratorio Dr. Wayne Hunter presso l'USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) sono stati utilizzati per avviare un magazzino laboratorio composto da fasi cellulari misti inclusi i fibroblasti ei monostrati iniziali.

  1. Eseguire le seguenti procedure in un ambiente di laboratorio sterile mantenuta ad una temperatura compresa tra 20-24 ° C con 25 cm 2 fiasche di coltura.
  2. Coltivare e mantenere le culture in 25 cm 2 fiasche di coltura tissutale utilizzando H2G + Leafhopper medio, una versione modificata del supporto api WH2 10 (Tabella 1).
  3. Incubare fiasche di coltura a 24 ° C con il ~ 53% di umidità.
  4. Utilizzare un microscopio invertito a un ingrandimento totale (TM) di 100X per monitorare la crescita della cultura, ad esempio, controllare l'eventuale crescita cellulare anormale, monitorare eventuali contaminanti potenziali, e verificare i progressi di crescita in tutto il culsuperficie tura.
  5. Eseguire un cambiamento di terreno completo (~ 4 ml di terreno di coltura per bombola) ogni 7 - 10 giorni senza disturbare la superficie cultura.
  6. Passare culture quando la superficie cultura è circa l'80% coperto da crescita cellulare (confluente) con 0,25% di tripsina contenente acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per dissociare le cellule. Aggiungere ~ 2 - 3 ml di tripsina per ciascun pallone di coltura e di esporre la cultura (s) per l'enzima per brevi periodi di tempo (5-10 minuti) per raggiungere dissociazione cellulare completo.
  7. Aggiungere una quantità uguale di mezzo fresco al pallone di coltura (s) (~ 2 - 3 ml) per arrestare l'attività enzimatica e trasferire l'intera soluzione in una provetta per centrifuga.
  8. Cellule pellet per centrifugazione a 4 ° C per 6 min a 350 x g.
  9. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet di cellule e aggiungere ~ 8 ml di terreno fresco ad ogni provetta. Omogeneizzare delicatamente cellule utilizzando una pipetta.
  10. Culture Split in un rapporto 1: 2 per 25 centimetri 2 palloni (~ 4 ml di soluti cellularesu ogni pallone) e lasciare culture appena passati indisturbati per 48 ore per permettere le cellule in sospensione per fissare saldamente alla superficie del pallone.
    NOTA: La coltivazione di cellule in 48 pozzetti piastre di coltura tissutale sterili con una superficie di crescita di 1 cm 2 è anche possibile e che può essere mantenuta allo stesso modo come fiasche di coltura con una riduzione del volume di terreno di coltura per ~ 250 microlitri.

2 Estrazione Virus intero

  1. Omogeneizzare corpi interi di virus H. positivo vitripennis in tampone fosfato, pH ~ 7.2, con 0,02% di sodio triidrato dietilditiocarbamato (DETCA) di vortex per ~ intervalli di 10 sec fino a quando non ci sono più grandi ciuffi di tessuto presente. Estrarre virus via SuperSpeed ​​centrifugazione a 124.500 xg per 4 ore a 4 ° C o 22.000 xg per 16 ore a 4 ° C. Se si forma un precipitato nella parte superiore, rimuoverlo con un tampone di cotone sterile 11.
  2. Eliminare il surnatante.
  3. Raccogliere il pellet esciogliere con 5 ml di 10 mM tampone fosfato (senza DETCA), pH ~ 7,2, contenente lo 0,4% di acido Na-deoxycholic e 4% etere di glicole polietilenico esadecile (Brij 52).
    1. Mescolare bene il pellet, rimuovere il pellet dal lato del tubo e schiacciare fino in soluzione, se necessario.
    2. Aggiungere più 10 mM tampone fosfato in ~ incrementi di 5 ml per aiutare il pellet va in soluzione, se necessario, e si combinano in 2 tubi 11.
  4. Centrifugare la soluzione a 300 xg per 15 min 11.
  5. Rimuovere il surnatante e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micron, e raccogliere il filtrato in provetta grande collezione 11.
  6. Trasferimento filtrato ad una membrana di dialisi con un peso molecolare tagliato (MWCO) di 3,5 kD, utilizzando piccole quantità di tampone fosfato 10 mM (pH 7) non contenente DETCA se necessario 11.
  7. Posizionare la membrana di dialisi in un grande bicchiere pieno di DDH 2 O a 4 ° C. Modificare il DDH 2 O ogni ora fo 5-6 ore, fino a quando un bianco precipitato nella membrana 11.
  8. Raccogliere il virus purificato dal di dentro la membrana e sottoporre la soluzione virus al 100% per una serie di diluizioni di 10 volte con l'aggiunta di 10 ml di soluzione a 90 ml di DDH 2 O. Successivamente, aggiungere 10 ml della diluizione per altri 90 ml di DDH 2 O fino a raggiungere una diluizione di 1: 100.000.
  9. Soluzione virus Conservare a -80 ° C.

