Summary
ظهور المقاومة الوراثية ضد العلاج كيناز المانع يشكل تحديا كبيرا لعلاج السرطان فعال. تحديد وتوصيف الطفرات المقاومة ضد المخدرات وضعت حديثا يساعد في تحسين إدارة السريرية وتصميم الأدوية الجيل القادم. هنا، نحن تصف بروتوكول لدينا في المختبر لفحص والتحقق من الطفرات المقاومة.
Abstract
أدى اكتشاف BCR / ABL باعتباره الجين الورمي السائق في سرطان الدم النخاعي المزمن (CML) في تطوير إيماتينب، والتي، في الواقع، أظهرت إمكانية استهداف كيناز في السرطانات عن طريق علاج فعال للمرضى CML. هذه الملاحظة ثورة في تطوير العقاقير لاستهداف تحركات أنكجنيك المتورطين في مختلف الأورام الخبيثة الأخرى، مثل EGFR، B-RAF، KIT وPDGFRs. ومع ذلك، عيب رئيسي واحد من العلاجات المضادة للكيناز هو ظهور الطفرات المقاومة للأدوية مما يجعل الهدف قد خفضت أو فقدت تقارب للدواء. فهم الآليات التي تستخدمها المتغيرات مقاومة لا يساعد فقط في تطوير مثبطات الجيل القادم ولكن أيضا يعطي دفعة لإدارة السريرية باستخدام الطب الشخصي. أبلغنا استراتيجية ناقلات فيروسات على أساس فحص لتحديد الطيف المقاومة منح الطفرات في BCR / ABL، الذي ساعد في تطوير الجيل القادم BCR / مثبطات ABL. باستخدام Ruxolitinib وJAK2 كزوج الهدف المخدرات، وهنا وصفنا في طرق الفحص في المختبر التي تستخدم خلايا الفأر BAF3 معربا عن مكتبة طفرة عشوائية من JAK2 كيناز.
Introduction
تحركات البروتينات هي الانزيمات التنظيمية الرئيسية داخل الخلايا مسارات نقل الإشارة التي تعدل على ما يبدو كل وظيفة الخلوية. والرقابة السليمة على كيناز بوساطة إشارات حاسمة إلى التوازن والتنمية، والتي تعتمد في الغالب على التنظيم السليم لتحركات، الفسفاتازات وتحلله من قبل شركة يو بي إس (نظام proteasome واليوبيكويتين). تحركات حررت هي في مركز الصدارة في العديد من أنواع السرطان وتورط في مجموعة من الأمراض التي تصيب الإنسان 1. الجينوم البشري بترميز أكثر من 500 تحركات البروتينات التي تم ربطها بشكل مباشر أو غير مباشر، إلى ~ 400 الأمراض التي تصيب الإنسان 2. دعمت هذه الملاحظات مفهوم لاستهداف العلاجي للتحركات التي كتبها مثبطات جزيء صغير 3-5.
قدمت مظاهرة من مثبطات كيناز ABL، مثل إيماتينب، في علاج سرطان الدم النخاعي المزمن (CML) الدليل على مفهوم لهذا النهج 6،7. هذه الملاحظة ثورة ليس فقط النملةط-كيناز العلاج ولكن أيضا فرض فكرة التعرف على الآفات الوراثية في أمراض الأورام الأخرى لاستهداف العلاجية، والتي تؤدي إلى اكتشاف الطفرات أنكجنيك في JAK2 من كثرة الحمر فيرا (PV) والمرضى الذين يعانون من الأورام التكاثر النقيي (MPN). هذا الاكتشاف ولدت اهتماما كبيرا في علاج MPNs من خلال استهداف JAK2 مع مثبطات كيناز جزيء صغير. الآن، ما يقرب من اثني عشر من مثبطات JAK2 هي في التجارب السريرية واحد منهم قد وافقت مؤخرا لعلاج تليف النقي. بينما استهداف معين من تحركات أنكجنيك بواسطة مثبطات جزيء صغير في سرطانات تجلب نتائج واعدة، أنها تعاني أيضا من تطوير مقاومة للعلاج. في الواقع، حتى الآن، والمرضى تعامل مع مثبطات كيناز، مثل إيماتينب، Gefitinib، Erlotinib وDasatinib وضعت الطفرات المقاومة في الغالب من خلال الحصول على الطفرات في المجال كيناز التي تستهدف المخدرات 8-10. المقاومة نتيجة لطفرة جينية تسلط الضوء على القيود