Summary
Surgimento de resistência genética a terapia com inibidor da quinase poses desafio significativo para a terapia do cancro eficaz. Identificação e caracterização de mutações resistentes contra uma droga recém-desenvolvido ajuda na melhor gestão clínica e concepção de medicamentos próxima geração. Aqui, descrevemos o nosso protocolo de rastreio in vitro e validação das mutações resistentes.
Abstract
A descoberta de BCR / ABL como um oncogene condutor na leucemia mielóide crónica (LMC), resultou no desenvolvimento de Imatinib, o qual, na verdade, demonstraram o potencial do alvo a quinase em cancros por tratar eficazmente os pacientes de CML. Esta observação revolucionou o desenvolvimento de drogas para alvejar as quinases oncogénicas implicados em várias outras doenças malignas, tais como, o EGFR, B-RAF, KIT e PDGFRs. No entanto, uma grande desvantagem de terapias anti-quinase é o aparecimento de mutações de resistência a drogas que tornam o alvo ter reduzido ou perdido afinidade para a droga. A compreensão dos mecanismos empregados pela variantes resistentes não só ajuda no desenvolvimento dos inibidores de nova geração, mas também dá impulso à gestão clínica usando a medicina personalizada. Nós relatou uma estratégia de rastreamento retroviral vector base para identificar o espectro de resistência conferindo mutações no BCR / ABL, o que tem ajudado no desenvolvimento da próxima geração BCR / ABL inibidores. Usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, aqui descrevemos em métodos de rastreio in vitro que utiliza as células do rato BAF3 expressam a biblioteca mutação aleatória de JAK2 quinase.
Introduction
As proteína-quinases são enzimas reguladoras-chave de vias intracelulares de transdução de sinal que aparentemente modulam cada função celular. Um controle adequado da quinase mediada sinalização é fundamental para a homeostase e desenvolvimento, que se baseia principalmente na regulamentação adequada de quinases, fosfatases e sua degradação por UPS (sistema ubiquitina proteassoma). Quinases desregulados estão no centro do palco de muitos cânceres e envolvida em série de doenças humanas 1. Genoma humano codifica mais de 500 proteínas cinases que foram ligadas, directa ou indirectamente, para ~ 400 doenças humanas 2. Estas observações suportado o conceito para direccionamento terapêutico de cinases por pequenas moléculas inibidoras 3-5.
A demonstração de inibidores da quinase ABL, tais como imatinib, no tratamento de leucemia mielóide crónica (LMC) forneceu a prova de conceito para esta abordagem 6,7. Esta observação não só revolucionou a formigai-quinase terapêutica mas também aplicada a ideia para identificar as lesões genéticas em outras doenças neoplásicas para direccionamento terapêutico, que levam à descoberta de mutações oncogénicas em JAK2 de policitemia vera (PV) e os pacientes com neoplasias mieloproliferativas (NMP). Esta descoberta gerou grande interesse no tratamento MPNs alvejando JAK2 com inibidores da quinase de moléculas pequenas. Agora, quase uma dúzia de inibidores de JAK2 estão em ensaios clínicos, e um deles foi aprovado recentemente para o tratamento de mielofibrose. Enquanto direccionamento específico de quinases oncogénicas por pequenas moléculas inibidoras em cancros trazer resultados promissores, também sofre de desenvolvimento de resistência ao tratamento. De facto, até agora, os pacientes tratados com inibidores de cinase, tais como imatinib, gefitinib, erlotinib e dasatinib mutações de resistência desenvolvida principalmente através da aquisição de mutações no domínio de cinase de droga que tem como alvo 8-10. Resistência como resultado de mutação genética destaca as limitações de of monoterapia alvo contra as quinases oncogénicas, e representa o seguinte desafio para o desenvolvimento de quimioterapia do cancro cada vez mais bem sucedidos. Consequências mecanicistas e funcionais de resistência aos medicamentos deve fornecer uma justificação para a selecção e design de compostos de cortesia para o desenvolvimento de drogas. As mutações identificadas via telas in vitro, mostraram um alto grau de correlação com os encontrados em pacientes. Portanto, rastreio in vitro para mutações que conferem resistência aos fármacos para um dado alvo pares droga auxilia em desenvolvimento clínico ou pré-clínicos em identificar os padrões de resistência que são susceptíveis de causar recaída clínica. A identificação dessas formas mutantes não só é útil no acompanhamento dos pacientes para a resposta à droga e recaída, mas também essencial para a concepção de inibidores mais robustos de próxima geração. Por exemplo, o desenvolvimento de inibidores BCR / ABL próxima geração, o nilotinib e ponatinibe, foram possíveis por causa da maior mecentendimentos hanistic adquirida com mutagênese, estrutural, e estudos funcionais.