3 replicazione virale

  1. Cellule seme in piastre di coltura 48 pozzetti e crescono tutte le righe fino a quando la crescita cellulare è di 80% confluenti (circa il post-passa 72 ore se le cellule stanno crescendo a un tasso medio).
  2. Inoculare ciascuna riga di celle con il virus diluito seriale volta la crescita cellulare raggiunge la confluenza, cioè, una riga di una diluizione 1:10, una riga di una diluizione 1: 100, ecc, ad eccezione della fila superiore. Utilizzare la riga superiore come controllo e aggiungere 10 ml di DDH 2 O a ciascun pozzetto come controlli del volume.
    1. Al fine di stabilire una concentrazione di partenza del cellulare di base per il confronto con conta di cellule sperimentali, dissociare e contare il primo pozzo di ogni riga prima della inoculazione iniziale di eventuali pozzi nelle culture con il virus.
  3. Monitorare piastre di coltura ogni 24 ore dopo l'inoculazione virale per qualsiasi cambiamento di colore nel terreno che indica un cambiamento di pH e di eventuali modifiche di morfologia cellulare.
  4. Immagine una colonna della piastra di prova in ogni punto di tempo, utilizzando un microscopio invertito a 100X TM.
  5. Rimuovere tutti i media dalla colonna che è stato ripreso in ogni punto di tempo di 24 ore e conservarla a breve termine a -20 ° C per l'estrazione dell'RNA e la quantificazione virale o lungo termine a -80 ° C.
  6. Dissociare le cellule dai pozzetti dopo la rimozione del mezzo come precedentemente descritto nei passaggi 1,6-1,9, utilizzando solo ~ 250 ml di 0,25% tripsina EDTA e mezzo fresco di fermare l'attività enzimatica e ~ 250 ml di mezzo fresco di ri-sospendere la pelle cellat.
  7. Aggiungere 10 ml di 0,4% trypan blu macchia in ogni provetta contenente le cellule per eseguire la conta delle cellule dopo la dissociazione delle cellule per ogni periodo di 24 ore più di una settimana. Lasciare macchia riposare per 10 minuti prima di eseguire la conta delle cellule.
    1. Eseguire la conta delle cellule entro 1 ora di esposizione a macchiare o cellule vitali inizierà ad assorbimento macchia così come le cellule non vitali.
  8. Aggiungere lentamente 10 ml di soluzione di cellule macchiata a ogni lato di un emocitometro standard utilizzando una micropipetta. Lasciare la soluzione da adottare da un'azione capillare per evitare bolle d'aria.
  9. Contare il numero di (non tinto), le cellule vitali su entrambi i lati del emocitometro (l'equivalente di 4 conteggi delle 16 piazze del emocitometro). Eseguire la conta delle cellule per ciascun pozzetto della colonna che è stato rimosso.
  10. Calcolare la media dei conteggi di cella da ogni colonna e utilizzare la seguente formula per ottenere il numero totale conta delle cellule: (numero medio di cellule / 4) x fattore di diluizione = numero di cellule x 10

4. Virus Estrazione da coltura cellulare

  1. Rimuovere trattati H. vitripennis cellule da fiasche di coltura come precedentemente descritto nei passaggi 1,6-1,8, utilizzando solo ~ 250 ml di 0,25% tripsina EDTA e mezzo fresco per fermare l'attività enzimatica.
  2. Eliminare il surnatante.
  3. Estratto virus dalle cellule di coltura seguendo il protocollo precedentemente descritto nei passaggi 2,3-2,8.

5. RNA Estrazione

  1. Estrarre l'RNA da campioni medie raccolti durante ogni prova di virus di una settimana con un estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio guanidina progettato per campioni liquidi per il protocollo del produttore.
  2. Conservare estratto campioni a -80 ° C.