سو استهدفت حيد ضد تحركات أنكجنيك، وتمثل التحدي المقبل في تطوير أكثر نجاحا من أي وقت مضى العلاج الكيميائي للسرطان. يجب أن عواقب الميكانيكية والوظيفية للمقاومة المخدرات توفر الأساس المنطقي لاختيار وتصميم مركبات مجانية لتطوير الأدوية. الطفرات التي تم تحديدها عبر الشاشات في المختبر، وقد أظهرت درجة عالية من الارتباط مع تلك التي وجدت في المرضى. لذلك، في المختبر لفحص الطفرات التي تمنح المخدرات المقاومة لإعطاء أزواج الهدف المخدرات في تمريرات التطوير السريري أو قبل السريرية في تحديد أنماط المقاومة التي من المحتمل أن تسبب الانتكاس السريري. تحديد هذه الأشكال متحولة ليست فقط مفيدة في مراقبة المرضى عن الاستجابة للدواء والانتكاس ولكنها ضرورية أيضا لتصميم أكثر قوة مثبطات الجيل القادم. على سبيل المثال، وتطوير الجيل القادم مثبطات BCR / ABL، Nilotinib وPonatinib، أدلى ممكن وذلك بسبب زيادة MECاكتسبت تفاهمات hanistic من الطفرات، والبنائية، والدراسات وظيفية.
في وقت سابق، ونحن قد أفادت نتائج الشاشة لدينا باستخدام الطفرات العشوائية من BCR / ABL للكشف عن الطيف من الطفرات التي تمنح مقاومة للمثبطات مثل إيماتينب 11،12، PD166326 12، وAP24163 13. النتائج ليس فقط تحديد الطفرات منح المقاومة والمرض السريري الانتكاس، ولكن قدمت أيضا فهم الآلية المقاومة للأدوية والمبادئ التي تحكم وظيفة كيناز 11،14. هنا نقدم التفاصيل المنهجي إضافي، وذلك باستخدام Ruxolitinib وJAK2 كزوج الهدف المخدرات، لتمكين تطبيق أوسع لهذه الاستراتيجية الفرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات في هذا البروتوكول وفقا للمعهد الوطني للمبادئ التوجيهية الصحة لعلاج الأخلاقية ورعاية الحيوانات، وفقا لبروتوكول IACUC استخدام الحيوانات المعتمدة.
1. خلية الخط الصيانة
- ثقافة خلايا BAF3 في المتوسط RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والبنسلين / الستربتومايسين (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل) وقضى مستنبت من خلايا Wehi. زراعة خلايا HEK293T في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والبنسلين / الستربتومايسين (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل). الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO2.
2. البلازميد البناء
- استنساخ فأر JAK2 ولها أنكجنيك شكل الإسوي JAK2-V617F في pMSCV-بورو-GW التي كتبها LR clonase باستخدام معيار إجراءات إعادة التركيب الاستنساخ.
- لبناء ناقلات luciferase المراسل التعبير (pMSCV لوك-الكرز-GW) المستخدمة في في السادسالتصوير فو، تضخيم luciferase المراسل من pLVX-تيت-ON ناقلات بواسطة PCR باستخدام بادئات (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG وLUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC)، يليه مع الاستنساخ في pENTR-SD-TOPO لتوليد pENTR لوك، والذي يستخدم لنقل الجين luciferase المراسل في ناقلات فيروسات الرجعية، pMSCV-الكرز-GW بواسطة إعادة التركيب الاستنساخ بوساطة باستخدام LR clonase.
3. إعداد مكتبة الطفرة عشوائية، وفحص وتحديد الطفرات
3.1) عشوائية الطفرات
- استنساخ كامل طول JAK2 النوع البري والطفرة V617F إلى pMSCV-بورو-GW فيروسات ناقلات باستخدام تقنية إعادة التركيب استنساخ التجارية.