Anteriormente, relataram os resultados de nossa tela usando mutagênese aleatória de BCR / ABL para revelar o espectro de mutações de resistência aos inibidores tais como Imatinib 11,12, PD166326 12 e 13 AP24163. Os resultados não só identificou as mutações que conferem resistência e recidiva da doença clínica, mas também forneceu a compreensão mecanicista da resistência e dos princípios que regem a função quinase 11,14 drogas. Aqui nós fornecemos detalhes metodológicos adicionais, usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, para permitir uma aplicação mais ampla dessa estratégia de triagem.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos deste protocolo foram conduzidos de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o tratamento ético e tratamento dos animais, e de acordo com um protocolo de uso de animais IACUC aprovado.
1. Linha celular de manutenção
- Culturas de células BAF3 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml e 100 ug / ml) e meio de cultura gasto de células WEHI. Cultivar células HEK293T em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml e 100 ug / ml). Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2.
2. Construção de plasmídeo
- Clonar o rato JAK2 e JAK2 sua isoforma oncogénica-V617F em pMSCV-puro-GW por clonase LR, utilizando um processo de recombinação de clonagem padrão.
- Para a construção do vector de expressão de luciferase (Luc-pMSCV-Cherry-GW) utilizado na in-viimagiologia vo, amplificar a luciferase de pLVX-Tet-ON vector por PCR utilizando iniciadores (LUC-SD / RP-LUC TTACAATTTGGACTTTCCG e SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) seguido pela clonagem em pENTR-SD-TOPO para gerar pENTR-Luc, que é usada para transferir o gene de luciferase em vector retroviral, pMSCV-Cherry-GW de clonagem por recombinação mediada usando clonase LR.
3. Preparação da Random Mutation Library, Triagem e identificação das Mutações
3.1) A mutagénese aleatória
- Comprimento total Clone de JAK2 tipo selvagem e a mutação V617F em pMSCV-puro-GW retroviral vector usando uma tecnologia de recombinação clonagem comercial.
- Use 1 ug de ADN plasmídeo de JAK2 V617F-se transformar, XL-1 Vermelho, E. coli, que é defeito nos mecanismos de reparo do DNA permitindo-lhes incorporar mutações aleatórias durante a replicação. Mais especificamente, mistura 50 - 100 ng de ADN (mais do que 100 ng de ADN diminui a eficiência de transformação) com 100 ul de células competentes de um tubo de polipropileno pré-gelada e incubadas em gelo durante 30 min, agitando suavemente a cada 5 min. Para uma boa cobertura a biblioteca, utilizam 4-6 tubos de células competentes.
NOTA: mais do que 100 ng de ADN diminui a eficiência de transformação - Mergulha-se o tubo num banho de água a 42 ° C durante um choque térmico de 45 seg e incubar em gelo durante 2 min. Em seguida, adicionar 1 ml de meio SOC (2,0% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,05% de NaCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4, e 0,4% de D-glucose). Incubar o tubo a 37 ° C enquanto agitando a 225-250 rpm durante 90 min.