6 RT-PCR

  1. Stabilire norme virali per RT-PCR eseguendo PCR tradizionale con ilcoppia di primer HoCV RT-PCR Primer 1 (forward 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-inversione ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') con il virus isolato da tutto il corpo H. vitripennis.
  2. Oggetto del prodotto PCR per gel elettroforesi per 60 min a 120 V in un gel di agarosio al 2% contenente 0,1% di bromuro di etidio.
  3. Accise le bande dal gel e purificare utilizzando un kit di estrazione di gel secondo il protocollo del produttore.
  4. Pool tutti asportato e gel purificato prodotto e purificare ulteriormente per precipitazione di base di etanolo. Eluire il prodotto precipitazioni in circa 30 ml di Tris EDTA (TE) per aumentare la concentrazione complessiva del campione.
  5. Quantificare il livello di cDNA in campioni aggregati mediante spettrofotometria con 260/230 impostazioni di lunghezza d'onda per il rilevamento degli acidi nucleici.
  6. Eseguire una serie di diluizioni seriali di dieci volte del campione purificato che vanno da 57 ng / ml a 57 ag / ml (10 -18). Eseguire la diluizione seriale simile a quella descritta in 2.8 con rettifiche apportate per la differenza nei requisiti di concentramento.
  7. Determinare i limiti di rilevazione delle serie di diluizioni eseguendo qRT-PCR utilizzando un kit qRT-PCR con quantificazione affidabile di trascritti bassa abbondanza.
    NOTA: le concentrazioni virali inferiori a 5 x 10 -3 copie non sono rilevabili.
  8. Estrarre l'RNA da campioni sperimentali come descritto in precedenza al punto 5.1 e quantificare con spettrofotometria.
  9. Normalizza tutti i campioni estratti a 5 ng / ml con acqua priva di nucleasi.
  10. Eseguire qRT-PCR su tutti i campioni, in duplicati, come le reazioni di 25 microlitri utilizzando un one-step kit qRT-PCR con la capacità di percepire basso numero di copie come segue: 50 ° C premuto per 10 min; 95 ° C in attesa per 5 min; 30 cicli di 95 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec; fondere 50-99 ° C per 5 sec su ogni passo.
    1. Rendere il master mix in modo che ogni miscela di reazione contiene 12,5 ml di maste 1xmix R, 1,0 ml (0,3 micron) di primer in avanti, 1,0 ml (0,3 micron) di primer reverse, 0,25 ml di trascrittasi inversa e di quantità variabili di modello in base ai valori di normalizzazione.
    2. Portare il volume totale di reazione a 25 ml con acqua priva di RNasi.
    3. Includi cinque concentrazioni standard in ogni PCR eseguiti con i seguenti numeri di copie: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, e 5 x 10 -2 copie. Impostare la soglia per ogni corsa appena sotto una fluorescenza di 10x -2.5 per ridurre il rumore durante l'acquisizione anticipata all'inizio di ogni esecuzione.

7 Microscopia confocale

  1. Crescere cellule Homalodisca vitripennis in dodici piatto contenente anche vetrini di misura 18 mm di diametro in ciascun pozzetto.
  2. Seminare una colonna sul piatto ogni 24 ore per un periodo di quattro giorni, una volta un monostrato è raggiunto. Assicurarsi che ogni column contiene un controllo bene, una diluizione virale bassa (1,10) bene e una diluizione virale elevata (1: 100.000) bene. Utilizzare soluzioni antivirus ottenute dal punto 2.8.
  3. Rimuovere tutti i supporti il ​​quinto giorno e lavare le cellule due volte con PBS 1x (pH 7,4).
  4. Fissare le cellule con freddo 4% paraformaldeide a 4 ° C per 30 min.
  5. Aggiungere 500 ml di 1x tampone fosfato (PBS) per le cellule e lavare per 10 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo a bassa velocità. Lavare le cellule tre volte.
  6. Aggiungere 500 ml di 0,1% Triton X-100 per le celle a permeabilize loro. Lasciate riposare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  7. Lavare le cellule di nuovo come precedentemente descritto al punto 7.5.
  8. Aggiungere 500 ml di una soluzione al 5% albumina sierica bovina (BSA) per bloccare le cellule a temperatura ambiente. Lasciare riposare per 2 ore e poi rimuovere.
  9. Diluire magazzino Rhodamine falloidina rosso-coniugato (RCP) 1: 250 in 1x PBS contenente 5% di BSA e aggiungere 250 ml di diluizione per ciascun bene a macchia di F-actina.
  10. Piastra di copertura in alluminio folio per evitare che il colorante da sbianca e incubare le cellule a 4 ° CO / N.
  11. Rimuovere la RCP dopo 12 ore di incubazione e sostituirlo con 250 ml di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (250 mg / ml) diluito in 1x PBS contenente 5% di BSA, a macchiare i nuclei delle cellule .
  12. Incubare le cellule contenenti DAPI a temperatura ambiente per 1 ora.
  13. Lavare le cellule tre volte con PBS 1x come precedentemente descritto al punto 7.5.
  14. Rimuovere delicatamente i coprioggetti dai pozzetti e montare per vetrini da microscopio utilizzando un mezzo di montaggio con un reagente anti-sbiadimento.
  15. Lasciare i vetrini si asciughino in scatole a tenuta di luce fino visti al microscopio confocale. Vedi Vetrini Preparati al più presto come coloranti possono svanire rapidamente.
  16. Immagine macchiato cellule utilizzando un sistema confocale equipaggiato con un microscopio contenente una lente 63X (olio) piano-apochromate.
    1. Impostare le lunghezze d'onda laser a 543 ± 10 nm di eccitazione e 575 ± 10 nm di emissione per Rhoadmine falloidina rosso-conjucated, E 369 ± 10 nm di eccitazione e 450 ± 30 nm di emissione per DAPI.
    2. Utilizzare guadagno identici e impostazioni partì-per il rilevatore di ottenere tutte le immagini.
    3. Immagini di processo utilizzando il software appropriato per l'elaborazione delle immagini e di smistamento e immagini di importazione desiderato in un software di gestione delle immagini.