- استخدام 1 ميكروغرام من DNA البلازميد JAK2-V617F لتحويل، XL-1 الأحمر، E. خلايا القولونية، وهو خلل في آليات إصلاح الحمض النووي مما يسمح لهم لدمج الطفرات العشوائية أثناء النسخ المتماثل. وبشكل أكثر تحديدا، مزيج 50-100 نانوغرام من الحمض النووي (أكثر من 100 نانوغرام من الحمض النووي يقلل كفاءة التحول) مع 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة في أنبوب البولي بروبلين قبل المبردة وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة، يحوم بلطف كل 5 دقائق. للحصول على تغطية مكتبة جيدة، استخدم 05:56 أنابيب الخلايا المختصة.
ملاحظة: أكثر من 100 نانوغرام من الحمض النووي يقلل كفاءة التحول - تزج الأنبوب في حمام مائي عند 42 ° C لصدمة الحرارة من 45 ثانية واحتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة. المقبل، إضافة 1 مل من SOC المتوسطة (2.0٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 0.05٪ كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgCl2، 10 ملي MgSO4، و 0.4٪ D-الجلوكوز). احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 225-250 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة.
- خلايا لوحة من كل أنبوب على أربعة 10 سم لوحات LB-آغار تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لوحات ل16-24 ساعة عند 37 ° C.
- وبعد المستعمرات مرئية، وجمع لهم عن طريق كشط لوحات مع لوحة مكشطة معقمة. خلايا تجمع من كل لوحة وبلازميد العزلة DNA استخدام عدة استخراج البلازميد التجارية.
ملاحظة: عادة المستعمرات هي أصغر واتخاذ 18-24 ساعة لتكونمرئية لأن هذه هي بطيئة سلالات بكتيرية المتنامية. في هذه المرحلة، وتقييم عدم التجانس من الطفرات في المكتبة عن طريق تقييد الهضم مع قطع متكررة مثل Sau3A1 أو Taq1 أو التسلسل.
3.2) إنتاج فيروسات الرجعية Supernatants وتنبيغ
- قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، لوحة 4 × 10 6 خلايا كلوة 293T على 100 سم أطباق في DMEM تحتوي على 10٪ FCS والبنسلين / الستربتومايسين و2 مم L-الجلوتامين.
- اليوم التالي، استبدل المتوسطة وبالنقل الخلايا مع mutagenized مكتبة pMSCV-JAK2-V617F. لكل 10 سم لوحة، وخلط 10 ميكروغرام من الحمض النووي (5 ميكروغرام من مكتبة البلازميد و 5 ميكروغرام من التعبئة والتغليف فيروسات البلازميد، pCLEco) مع 40 ميكرولتر من FuGENE إلى إجمالي حجم 400 ميكرولتر باستخدام المصل وسائل الاعلام DMEM مجانا. احتضان هذا المزيج DNA والدهون لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 دقيقة إضافة قطرة-DNA الدهون المعقدة الحكيم على رأس خلايا HEK293T.
- بعد ستة ساعة، وتغيير وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ثإيث وسائل الإعلام الجديدة واحتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية لإنتاج الفيروس. بعد 48 ساعة من الحضانة، وجمع supernatants الفيروسية التي تمت تصفيتها من خلال مرشح 0.45 ميكرون acrodisc.
3.3) اختيار النسخ مقاومة في المختبر
- لمقاومة المسوخ JAK2-V617F المخدرات، تنبيغ 100 مليون BAF3 خلية مع 100 مل من supernatants الفيروس وجود عيار الفيروسية من 0.5-1 X10 6. وبشكل أكثر تحديدا، مزيج 10 8 الخلايا مع 100 مل من طاف الفيروس إلى إجمالي حجم 300 مل باستخدام وسائل الإعلام RPMI، تحتوي على 10٪ مصل و 24 ميكروغرام / مل من polyberene (تركيز النهائي من ployberene هو 8 ميكروغرام / مل). توزيع هذه خلاطات خلية في عدة ست لوحات جيدة (4-5 مل لكل بئر).