- Placa células de cada tubo em quatro placas de 10 cm de LB-ágar contendo 100 ug / ml de ampicilina. Incubar as placas durante 16-24 horas a 37 ° C.
- Seguindo colónias visíveis, coletá-los raspando as placas com uma placa raspador estéril. Piscina células de cada placa e isolar o ADN de plasmídeo utilizando um kit de extracção de plasmídeo comercial.
NOTA: Normalmente, as colônias são menores e tomar 18-24 horas para servisível, porque estes são crescentes estirpes bacterianas lentas. Nesta fase, avaliar a heterogeneidade de mutações na biblioteca por digestão de restrição com um cortador frequente, tais como Sau3A1 ou Taq1 ou sequenciação.
3.2) A produção de retrovirais sobrenadantes e transdução
- Um dia antes da transfecção, placa de 4 x 10 6 células HEK 293T Onto 100 centímetros pratos em DMEM contendo 10% de FCS, penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina.
- No dia seguinte, substituir o meio e transfecção das células com mutado biblioteca pMSCV-JAK2-V617F. Para cada placa de 10 cm, misturar 10 ug de ADN (5 ug da biblioteca de plasmídeo e 5 ug de plasmídeo de empacotamento retroviral, pCLEco) com 40 ul de FuGENE para um volume total de 400 ul utilizando meio DMEM livre de soro. Incubar a mistura de ADN e de lípido durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após 20 min adicionar a queda complexo DNA-lipídico sábio em cima de células HEK293T.
- Após seis horas, mudar o meio de transfecção wom meios frescos e incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C para a produção de vírus. Após 48 horas de incubação, recolher os sobrenadantes virais filtradas através de um filtro de 0,45 um Acrodisc.
3.3) Seleção de clones resistentes In Vitro
- Para mutantes resistentes à JAK2 V617F-droga, a transdução de 100 milhões de células BAF3 com 100 ml de sobrenadantes de vírus com um título virai de 0,5-1 x 10 6. Mais especificamente, misturar 10 8 células com 100 ml de sobrenadante do vírus para um volume total de 300 ml, utilizando meio RPMI, contendo soro a 10% e 24 ug / ml de polyberene (concentração final de ployberene é de 8 ug / ml). Distribuir estes misturadores de células em placas de seis poços múltiplos (4-5 ml por poço).
- Centrifuga-se as placas a 1.250 xg durante 90 min a 25 ° C. Após centrifugação, incubar as placas a 37 ° C durante 24 horas.
- No dia seguinte, reunir as células e misture com Ruxolitinib e meio contendo agar macio e banhado em six placas de poços. Para cada concentração de fármaco, misturar 10 mL de células BAF3 transduzidas (10-20 milhões de células) com a quantidade adequada de Ruxolitinib em um tubo de 50 ml. Completar o volume de 40 ml, utilizando RPMI contendo 20% de soro. Adicionar 10 ml de 1,2% de agar para as células, e mixcarefully placa em placas de seis poços.
- Incubar as placas a 37 ° C durante duas semanas. Escolha as colónias resistentes, utilizando 0,2 ml pontas para pipetas e sub-cultura-los individualmente em placas de 24 poços para 3-4 dias.
- Colher as células BAF3 resistentes por centrifugação a 450 xg durante cinco minutos à temperatura ambiente. Isolar o ADN genómico utilizando um kit comercial de isolamento de ADN genómico. PCR amplificar comprimento total JAK2 cDNA a partir de 100 ng de DNA genômico utilizando primers (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG e mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) e longa-template expandir sistemas de PCR de alta fidelidade.
- Separa-se os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose. Extirpar o 3.4 kb de banda DNA representando JAK2 quadro de codificação e isolar o DNAutilizando um kit de extracção de gel comercial. Sequência de todo o comprimento do cDNA utilizando 8 primers internos (P1 - P8) que mede a sequência de codificação e analisar seqüências usando software comercial.