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Representative Results

Attaccamento delle cellule e la crescita è stato visto in 48 ore di passaggio in piccole e grandi fiasche di coltura, da colture primarie e continui passaggi. Crescita dei fibroblasti e sviluppo è stata osservata anche in questo lasso di tempo. Quando fiaschi appena seminati sono stati disturbati prima di 48 ore, c'è stato un calo visibile in adesione cellulare, portando a culture crescita più lenti ea volte senza attaccamento o di crescita a tutti. Le cellule sono state circa il 80% confluenti entro una settimana dalla scomparsa e ha formato un monostrato in 10-14 giorni (Figura 1). Colture primarie che sono state coltivate in apertura di questo studio, sono sopravvissuti più di 30 passaggi cellulari senza alcun deterioramento morfologica o declino generale vitalità cellulare.

Attaccamento delle cellule e la crescita è stato visto in 48 ore di passaggio da palloni a piastre. Formazione monostrato è stato raggiunto in un periodo di tempo più breve, circa 5-6 giorni, in quanto si tratta di una superficie di crescita più piccolo. Colture infette fotografato unt 100X al microscopio ottico ha mostrato segni di declino dell'integrità forma delle cellule. A 48 ore dopo l'infezione, che sembrano essere grandi fori erano presenti sulla superficie delle cellule. Attraverso fiasche di coltura, le cellule rimpiccioliti e staccate dalla superficie cultura circa 72-96 ore dopo l'infezione con i non-diluito HoCV-01 (Figura 2).

Medio della conta delle cellule vive per il controllo e campioni sperimentali sono state calcolate e tracciate per descrivere le differenze di abbondanza di cellule vive tra la carica virale nel corso del tempo (Figura 3). Un aumento consistente in cellule vive per il gruppo di controllo è presente, indica cellule sane. Comparativamente, tutti i gruppi di trattamento hanno avuto un netto calo del numero di cellule vive presenti nel corso del tempo. I gruppi di trattamento virali più elevati indicano una molto più marcato declino della salute cultura con un forte calo nelle cellule vive tra 48-72 ore, mentre i gruppi virali inferiori lento declino fino cadere intorno a 144 ore. Una ANOVA a due vie wianalisi th Bonferroni post-hoc è stato utilizzato per testare le differenze nei tassi di coltura cellulare uccidere da HoCV-01 sulla base della conta delle cellule dal vivo in ciascun gruppo di trattamento rispetto ad ogni punto di tempo in studio, così come tra i gruppi. L'analisi a due vie della varianza ha avuto un significativo effetto principale del fattore tempo, F (7, 432) = 82.5, p <0.0001, suggerendo che la lunghezza delle culture di tempo sono stati esposti ad un trattamento colpito cultura longevità. L'effetto del tipo di trattamento ricevuto culture è stato significativo, come pure, F (5, 432) = 170.6, p <0,0001, che indica che la quantità di carica virale una cultura riceve inizialmente colpisce la sopravvivenza della cultura. Un effetto significativo nell'interazione tra il fattore tempo e il fattore trattamento è anche presente, F (35, 432) = 17.63, p <0,0001, sottolineando che maggiore è la carica virale ha ricevuto il breve lasso di tempo necessario per ridurre la cultura fitness e viceversa minore è la carica virale, laperiodo di tempo richiesto per lo stesso effetto più lungo. Test post-hoc di Bonferroni mostrano una differenza significativa tra i gruppi di trattamento e di controllo, che indica una notevole dose-risposta.

Probabilità di sopravvivenza delle cellule inoculate con trattamenti virali più elevate era inferiore, come provato da curve di Kaplan-Meier (Figura 4), ​​correlando le conclusioni tratte dalla analizza la conta media delle cellule vive. C'era un tasso di sopravvivenza del 100% per il controllo o le cellule non infette. Le cellule esposte alle alte trattamenti virale ha avuto un netto calo della probabilità di sopravvivenza nel tempo, mentre i trattamenti virali più basse hanno una maggiore probabilità di sopravvivenza fino al 144 hr, quindi un calo della probabilità di sopravvivenza è presente. Rischi proporzionali di Cox analisi del modello non è stato significativo, il trattamento coeff = 0,8812 (95% CI [0,76, 1,02]), p> 0.05. Anche se non significativo, i dati suggeriscono che le cellule esposte al virus sono 88% più propensi a mostrare tassi di sopravvivenza più bassi nel tempo.