- أجهزة الطرد المركزي لوحات في 1،250 x ج لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- اليوم التالي، تجميع الخلايا معا وتخلط مع Ruxolitinib والمتوسطة التي تحتوي على أجار لينة ومطلي في سيس لوحات جيدة. لكل تركيز الدواء، مزيج 10 مل من خلايا BAF3 transduced (10-20 مليون خلية) مع كمية مناسبة من Ruxolitinib في أنبوب 50 مل. جعل يصل حجم إلى 40 مل باستخدام RPMI تحتوي على 20٪ مصل. إضافة 10 مل من 1.2٪ أجار إلى الخلايا، وmixcarefully لوحة في ست لوحات جيدة.
- احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين. اختيار المستعمرات المقاومة باستخدام 0.2 مل نصائح ماصة والثقافة الفرعية منهم على حدة في 24 لوحات جيدا لمدة 3-4 أيام.
- حصاد الخلايا BAF3 المقاومة عن طريق الطرد المركزي في 450 x ج لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. عزل الحمض النووي الجيني باستخدام الجينومية عدة عزل الحمض النووي التجارية. PCR تضخيم كامل طول JAK2 [كدنا من 100 نانوغرام من الحمض النووي باستخدام بادئات الجينومية (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG وmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) وقالب الطويل توسيع أنظمة PCR عالية الدقة.
- فصل المنتجات PCR من قبل الاغاروز الكهربائي للهلام. استئصال 3.4 كيلوبايت من الفرقة DNA تمثل JAK2 إطار الترميز وعزل DNAاستخدام عدة استخراج الهلام التجارية. تسلسل كامل طول كدنا] باستخدام 8 الاشعال الداخلية (P1 - P8) تمتد تسلسل الترميز وتحليل تسلسل باستخدام البرمجيات التجارية.
4. في المختبر التحقق من الطفرات المقاومة لل
العديد من الحيوانات المستنسخة خلية تحمل التحور أكثر من واحد، لاختبار مساهمة كل طفرة في مقاومة النمط الظاهري، وتوليد المتغيرات مختارة من قبل الطفرات موقع الموجه باستخدام pMSCV-617F-JAK2V بلازميد كقالب.
- أداء الموقع الطفرات الموجهة على pMSCV-JAK2-V617F البلازميد باستخدام طقم الطفرات التجارية و[أليغنوكليوتيد تهدف إلى خلق طفرات نقطة. تأكيد الهويات من الحيوانات المستنسخة طافرة من التسلسل.
- تنبيغ الخلايا BAF3 مع الفيروسات القهقرية التي تستخدم فيها البلازميدات متحولة يتبع مع اختيار باستخدام بوروميسين في 1μg / مل.
- لوحة 10 4 خلايا BAF3-JAK2-V617F (50 ميكرولتر من RPMI مع 10٪ FCS) في كل بئر من 96 لوحة جيدا. فصللاي إضافة 50 ميكرولتر من ruxolitinib تحتوي على وسائل الإعلام إلى الآبار عبر لوحة (تركيز النهائي: 0، 1، 3، 5، 10، و 20 ميكرومتر)، واحتضان لوحات لمدة 60 ساعة على 37 درجة مئوية.
- تقييم بقاء الخلية من خلال إضافة 10 ميكرولتر من WST-1 الكاشف لكل يتبع بشكل جيد مع الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة. الامتصاصية سجل في A450 باستخدام قارئ لوحة. أداء جميع المقايسات في ثلاث نسخ ومؤامرة متوسط الامتصاصية ضد INCB018424 تركيزات. إجراء منحنى السيني أفضل مناسبا باستخدام منحنى غير الخطية الخوارزمية المناسب. يسجل تركيز الدواء مما أسفر عن 50٪ بقاء الخلية مثل IC50 الخلوية.