4. Validação in vitro de mutações resistentes
Muitos clones de células transportar mais do que uma mutação, Para testar a contribuição de cada mutação no fenótipo de resistência, gerar variantes seleccionadas por mutagénese dirigida a um local utilizando pMSCV-JAK2V-617F plasmídeo como modelo.
- Realizar mutagénese dirigida em pMSCV-JAK2 V617F-plasmídeo utilizando um kit de mutagénese comercial e oligonucleótidos concebidos para criar mutações pontuais. Confirme as identidades dos clones mutantes por sequenciação.
- Transdução de células BAF3 com retrovírus feita usando plasmídeos mutantes seguiram com a seleção usando �puromicina em 1 ug / ml.
- Placa 4 10 células BAF3-JAK2 V617F (50-ul de meio RPMI com FCS a 10%) em cada poço de uma placa de 96 poços. Separadoly adicionar 50 ul de meio contendo o ruxolitinib aos poços ao longo da placa (concentração final: 0, 1, 3, 5, 10, e 20 uM), e incuba-se as placas durante 60 horas a 37 ° C.
- Avaliar a viabilidade das células por adição de 10 ul de reagente WST-1 a cada poço, seguido de incubação com a 37 ° C durante 2-4 horas. Ficha absorvância a A450 usando um leitor de placas. Realizar todos os ensaios em triplicado e enredo média absorção contra concentrações INCB018424. Realize uma curva sigmoidal melhor ajuste usando um algoritmo de ajuste de curva não-linear. Conseguir a concentração de droga que resulta em 50% de viabilidade celular como a IC50 celular.
- Em seguida, placa seis milhões de células BAF3 que expressam variantes de JAK2 em placas de seis poços em meio RPMI contendo 10% de soro com concentrações crescentes de ruxolitinib e incubadas durante 4-6 horas a 37 ° C.
- Recolher as células por centrifugação a 450 xg durante cinco minutos a 4 ° C. Lavar as células uma vez com PBS, e lise em 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 5 mM de EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM de fluoreto de sódio, 2 mM de vanadato de sódio, e 5% de glicerol suplementado com inibidores de cocktail inibidor de protease e fosfatase. Sonicar a suspensão de células durante 1 min, seguido por adição de tampão de carregamento de gel 5x (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM de DTT, 15% de SDS, 10 mM de benzamidina, 5 mM de EDTA, 5 mM de EGTA, 5 mM de vanadato de sódio , Protease Cocktail, 50% de glicerol, e azul de bromofenol a 0,001%) e desnaturação a 70 ° C durante 5-10 min.
- Resolver as proteínas em um gel de poliacrilamida SDS 8% em condições de desnaturação. Execute immunoblotting com anticorpo monoclonal anti-phopsho STAT5. Tira as manchas e sondado com um anticorpo policlonal de coelho anti-SATA5. Visualize as bandas que utilizam reagentes ECL de acordo com a recomendação do fornecedor.
5. In Vivo de validação
- Transdução de células que expressam BAF3 luciferase e cereja (transduzidas com retrovírus feitos de pMSCV-Luc-cherry GW) com vírus que expressam JAK2-V617F e variantes resistentes. Seleccionar células que sobrevivem puromicina selecção para a expressão de JAK2 e suas variantes de resistência.
- Injectar dois milhões de células em crescimento activo / cereja BAF3-Luc-JAK2 V617F que transportam e as suas variantes resistentes em 200 ul de PBS a 6 ratinhos Balb / c por via injecção venosa da cauda.
- Depois de três dias de transplantes de células, injectar os ratinhos com Ruxolitinib (100 mg / kg) duas vezes por dia durante duas semanas.
- Execute-base luciferase bioluminescência de imagem com um sistema de imagem. .
- Em resumo, preparar solução luciferina dissolvendo 300 mg a 25 ml de água deionizada estéril, da alíquota em volumes e loja de menores.