Per ogni esecuzione qRT-PCR, gli standard più elevato virali dilagato prima di standard virali inferiori e campioni sperimentali. Da ogni esecuzione, replicano valori Ct sono stati analizzati utilizzando un ANOVA a due vie per verificare le differenze nell'abbondanza di HoCV-01 RNA presente nei campioni sperimentali e confrontare i valori a più valori di controllo. L'analisi a due vie della varianza ha mostrato alcun significativo effetto principale del fattore tempo, F (7, 289) = 0.38, p> 0.05, o l'interazione tra gruppi di tempo e di trattamento, F (63, 289) = 0.14, p > 0.05. Un effetto principale significativo tra i gruppi di trattamento, F (9, 289) = 135.7, p <0,0001, indicando la quantità di virus inizialmente introdotto per coltura cellulare influisce sulla quantità di RNA virale rilevato è stato osservato. Test post-hoc di Bonferroni sono stati eseguiti e mostrano le interazioni significative tra i gruppi di trattamento e le misure di controllo, ma senza interazioni significative tra trattamento gruppi solo, indicando nessuna dose-risposta misurabile.

Le differenze nella morfologia cellulare di sana e HoCV-01 infetti H. vitripennis cellule a 24 e 72 ore sono stati osservati in fluorescenza. Il declino del numero di nuclei presenti, nonché l'aspetto deforme di F-actina nelle cellule esposte a HoCV-01 rispetto ai controlli indicano che il virus ha un forte impatto sulla salute della cultura. Cellule esposte a 01:10 carica virale superiore mostrato una maggiore difficoltà rispetto alle cellule esposte al trattamento virale inferiore. Le cellule di controllo appaiono più abbondante e di avere la morfologia normale tra i due punti di tempo (Figura 5).

Insetto medio di Grace (integrata, 1x) 210 ml
0.06M L-istidina soluzione monoidrato (pH = 6,5) 290 ml
Medium 199 (10x) 10 ml
Media 1066 (1x) 17 ml
Sali bilanciati di Hank (1x) 33 ml
L-glutammina (100x) 1,5 ml
MEM, mix di aminoacidi (50x) 1,5 ml
Soluzione 1 M MgCl 6 ml
Pen-Strep (w / Glutammina) 2,5 ml / 500 ml
Nystatin 1,0 ml / 500 ml
Gentamycin 1,5 ml / 500 ml
Destrosio 1,8 g
Siero fetale bovino 10% del volume finale

Tabella 1 H2G + componenti medie leafhopper.

Figura 1
Figura 1 Immagini di H. vitripennis cell crescita in vitro catturato a 100X TM. (A) Cellule due giorni (48 ore) post-passaggio espositrici attaccamento e sviluppo dei fibroblasti. (BE) Cellule quattro, sei, otto e dieci giorni dopo il passaggio di continuare a crescere attraverso la superficie della cultura. Formazione (F) si verificano uno str ~ 10- 14 giorni. Barre di scala:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2 Infected H. vitripennis cellule impressi a 100X TM per catturare cambiamenti morfologici. (A) di crescita dei fibroblasti prima dell'inoculo. (B) Cellule 24 ore dopo l'infezione. (C) Le cellule dall'infezione 48 ore. (D) cellule di infezione dopo 96 ore hannoper lo più staccato dalla superficie cultura e media è diventato nuvoloso. Barre di scala:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 Grafico a barre che mostra conta media di cellule vive per campioni sperimentali. Media della conta delle cellule vive sono stati calcolati per i campioni sperimentali carica virale ricevuti per ogni giorno durante il periodo di sperimentazione e sono mostrati qui con barre di deviazione standard. La media della conta delle cellule mostrano una significativa diminuzione delle cellule vive ~ 72 ore post-infezione con carichi virali elevati e significative diminuzioni nella conta delle cellule vive a ~ 144 ore post-infezione con cariche virali inferiori. pregoclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4 Kaplan-Meier analisi di sopravvivenza di cinque diversi HoCV-01 trattamenti rispetto a un controllo non infetto in H. colture cellulari vitripennis. colture di controllo hanno mantenuto un tasso di sopravvivenza del 100% rispetto ai cinque gruppi di trattamento. La probabilità di sopravvivenza più basso è stato osservato nel gruppo ad alto trattamento e tutti i gruppi di trattamento dirigersi verso lo zero probabilità di sopravvivenza a 168 hr quando n = 10. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figu. re 5. immagini confocale di controllo e cellule infettate H.vitripennis Homalodisca vitripennis cellule sono state infettate con seriale diluito HoCV-01 in 01:10 e 1: 100.000 concentrazioni a intervalli di 24 hr. Le cellule sono state trattate con rodamina falloidina e le macchie DAPI per visualizzare F-actina e nuclei all'interno delle culture. Immagini confocale sono stati catturati a 63X e mostrano una rottura verso il basso nella morfologia cellulare a 72 ore in entrambe le diluizioni virali alte e basse. Barre di scala:. 1 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'aumento preoccupazioni per quanto riguarda l'afflusso di specie invasive agricole hanno portato ad un aumento della domanda di nuove metodologie per la difesa contro i parassiti e patogeni emergenti. Un focus di prevenzione e gestione della malattia comporta la gestione di vettori patogeni ed era l'obiettivo primario di questo studio. Economia svolgono un ruolo fondamentale nella decisione di produrre questo tipo di biopesticida per gestire vettori di patogeni in agricoltura perché l'applicazione pratica ha bisogno di essere grandi quantità su vaste aree, ma ad un costo ridotto 12. La pratica di utilizzare colture cellulari per la ricerca e lo sviluppo è diventato sempre più comune e, come tale, l'impatto di questo studio sono significativi. Identificazione di gestione integrata dei parassiti (IPM) strategie economicamente fattibile è la chiave per continuare la produzione agricola di successo in tutto il mondo e le conclusioni di questo studio contribuiscono al progresso nel migliorare le strategie IPM e riducendo l'insorgenza di PD di vite.