- التالي، لوحة ستة ملايين BAF3 الخلايا معربا عن المتغيرات JAK2 في ست لوحات جيدة في RPMI المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل مع زيادة تركيزات ruxolitinib وحضنت لمدة 4-6 ساعة عند 37 ° C.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية. غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وليز في 20 ملي تريس، الكلور (درجة الحموضة 7.5)، 50مم كلوريد الصوديوم، 1٪ NP-40، 0.1٪ SDS، 5 ملي EDTA، 1MM EGTA، 1 ملم فلوريد الصوديوم، 2 ملي الصوديوم فانادات، و 5٪ الجلسرين تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز ومثبطات إنزيم الفوسفاتيز. يصوتن تعليق خلية لمدة 1 دقيقة تليها إضافة 5X عازلة هلام تحميل (350 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك [الرقم الهيدروجيني 6.8]، 500 ملي DTT، 15٪ SDS، 10 ملي Benzamidine، 5 ملي EDTA، 5 ملي EGTA، 5 ملي الصوديوم فانادات ، البروتياز الكوكتيل، 50٪ الجلسرين، و 0.001٪ برموفينول الأزرق) وتمسخ عند 70 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
- حل البروتينات على 8٪ SDS بولي أكريلاميد هلام في ظل ظروف تغيير طبيعة. أداء immunoblotting مع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للphopsho STAT5. تجريد البقع وreprobed مع الأرنب بولكلونل مكافحة SATA5 الأجسام المضادة. تصور العصابات باستخدام الكواشف ECL وفقا لتوصية المورد.
5. في فيفو التحقق من صحة
- تنبيغ الخلايا BAF3 التعبير و luciferase الكرز (transduced مع الفيروسات القهقرية مصنوعة من pMSCV لوك-شيرراي GW) مع الفيروسات معربا عن JAK2-V617F والمتغيرات مقاومة. حدد الخلايا التي تعيش اختيار بوروميسين للتعبير عن JAK2 والمتغيرات مقاومته.
- ضخ مليوني بنشاط متزايد خلايا / الكرز BAF3 لوك تحمل JAK2-V617F والمتغيرات مقاومة في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ل6 الفئران BALB / C عن طريق حقن الوريد الذيل.
- بعد ثلاثة أيام من زرع الخلايا، وحقن الفئران مع Ruxolitinib (100 ملغ / كلغ) مرتين يوميا لمدة أسبوعين.
- أداء القائم على luciferase المراسل التصوير تلألؤ بيولوجي مع نظام التصوير. .
- وباختصار، وإعداد حل وسيفيرين عن طريق إذابة 300 ملغ إلى 25 مل من الماء منزوع الأيونات عقيمة، قسامة في أحجام أصغر وتخزينها.
ملاحظة: مخزن وسيفيرين في -80 درجة مئوية، وحماية من الضوء حتى الاستخدام. - ضخ 250 ميكرولتر لكل الماوس عن طريق IP لتحقيق 125 مغ / كغ في كل فأر. تخدير الفئران من نفس المجموعة معا باستخدام الأيزوفلورين استنشاقه (1.5٪ -2.0٪) في صندوق مغلق. تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني على الالبريد العين لمنع جفاف.
ملاحظة: الوقت الذي يستغرقه لالفئران للنوم (10-15 دقيقة) سمحت النشاط وسيفيرين إلى الذروة. الحفاظ على الوقت متناسقة بين المجموعات لتجنب الاختلاف.
- وباختصار، وإعداد حل وسيفيرين عن طريق إذابة 300 ملغ إلى 25 مل من الماء منزوع الأيونات عقيمة، قسامة في أحجام أصغر وتخزينها.
- نقل الفئران على الفور إلى غرفة التصوير المرحلة والحفاظ على التخدير في 1.5-2٪ isofluorane خلال إجراءات التصوير. الفئران صورة مع متسلسل 0.1، 0.5، 1، 5، 30، 60، و 300 التعرض ثانية. التقط صورا وquantitate شدة تلألؤ بيولوجي باستخدام الحصول على الصور وبرامج التحليل. وبعد التصوير عودة الفئران إلى قفصه.