NOTA: luciferina Armazenar a -80 ° C e protegido da luz até à utilização. - Injectar 250 ul a cada rato por IP para conseguir 125 mg / kg em cada rato. Anestesiar os ratos do mesmo grupo em conjunto, utilizando isoflurano inalado (1,5% -2,0%) em uma caixa selada. Aplicar vet pomada em the olho para evitar ressecamento.
NOTA: O tempo necessário para que os ratos de dormir (10-15 min) permitiu atividade luciferina a pico. Mantenha o tempo consistente entre os grupos para evitar variação.
- Em resumo, preparar solução luciferina dissolvendo 300 mg a 25 ml de água deionizada estéril, da alíquota em volumes e loja de menores.
- Transferir os ratos imediatamente a fase câmara de imagem e manter a anestesia em 1,5-2% de isofluorano durante os procedimentos de imagiologia. Ratinhos imagem sequencial com 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, e 300 segundos de exposição. Capturar imagens e quantificar a intensidade de bioluminescência usando aquisição de imagem e software de análise. Na sequência de imagens devolver os ratos volta a sua jaula.
- Para, células de medula óssea no total in vivo quimerismo colheita. Eutanásia os ratos com CO 2 para 5 min seguido com luxação cervical. Colher os ossos e esmagar em 4 ml de PBS frio para recolher a medula óssea. Analisar as células positivas por cento de cereja sob microscópio de fluorescência e quantificar utilizando FACS. Recolha vinte mil eventos de cada amostra.
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Representative Results
Surgimento de mutações genéticas coloca grande desafio para a terapia anti-quinase alvo. Estudos de mutação, além de proporcionar idéias mecanicistas e funcionais, que são fundamentais para a seleção e projeto de desenvolvimento de medicamentos de última geração, também permite uma melhor gestão clínica e pode, no futuro, ser mais útil para o tratamento personalizado. Neste experimento, mostramos triagem para mutações de resistência ruxolitinib em JAK2 V617F-quinase (Figura 1). Construímos pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway vector através da introdução do full-length do mouse JAK2-V617FcDNA em pMSCV-Cherry-GW. Recomenda-se a utilização de acolhimento bacteriana (XL-1 cepa tinta de E. coli) para desenvolver mutações aleatórias sobre a escolha mais popular do método, que é PCR, devido às suas limitações associadas a fragmentos de viés sequência de genes e maior são difíceis para amplificar . Biblioteca de ADN aleatoriamente mutagenizadas foi transfectado para células HEK293T para a produção de retrovírus. Estes vir mutanteutilizações foram usadas para, transduzir as células BAF3 que foram seleccionadas para o crescimento das colónias em agar mole na ausência de IL-3 com 1 ou 5? M de Ruxolitinib. Sob estas condições, só surgem colónias a partir de células que transportem cDNAs JAK2V-617F que expressa a variante funcional e resistente da quinase. Depois de 10 - 14 dias, as colónias individuais bem separadas foram colhidos, que variaram em tamanho, e expandiu-los em cultura líquida. O ADN genómico foi isolado a partir destas células. O pró-vírus foi recuperado através de recuperação directa ou por PCR. Os pró-virus recuperados foram sequenciados para identificar mutações (Figura 1). As análises das seqüências foram realizadas utilizando DNASTAR pacote de Lasergene.