H. colture cellulari vitripennis state propagate e mantenuto per oltre un anno, senza alcun deterioramento morfologica visibile. Numeri passaggio può influire drasticamente i risultati degli studi in vitro in cellule di mammifero modificando il metabolismo delle cellule e le caratteristiche di crescita 13. Come le cellule si replicano in vivo e in vitro, i telomeri si accorciano ad ogni ciclo di replicazione cellulare e, infine, raggiungono un limite critico in cui i telomeri diventano troppo corti e inducono senescenza cellulare 14. Quando si verifica una grave accorciamento dei telomeri, instabilità genetica e, infine, di crisi, o morte cellulare massiva si verifica 15. A causa di questo fenomeno, le culture raramente sopravvivono oltre i 50 subcultivations o un anno, considerato il Hayflick Limit, sulla base dei seguenti criteri: ritenzione di cromatina sessuale, differenziazione histotypical, inadattabilità di sospendere la cultura, le caratteristiche non-maligne in vivo, limite finito di coltivazione, Simile morfologia cellulare al tessuto primario, aumentata produzione di acido rispetto alle linee cellulari, ritenzione di Coxsackie A9 sostanza recettore e la facilità con cui i ceppi potrebbero essere sviluppati 16. Le potenziali complicanze di numeri di passaggio non sono stati osservati durante la durata di questo studio indica che questo metodo di propagazione linea cellulare è in grado di produzione continua per lunghi periodi di tempo prolungati. A causa dell'utilizzo di colture cellulari su allevamento di insetti vivi o altri metodi di produzione costosi e complicati sta rapidamente diventando comune in molte discipline, la longevità di questo tipo di linea cellulare ha molte applicazioni pratiche. Se conservato correttamente, una singola linea cellulare primaria potrebbe essere utilizzato per più cicli di produzione di virus.

I due principali fattori di successo mantenimento a lungo termine di queste cellule erano tempo di disturbo per le culture appena seminati e corretta preparazione media. Le culture che sono rimaste intatte per i primi 48 ore dopo il passaggio ha mostrato un marcato aumento della crescita cross-pallone rispetto a quelli che sono stati spostati all'interno di quella finestra iniziale. Se lasciati indisturbati, la rapida replicazione delle cellule raggiunto monostrati in appena dieci giorni dopo il passaggio in fiasche di coltura. Preparazione media era di vitale importanza durante lo studio come momento di disturbo per quanto riguarda la salute in generale la cultura era preoccupato. Anche con antibiotici presenti nel terreno, contaminazione batterica era ancora un fattore importante da considerare quando si prepara medie. Consentendo aliquote di media a rimanere a temperatura ambiente per diversi giorni prima dell'uso nelle culture, la probabilità di una serie devastante di cultura crolla a causa di contaminazione batterica è stato ridotto a un fattore quasi inesistente. Gli antibiotici, come gentamicina e streptomicina, sono comunemente utilizzati in terreno di coltura cellulare per combattere batteri presenti all'interno delle cellule e qualsiasi contaminazione esterna. Entrambi questi antibiotici sono stati collegati ad una depressione della crescita cellulare in colture di mammifero und ad una diminuzione dell'uso di tecniche asettiche e preoccupazione per aumentare la probabilità di sviluppare ceppi batterici resistenti agli antibiotici 17,18. Gli antibiotici non dovrebbero essere usati eccessivamente; tuttavia, il loro uso è necessario per evitare problemi di contaminazione di colture cellulari.