- ل، في الجسم الحي الخيمرية حصاد مجموع الخلايا bonemarrow. الموت ببطء الفئران مع CO 2 لمدة 5 دقائق تليها مع خلع عنق الرحم. حصاد العظام وسحق في 4 مل PBS الباردة لجمع نخاع العظام. تحليل الخلايا إيجابية في المئة الكرز تحت المجهر مضان وتحديد باستخدام FACS. جمع عشرين ألف الأحداث من كل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ظهور الطفرات الوراثية يشكل تحديا كبيرا للعلاج استهدفت مكافحة كيناز. دراسات طفرية، إلى جانب توفير رؤى الميكانيكية والوظيفية التي هي مفيدة في اختيار وتصميم تطوير الأدوية من الجيل التالي، كما يسمح أفضل التدبير العلاجي السريري وربما في المستقبل سيكون أكثر فائدة للعلاج شخصية. في هذه التجربة، وتبين لنا الكشف عن الطفرات المقاومة ruxolitinib في JAK2-V617F كيناز (الشكل 1). اقمنا ناقلات pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway من خلال إدخال كامل طول الماوس JAK2-V617FcDNA إلى pMSCV-الكرز-GW. فمن المستحسن استخدام المضيف البكتيري (XL-1 سلالة الأحمر كولاي) لتطوير الطفرات العشوائية على الخيار الأكثر شعبية من طريقة، وهو PCR، نظرا لحدوده المرتبطة التحيز تسلسل الجينات وأكبر شظايا يصعب تضخيم . تم transfected مكتبة DNA mutagenized بشكل عشوائي لخلايا HEK293T لإنتاج الفيروس الارتجاعي. هذه فير متحولةاستخدمت الاستخدامات، تنبيغ الخلايا BAF3 الذين تم اختيارهم للنمو مستعمرة في لينة أجار في غياب IL-3 مع 1 أو 5 ميكرومتر من Ruxolitinib. في ظل هذه الظروف، تنشأ مستعمرات فقط من خلايا تحمل cDNAs JAK2V-617F التي تعبر عن البديل وظيفية ومقاومة للكيناز. وبعد 10 - 14 يوم، كان قد تم اعتقالهم المستعمرات الفردية فصل جيدا، والتي تختلف في الحجم، وتوسيع لهم في الثقافة السائلة. تم عزل الحمض النووي الجينوم من هذه الخلايا. تم العثور على طليعة الفيروس عن طريق الإنقاذ المباشر أو عن طريق PCR. والتسلسل في proviruses تعافى لتحديد الطفرات (الشكل 1). وأجريت تحاليل تسلسل باستخدام حزمة DNASTAR من Lasergene.
لأن العديد من الحيوانات المستنسخة خلية نفذت تحور أكثر من واحد، ونحن نوصي بشدة التحقق من صحة هذه الطفرات في عزلة من قبل كل من في المختبر والمقايسات الجسم الحي (أرقام 2 و 3). للتحقق من النشاط من المتغيرات في عزلة،المتغيرات المختارة تم إنشاؤها من قبل الموقع وجهت الطفرات في تسلسل JAK2V-617F. وقد أعاد هذه المتغيرات إلى خلايا BAF3، وقياس قدرة تكاثر الخلايا في جرعات مختلفة من Ruxolitinib لتقييم IC50 (قيم IC50، الشكل 2A). يتم إجراء فحوصات البيوكيميائية لفسفوتيروزين أو الفوسفات-STAT5 عن طريق تحليل طخة مناعية على لست] البروتينية للخلايا BAF3 التي حضنت مع زيادة جرعة من Ruxolitinib لاستبعاد أي بعيدا عن المرمى المقاومة بوساطة (الشكل 2B). وهكذا أكد المسوخ اظهار تعزيز القيم IC50 وautophosphorylation المستمر في تركيزات أعلى Ruxolitinib أن تكون المتغيرات المقاومة للأدوية. لأن تظهر العديد من الطفرات المقاومة الاستجابة للجرعة متغير، وبالتالي فإنه لا بد من اختبار ما إذا كانت هذه الطفرات سوف تمنح في مقاومة الجسم الحي أيضا. عادة، ونحن نوصي لاختبار فقط 2 -3 المتغيرات المختلفة للتجارب في الجسم الحي، كما أنها مكلفة وشاقة. للتحقق من صحة المقاومة في الجسم الحي، والمهندسة خلايا BAF3 للتعبير عن المتغيرات JAK2-V617F وluciferase المراسل / الكرز لتمكين في الجسم الحي تتبع. تم حقن الفئران مع 1-2 مليون خلية الكرز الإيجابية (التعبير عن المتغيرات JAK2 وluciferase المراسل)، تليها حقن Ruxolitinib لمدة أسبوعين. بعد أسبوعين، تم تصوير الفئران لالمحفز luciferase المراسل تلألؤ بيولوجي (الشكل 3)، وأيضا لBAF3 الخيمرية في bonemarrow والدم المحيطي من خلال قياس مضان من خلايا إيجابية الكرز (الشكل 3). الفئران معربا عن JAK2-V617F حساسة للRuxolitinib، في حين تشير المتغيرات مقاومة الزيادة التدريجية في تلألؤ بيولوجي خلال الفترة من العلاجات، مما يشير إلى أن الخلايا BAF3 معربا عن JAK2-V617F البديل هو مقاومة للعلاج Ruxolitinib في الجسم الحي.