Porque muitos clones de células realizadas mais do que uma mutação, recomendamos validar estas mutações em isolamento, tanto in vitro e em ensaios in vivo (Figuras 2 e 3). Para verificar a actividade de variantes em isolamento,variantes seleccionadas foram gerados por mutagénese dirigida da sequência de JAK2V-617F. Estas variantes foram reintroduzidos nas células BAF3, e medida para a capacidade de proliferação de células em diferentes dosagem de Ruxolitinib para avaliar IC50 (valores de IC50, a Figura 2A). Ensaios bioquímicos são realizadas para fosfotirosina ou fosfo-STAT5 por análise de immunoblot em lisados de proteína das células BAF3 que foram incubadas com o aumento das doses de Ruxolitinib para afastar qualquer mal direcionado resistência mediada (Figura 2B). Os mutantes que exibem valores de IC50 melhoradas e autofosforilação persistente em concentrações mais elevadas Ruxolitinib são, assim, confirmou-se variantes resistentes a drogas. Porque muitas mutações resistentes mostrar resposta à dose variável, portanto, é imperativo para testar se estas mutações irá conferir na resistência vivo também. Normalmente, recomendamos testar apenas 2 -3 variantes diferentes para experimentos in vivo, como eles são caros etrabalhoso. Para validar a resistência in vivo, as células BAF3 foram projetados para expressar variantes JAK2-V617F e luciferase / cereja para habilitar o controle in vivo. Os murganhos foram injectados com 1-2 milhões de cereja células positivas que expressam variantes (JAK2 e luciferase), seguido por injecção Ruxolitinib durante duas semanas. Após duas semanas, os ratos foram fotografadas por bioluminescência catalisada pela luciferase (Figura 3), e também para BAF3 quimerismo no sangue periférico e medula óssea através da medição da fluorescência de células positivas de cereja (Figura 3). Ratos que expressam JAK2 V617F-são sensíveis a Ruxolitinib, enquanto variantes resistentes mostram incremento progressivo na bioluminescência durante o período de tratamento, o que sugere que as células BAF3-expressam JAK2 V617F variante é resistente ao tratamento in vivo Ruxolitinib.
Figura 2:. Um esquema mostrando na validação vitro utilizando doses ensaios dependentes de proliferação celular (A) e western blot (B) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3: A representação esquemática de validação in vivo utilizando luciferase catalisada medição bioluminescência. Por favor, clique aqui para ver um maiorversão desta figura.
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Discussion
O sucesso clínico de imatinib no tratamento da CML demonstrado não só o potencial de atacar as quinases rouge por inibidores de moléculas pequenas, mas também descoberto limitações de terapia direcionada: recaída clínica e aparecimento de mutações de resistência a drogas no gene alvo. Identificação de mutações de resistência ajuda na melhor gestão clínica e desenvolvimento de inibidores de próxima geração. Este protocolo descreve uma metodologia para a identificação de mutações resistentes a drogas no gene alvo. Este método utiliza uma biblioteca mutagenizada aleatoriamente plasmídeo construído em E. coli, para expressar as proteínas mutantes. A biblioteca é então introduzido em células BAF3 (susceptíveis à transformação por um oncogene), seguido de selecção dos clones de células na presença de agentes quimioterapêuticos. A sequenciação do gene alvo a partir de clones resistentes identifica as mutações que conferem resistência. Finalmente, as mutações identificadas são recriados por mutagénese dirigida para validá-los pararesistência a drogas.