Le implicazioni di questi fattori sono tali che up-scaling produzione di cellule è una valida opzione per la produzione di massa rapida di materiali biopesticida con gradini minori per garantire la qualità delle colture cellulari. Bioreattori emerse negli anni 1950 e 1960, e da allora evoluto per fornire mezzi efficienti di produzione di miliardi di cellule in un eccezionalmente breve lasso di tempo 19. Esistono molti tipi di bioreattori che potrebbe essere utilizzato per aumentare drasticamente il numero di H. vitripennis cellule prodotte in una sola volta e il processo di sviluppo di questo tipo di sistema di produzione richiederebbe lo sviluppo di un metodo per il trattamento di cellule per prevenire taglio indietrom crescita superfici in bioreattori.

Continua crescita di successo di linee cellulari è fondamentale per HoCV-01 replica e, una volta raggiunto, può essere utilizzato per affrontare il problema di quanto il virus è necessaria per quantificabile in vitro la replicazione e per quanto tempo il virus dovrebbe essere consentito di rimanere all'interno delle culture. Una chiara correlazione è stata trovata tra la quantità di carica virale iniziale ricevuta da parte delle cellule e la durata delle particelle virali tempo fu permesso di incubare all'interno delle cellule. Maggiore è il carico virale ricevuto, minore è il tempo richiesto per la morte cellulare, indicando la replicazione virale rapida. Tuttavia, in tutti i trattamenti numero di cellule è diminuito al di sotto del valore di soglia di 25 x 10 4 cellule / ml a circa 144 ore post-infezione, dimostrando una soglia di sopravvivenza coltura cellulare globale. I risultati mostrano che grandi quantità di virus possono essere prodotte rapidamente se sono prontamente disponibili per l'infezione iniziale grandi quantità di virus, o che increquantità ASED di virus possono essere prodotte in un periodo di tempo più lungo, con minor dosaggio iniziale. La variabilità nel rapporto tra fattori di concentrazione e di tempo permette una certa flessibilità nelle opzioni di produzione per gli studi su più vasta scala, con un tempo di estrazione virale ottimale di 72-96 ore dopo l'infezione.

Utilizzo di colture cellulari per studi virale dipende dalla capacità di rilevare il virus bersaglio e quantificare i risultati dello studio. Un metodo affidabile per questo è di utilizzare la PCR per verificare la presenza di sequenze di RNA virale all'interno di campioni sperimentali. L'analisi dei valori Ct dai dati di PCR in questo studio non dà una risposta chiara a ciò che il tempo di estrazione ottimale del virus sarebbe; tuttavia, la mancanza di un tempo di estrazione definitivo non è indicativo di una incapacità di replicare HoCV-01 in vitro, ma della natura sensibile degli studi virali. Conta delle cellule utilizzando trypan blu si prestano ad una visione più chiara dei tempi ottimali di estrazione, ma non sono affatto un Definitive risposta. Dati morte cellulare dimostra che elevati carichi virali portano a una diminuzione altamente sopravvivenza cellulare dopo 72 ore, indicando che l'estrazione virale tra 48 ore e 72 ore post-infezione può essere ideale per ridurre la disgregazione cellulare delle particelle virali come le cellule nella cultura cominciano a morire in modo esponenziale. Tempi di estrazione ai carichi virali iniziali più basse sono più ambigui, ma con cali drammatici di sopravvivenza cellulare dopo 144 ore, si può ipotizzare che il tempo ottimale di estrazione sarebbe 24-48 ore prima di quel punto di tempo. Determinazione del tempo ottimale di estrazione virale è essenziale per la produzione efficace di biopesticidi per l'uso contro H. vitripennis infestazioni e questo studio ha compiuto un passo importante verso la determinazione di quei tempi.