الشكل 2: مخطط يظهر في التحقق من صحة المختبر باستخدام جرعة تعتمد فحوصات تكاثر الخلايا (A) والغربي النشاف (B) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل (3): تمثيل تخطيطي من التحقق من صحة في الجسم الحي باستخدام luciferase المراسل حفز قياس تلألؤ بيولوجي. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثبتت نجاح السريري للإيماتينب في علاج CML ليس فقط إمكانية استهداف تحركات شفتين بواسطة مثبطات جزيء صغير، ولكن القيود كشفت أيضا العلاج المستهدفة: الانتكاس السريري وظهور الطفرات المقاومة للأدوية في الجينات المستهدفة. تحديد الطفرات المقاومة يساعد في تحسين إدارة السريرية وتطوير مثبطات الجيل القادم. يصف هذا البروتوكول منهجية لتحديد الطفرات المقاومة للأدوية في الجينات المستهدفة. يستخدم هذا الأسلوب مكتبة البلازميد mutagenized عشوائيا بنيت في E. القولونية، للتعبير عن البروتينات متحولة. ثم يتم إدخال المكتبة في BAF3 الخلايا (عرضة للتحول من قبل الجين الورمي)، ثم مع مجموعة من الحيوانات المستنسخة خلية في وجود وكلاء العلاج الكيميائي. تسلسل الجينات المستهدفة من الحيوانات المستنسخة مقاومة يحدد الطفرات منح المقاومة. وأخيرا، والطفرات التي تم تحديدها هي صوغه من قبل الموقع وجهت الطفرات للتحقق من صحة لهم لالمقاومة للأدوية.
باستخدام هذه الاستراتيجية حددنا الطيف من الطفرات في JAK2 وBCR / ABL يمنحها القدرة على مقاومة Ruxolitinib وإيماتينب، على التوالي. حددنا أكثر من مائة الطفرات في BCR / ABL. الى جانب ذلك، تحديد جميع الطفرات الكبرى في الكشف عن المرضى، سمح طريقة الفرز دينا لنا لتحديد بدائل رواية بقايا داخل وخارج المجال كيناز على حد سواء. ومن المثير للاهتمام، وقد تم تحديد جميع الطفرات من الشاشة لدينا في عينات من المرضى ولكن هذه العملية استغرق ما يقرب من أكثر من 10 عاما من 15، مما يدل على قدرة هذه الشاشة لاستباق التحولات التي من شأنها أن تشكل مقاومة المخدرات إشكالية سريريا. في حين فحص مقاومة باستخدام الطفرات العشوائية يوفر العديد من المزايا بالمقارنة مع الطرق الأخرى، وهناك المزالق المحتملة أن تكون على علم عند اتباع إجراء الفحص. لأي الفرز، فمن المستحسن لBAF3 الخلايا لأنها تعتمد بشكل كامل على الهدف الذي ريسي ضديلتمس الموقف. فشل أو الاعتماد الجزئي على الجين المستهدف قد لا تتطور الحيوانات المستنسخة المقاومة الحقيقية وعلى الأرجح تطوير ايجابيات كاذبة. على سبيل المثال، كان أداء أربع دراسات مختلفة فحص مقاومة ضد مثبطات JAK2 باستخدام BAF3 خلايا transduced مع أي EPO أو مستقبلات MPL لتسهيل JAK2-V617F الاعتماد 16-19. وقد تم تحديد ثمانية فقط طفرات مقاومة تقتصر على كيناز المجال من هذه الشاشات، على الرغم من أن العديد من الحيوانات المستنسخة المقاومة وضعت تفتقر إلى الطفرات، ويفترض بسبب ظهور ايجابيات كاذبة، الذي ينسب إلى heterodimerization من JAK1 وJAK3 مع مستقبلات خلوى. لذلك، لتجنب فقدان JAK2 الاعتماد أجرينا فحص مقاومة في BAF3 العادي والتي أظهرت مجموعة قوية من الحيوانات المستنسخة مقاومة ضد Ruxolitinib وجميع هذه الحيوانات المستنسخة أظهرت وجود طفرات مقاومة. وبناء على هذه الملاحظات، من أجل تسخير الطيف الكامل من الطفرات المقاومة، ونحن نوصي أن الخلية BaF3الصورة يجب أن يكون معتمدا بشكل كامل على كيناز المستهدفة لتجنب ظهور ايجابيات كاذبة، كما كانت قاعدة في العروض مقاومة سابقة أجريت ضد مثبطات JAK2 16،17. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان لتجنب الظروف ثقافة السائبة التي يتم تجميع الخلايا إيواء الطفرات المختلفة معا، والسماح للتوسع في الثقافة السائلة، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى هيمنة نسيلي من عدد قليل من المتغيرات عالية المقاومة للأدوية. على سبيل المثال، خلال الاختيار المبدئي لإيماتينب مقاومة من mutagenized BCR-ABL في الثقافة السائلة السائبة، وجدنا سوى 4 أشكال متحولة التي مثلت عدة مرات ضمن أول 100 يعزل نحن التسلسل. لذلك، وفحص باستخدام أجار لينة تسمح بطيئة استنساخ المتنامية مع درجات أكثر تواضعا من مقاومة الأدوية التي سيتم استردادها من شأنه أن لا يتم تحديدها باستخدام الثقافة السائبة. لهذا السبب، فمن المستحسن أن تنمو ثقافة الأكبر قبل اختيار فقط ل14 إلى 16 ساعة، ثم مع اختيار المخدرات دون IL3 في أجار لينة. في السابق لدينالمضاعفات، وتزايد الثقافات التي تتجاوز 36 ساعة بعد تنبيغ الفيروسية تميل الى ان تكون تهيمن عليها استنساخ التكاثري للغاية، الأمر الذي يشكل خطرا على تفقد الحيوانات المستنسخة بطيئة النمو (تحولي ضعيف). وبالمثل، وذلك باستخدام خلايا من نقطة زمنية سابقة مثل 6-8 ساعة بعد تنبيغ الفيروسية عرضة لتحديد لاستنساخ تحويلية عالية أو overexpressing، مما تسبب في وجود تحيز وتحريف في الهوية وتردد من الحيوانات المستنسخة المقاومة. ولذلك، فإننا نوصي باستخدام الخلايا المزروعة عن 14-16 ساعة بعد تنبيغ الفيروسية للفحص، والذي يوفر تشكيلة وضيقة من الحيوانات المستنسخة الفردية ويمنع هيمنة نسيلي لوحظ عادة في الثقافات السائل بكميات كبيرة.
ومن الضروري لتأكيد قدرة طفرة المرشح للتشاور المقاومة في العزلة، منذ تم تحديد بعض الحيوانات المستنسخة لطفرات متعددة. للعرض على الشاشة JAK2-V617F، ونحن صوغه أغلبية الطفرات التي تم تحديدها من مكتبة الطفرات العشوائية لدينا باستخدام الموقع موجهة mutagenesis. بعد إدخال المسوخ معزولة إلى خلايا جديدة، وكانوا ثم نمت في ظل وجود العديد من الأدوية لتحديد IC50s لكل متحولة. نحن أيضا اختبار الخيارين مقاومة مختلفة للمقاومة في الجسم الحي من خلال رصد تلألؤ بيولوجي لزيادة تأكيد قدرة هذه الطفرات واحدة لإحداث مقاومة الأدوية في الجسم الحي.
ونظرا لنجاح العلاج المضاد للكيناز في علاج السرطانات التي حفزت موجة من مثبطات كيناز في العيادات، من الأهمية بمكان لتحديد المقاومة إشكالية سريريا منح الطفرات لإدارة أفضل للمرضى والمخدرات النامية التي يمكن استهدافهم. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية بنجاح الفحص لتحديد الطفرات في BCR / ABL، JAK2 وFLT3 20؛ ومع ذلك، فإننا نعتقد أنه سيكون ينطبق بشكل عام على مجموعة واسعة من مضادات الأورام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
- Huse, M., Kuriyan, J.
- Melnikova, I., Golden, J.
- Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