Usando esta estratégia, definimos o espectro de mutações no gene JAK2 e BCR / ABL que conferem resistência a Ruxolitinib e de imatinib, respectivamente. Foram identificados mais de cem mutações no BCR / ABL. Além disso, a identificação de todas as principais mutações detectadas em pacientes, o nosso método de triagem nos permitiu identificar novos substituições de resíduos dentro e fora do domínio quinase. Curiosamente, todas as mutações da nossa tela foram identificados em amostras de doentes, embora este processo levou quase mais de 10 anos a 15, demonstrando assim a capacidade desta tela para antecipar as mutações que irão representar a resistência aos medicamentos clinicamente problemático. Enquanto triagem resistente usando mutagênese aleatória proporciona muitas vantagens em comparação com outros métodos, existem potenciais armadilhas para estar ciente de quando na sequência de um procedimento de triagem. Para qualquer seleção, é altamente recomendável para BAF3 células para ser totalmente dependente do alvo contra o qual resipostura é procurado. Uma falha parcial ou dependência do gene alvo pode não se desenvolver verdadeiros clones resistentes e, provavelmente desenvolver falsos positivos. Por exemplo, quatro estudos diferentes realizaram triagem resistente contra inibidores JAK2 usando BAF3 células transduzidas com qualquer EPO ou receptores MPL para facilitar JAK2 V617F-dependência 16-19. Apenas oito mutações resistentes limitados a quinase domínio foram identificados a partir dessas telas, embora inúmeros clones resistentes desenvolvido que não tinham mutações, presumivelmente devido ao surgimento de falsos positivos, o que foi atribuído à heterodimerization de JAK1 e JAK3 com receptores de citocinas. Portanto, para evitar perda de dependência JAK2 realizamos screening resistente em BAF3 claro que mostraram seleção robusta de clones resistentes contra Ruxolitinib e todos esses clones mostrou presença de mutações resistentes. Com base nessas observações, a fim de aproveitar todo o espectro de mutações resistentes, recomendamos que a célula BaF3s deve ser totalmente dependente da quinase alvo para evitar o surgimento de falsos positivos, como tem sido a norma nas projeções resistentes anteriores realizados contra inibidores JAK2 16,17. Além disso, é essencial para evitar condições de cultura granel, nos quais as células que albergam diferentes mutações que são reunidos em conjunto e deixadas expandir em cultura líquida, uma vez que isto pode levar a dominância clonal de algumas variantes altamente resistentes aos medicamentos. Por exemplo, durante a seleção inicial para imatinib resistência de mutado BCR-ABL em cultura de granéis líquidos, encontramos apenas 4 formas mutantes que foram representadas várias vezes dentro do primeiro 100 isolados que sequenciado. Portanto, o rastreio utilizando ágar suave permite clones de crescimento lento com graus mais modestas, de resistência aos medicamentos a serem recuperados que não seriam identificados com a cultura em massa. Por esta razão, recomenda-se a cultura crescer a granel antes da selecção para apenas 14 a 16 horas, seguido de selecção com drogas sem IL3 em agar mole. No nosso experiência, o crescimento das culturas para além de 36 horas após a transdução viral tendem a ser dominado por clones altamente proliferativas, que representa um risco de perder clones de crescimento lento (fracamente transformadora). Da mesma forma, o uso de células a partir de um anterior momentos, como 6-8 horas após a transdução viral são propensos a selecionar para clones altamente transformadoras ou overexpressing, causando assim um preconceito e desinformação nas identidade e frequência dos clones de resistência. Portanto, recomendamos o uso de células cultivadas por 14-16 horas após a transdução viral para a seleção, que prevê a seleção de clones individuais apertado e impede o domínio clonal tipicamente observado em culturas de líquidos a granel.
É essencial para confirmar a capacidade de um candidato para mutação em conferir resistência de isolamento, uma vez que foram identificados alguns clones de ter várias mutações. Para a tela de JAK2-V617F, recriamos a maioria das mutações identificadas da nossa biblioteca mutagênese aleatória usando o site dirigido mutagenesis. Após a introdução dos mutantes isolados em células frescas, que foram depois cultivadas na presença de várias drogas para determinar valores de IC50 para cada mutante. Também testámos duas variantes resistentes diferentes para resistência in vivo através da monitorização da bioluminescência para confirmar ainda mais a capacidade destas mutações únicas para causar resistência ao fármaco in vivo.
Dado o sucesso da terapia anti-quinase no tratamento de cancros que galvanizaram uma onda de inibidores da quinase em clínicas, é fundamental para identificar a resistência clinicamente problemático conferindo mutações para uma melhor gestão paciente e desenvolvimento de medicamentos que pode orientá-las. Esta estratégia de triagem tem sido utilizado com sucesso para identificar mutações no gene BCR / ABL, FLT3 JAK2 e 20; No entanto, cremos que será geralmente aplicável a uma ampla gama de agentes anti-neoplásicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
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- Melnikova, I., Golden, J.
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