Microscopia è uno strumento fondamentale per l'analisi di colture cellulari e questo studio è il primo ad utilizzare la microscopia confocale con H. vitripennis cellule. Proteine ​​Imaging aumento attaccamento o il declino e l'abbondanza dinuclei delle cellule è il primo passo verso studi più dettagliati nella attività intracellulare di HoCV-01 in vitro. Nel corso di questo studio, colture cellulari sono stati mantenuti senza alterazioni morfologiche visibili. Dopo ogni passaggio cella successiva, normale crescita dei fibroblasti è stata osservata, seguita dalla formazione di un monostrato. Le cellule rimaste uniforme per forma e dimensioni. Tuttavia, quando le colture infette sono stati ripresi con la microscopia confocale, sono state osservate diminuzioni morfologia delle cellule, in particolare al punto di tempo 72 ore, con carica virale iniziale sia alta e bassa. Strutture piccolo foro-come potrebbe essere visto sulla superficie delle cellule, forse a causa di morte cellulare e l'espulsione di materiale intracellulare. Le cellule in tutta la superficie del pallone striminziti e alla fine ha cominciato a staccarsi dalla superficie. Le implicazioni di questo primo utilizzo della microscopia a risoluzione più elevata correlazione con i risultati osservati nell'analisi di sopravvivenza delle cellule e dà origine ad altri usi possibili per incrementare gli studi virali. Avanzato kmtecniche di microscopia potrebbero essere utilizzati per le sue capacità al massimo se lo sviluppo di anticorpi per HoCV-01 è stato condotto. Gli anticorpi per il virus sarebbe non solo permettere la visualizzazione di lavorazioni intercellulari delle particelle virali, ma potrebbe anche aiutare a determinare i tassi di proliferazione e persino estrazioni più precise volte.

Il processo di scaling up metodi di produzione sviluppati in questo studio per produrre un agente di controllo biologico efficace a un punto in cui le grandi biomasse di cellule vengono raccolte per il virus e poi applicate ai campi è soprattutto una questione di costi. Costi iniziali di costruzione di impianti di grandi dimensioni è alta e molti fattori devono essere considerati, come ad esempio: la redditività, la produttività delle cellule e virus, i costi di coltura cellulare, tasso di applicazione, la produzione di scala e costi di produzione del lotto 12. Nonostante costo iniziale, i potenziali pay off valgono l'investimento. Utilizzando tecniche di coltura cellulare, le questioni di depurazione del flusso sono notevolmente ridotta siacausa la possibilità di intestino microbo e altri virus trovati all'interno di un intero insetto corpo sono notevolmente ridotti, così come i costi degli impianti per manutenzione dal vivo di insetti e di allevamento.

Con la coltura di cellule già utilizzate per la produzione di proteine, biopesticidi e altri prodotti farmaceutici, il valore economico di questo settore di ricerca è in aumento. Per la produzione su larga scala di biopesticidi in agricoltura, sarebbe utile provare uno studio simile a quello compiuto qui, ma con un più grande sistema di crescita cellulare. Bioreattori e la nuova metodologia di sistemi di coltivazione di cellule matrice 3D consentono la produzione volume maggiore di cellule e, nello stesso senso, grandi volumi di produzione virale 20. Mentre il costo iniziale di costruzione di sistemi su larga scala è alta, il payoff della quantità di prodotto in grado di essere prodotto ha il potenziale per essere ancora maggiore. Uno spazio di studio che sarebbe di grande prestare a promuovere studi di trasmissione nei sistemi su larga scala describEd è soprattutto il design anticorpo. Progettazione di anticorpi è stata utilizzata sempre più negli studi virali per malattie come l'HIV e l'epatite C. Anche se è un dispendio di tempo e di processo dettagliato, per HoCV-01, che permetterebbe per la visualizzazione di attività virale in vitro con la microscopia confocale e potrebbe portare ad altri aree di indagine.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning cell culture flasks Sigma Aldrich CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 Olympus Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Sigma Aldrich M8937 48 wells (TC treated with lid)
DETCA Sigma Aldrich 228680 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma Aldrich CLS431206 Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml
Brij 52 Sigma Aldrich 388831 Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution Sigma Aldrich P5244 Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water
TRIzol LS Life Technologies 10296-028
Agarose Sigma Aldrich A5304 For electrophoresis
Ethidium bromide Sigma Aldrich E7637 BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick Qiagen 28704
QuantiTect qRT-PCR kit Qiagen 204243
4% paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 Reagent grade, crystalline
PBS Sigma Aldrich P5368 Phosphate buffered saline
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin Life Technologies R415 Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI Sigma Aldrich D9542
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36934
LSM510 Meta Confocal System Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) Sigma Aldrich G8142 H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate Sigma Aldrich H8125 H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10x) Sigma Aldrich M4530 H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1x) Sigma Aldrich C0422 H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1x) Sigma Aldrich 51322C H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100x) Sigma Aldrich G3126 H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50x) Sigma Aldrich 56419C H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution Sigma Aldrich M8266 H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ glutamine) Sigma Aldrich G6784 H2G+ leafhopper medium component
Nystatin Sigma Aldrich N6261 H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin Sigma Aldrich 46305 H2G+ leafhopper medium component
Dextrose Sigma Aldrich D9434 H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 H2G+ leafhopper medium component

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References

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
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  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

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Infezione , Coltura cellulare malattia di Pierce della vite,
Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture
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Biesbrock, A. M., Powell, C. M.,… More

Biesbrock, A. M., Powell, C. M., Hunter, W. B., Bextine, B. R. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (91), e51953, doi:10.3791/51953 (2014).

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