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Biology

Kinase Inhibitors के खिलाफ प्रतिरोधी परिवर्तन की स्क्रीनिंग और सत्यापन के लिए एक विधि

Published: December 7, 2014 doi: 10.3791/51984
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cancer Blood Disease Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Kinase अवरोध चिकित्सा के खिलाफ आनुवंशिक प्रतिरोध के उद्भव प्रभावी कैंसर के उपचार के लिए महत्वपूर्ण चुनौती बन गया है। एक नव विकसित दवा के खिलाफ पहचान और प्रतिरोधी परिवर्तन के लक्षण वर्णन बेहतर नैदानिक ​​प्रबंधन और अगली पीढ़ी दवा डिजाइन में मदद करता है। यहाँ, हम इन विट्रो स्क्रीनिंग और प्रतिरोधी म्यूटेशन के सत्यापन के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Abstract

पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया (CML) में एक ड्राइवर ओंकोजीन के रूप में बीसीआर / एबीएल की खोज वास्तव में, प्रभावी ढंग से CML के रोगियों के इलाज से कैंसर में काइनेज को निशाना बनाने का क्षमता का प्रदर्शन किया है, जो imatinib, के विकास में हुई। इस अवलोकन ऐसे EGFR, बी-आरएएफ, किट और PDGFRs, के रूप में विभिन्न अन्य दुर्दमताओं में फंसा oncogenic kinases लक्षित करने के लिए नशीली दवाओं के विकास में क्रांति ला दी। हालांकि, विरोधी काइनेज उपचारों की एक बड़ी खामी लक्ष्य प्रतिपादन दवा प्रतिरोध म्यूटेशन के उद्भव कम या दवा के लिए आकर्षण खो दिया है। अगली पीढ़ी के अवरोधकों को विकसित करने में मदद करता है, लेकिन यह भी व्यक्तिगत दवा का उपयोग नैदानिक ​​प्रबंधन को प्रोत्साहन देता है न केवल प्रतिरोधी वेरिएंट द्वारा नियोजित तंत्र को समझना। हम अगली पीढ़ी बीसीआर / एबीएल अवरोधकों को विकसित करने में मदद मिली है, जो बीसीआर / एबीएल में म्यूटेशन प्रदान प्रतिरोध के स्पेक्ट्रम की पहचान करने के लिए एक रेट्रोवायरल वेक्टर आधारित स्क्रीनिंग रणनीति की सूचना दी। Ruxoli का प्रयोगएक दवा लक्ष्य जोड़ी के रूप में tinib और JAK2, यहाँ हम JAK2 काइनेज के यादृच्छिक उत्परिवर्तन पुस्तकालय व्यक्त माउस BAF3 कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है कि इन विट्रो स्क्रीनिंग तरीकों में वर्णन करते हैं।

Introduction

प्रोटीन kinases प्रतीत होता है हर सेलुलर समारोह मिलाना कि इंट्रासेल्युलर संकेत पारगमन रास्ते के प्रमुख विनियामक एंजाइमों हैं। काइनेज मध्यस्थता संकेतन का एक उचित नियंत्रण ज्यादातर यूपीएस द्वारा kinases, phosphatases और उसके पतन का उचित नियमन (ubiquitin Proteasome सिस्टम) पर निर्भर करता है जो homeostasis और विकास के लिए महत्वपूर्ण है। अविनियमित kinases कई तरह के कैंसर के केंद्र के स्तर पर हैं और मानव रोगों एक की मेजबानी में फंसाया। मानव जीनोम सीधे या परोक्ष रूप से जोड़ दिया गया है कि 500 से अधिक प्रोटीन kinases, के लिए ~ 400 मानव रोगों दो encodes। इन टिप्पणियों छोटे अणु अवरोधकों को 3-5 से kinases की चिकित्सीय लक्ष्य-निर्धारण के लिए अवधारणा का समर्थन किया।

पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया (CML) के उपचार में इस तरह के imatinib के रूप में एबीएल काइनेज अवरोधकों का प्रदर्शन, इस दृष्टिकोण 6,7 के लिए अवधारणा का सबूत प्रदान की है। इस अवलोकन न केवल चींटी क्रांति ला दीमैं-काइनेज चिकित्सा लेकिन यह भी म्येलोप्रोलिफेरातिवे अर्बुद (MPN) के साथ polycythemia वेरा (पीवी) और रोगियों से JAK2 में oncogenic उत्परिवर्तन की खोज करने के लिए नेतृत्व जो चिकित्सीय लक्ष्य-निर्धारण के लिए अन्य नियोप्लास्टिक रोगों, में आनुवंशिक घावों की पहचान करने के विचार से लागू। इस खोज के छोटे अणु काइनेज inhibitors के साथ JAK2 लक्षित करके MPNs के उपचार में बहुत रुचि उत्पन्न। अब, JAK2 अवरोधकों के लगभग एक दर्जन से अधिक क्लिनिकल परीक्षण कर रहे हैं और उनमें से एक myelofibrosis के उपचार के लिए हाल ही में मंजूरी दी गई है। कैंसर में छोटे अणु inhibitors के द्वारा oncogenic kinases की विशिष्ट लक्षित आशाजनक परिणाम लाने के लिए है, यह भी उपचार के लिए प्रतिरोध विकसित करने से ग्रस्त है। वास्तव में, अब तक, मरीजों को ज्यादातर दवा 8-10 लक्ष्य के लिए जो काइनेज डोमेन म्यूटेशन प्राप्त करके ऐसे imatinib, Gefitinib, Erlotinib और Dasatinib रूप काइनेज निरोधक, साथ प्रतिरोध म्यूटेशन विकसित इलाज किया। जीन उत्परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में प्रतिरोध ओ सीमाओं पर प्रकाश डाला गयाएफ oncogenic kinases के खिलाफ monotherapy लक्षित, और कभी अधिक सफल कैंसर कीमोथेरेपी के विकास में अगली चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। दवा प्रतिरोध की यंत्रवत और कार्यात्मक परिणामों चयन और नशीली दवाओं के विकास के लिए मानार्थ यौगिकों के डिजाइन के लिए एक औचित्य प्रदान करना चाहिए। इन विट्रो स्क्रीन के माध्यम से पहचान उत्परिवर्तनों, रोगियों में पाए जाने वाले के साथ सहसंबंध के एक उच्च स्तर से पता चला है। इसलिए, नैदानिक ​​पतन का कारण होने की संभावना है कि प्रतिरोध पैटर्न की पहचान करने में नैदानिक ​​या पूर्व नैदानिक ​​विकास सहायता में एक भी दवा लक्ष्य जोड़े के लिए दवा प्रतिरोध प्रदान कि परिवर्तन के लिए इन विट्रो स्क्रीनिंग। इन उत्परिवर्ती रूपों की पहचान न केवल दवा की प्रतिक्रिया और पतन, लेकिन और अधिक मजबूत अगली पीढ़ी के अवरोधकों के डिजाइन के लिए भी आवश्यक लिए रोगियों की निगरानी में सहायक है। उदाहरण के लिए, अगली पीढ़ी बीसीआर / एबीएल निरोधक, Nilotinib और Ponatinib के विकास के लिए, क्योंकि अधिक से अधिक MEC से संभव बनाया गयाhanistic समझ उत्परिवर्तजनन, संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन से प्राप्त की।

इससे पहले, हम इस तरह के imatinib 11,12, PD166326 12, और AP24163 के रूप में 13 अवरोधकों के लिए प्रतिरोध प्रदान म्यूटेशन के स्पेक्ट्रम प्रकट करने के लिए बीसीआर / एबीएल के यादृच्छिक mutagenesis का उपयोग हमारे स्क्रीन के परिणामों की सूचना है। परिणाम न केवल नैदानिक ​​प्रतिरोध और रोग पतन प्रदान उत्परिवर्तन की पहचान की है, लेकिन यह भी दवा प्रतिरोध और काइनेज समारोह 11,14 शासी सिद्धांतों की यंत्रवत समझ प्रदान की है। यहाँ हम इस स्क्रीनिंग की रणनीति का एक व्यापक आवेदन सक्षम करने के लिए, एक दवा लक्ष्य जोड़ी के रूप में Ruxolitinib और JAK2 का उपयोग कर, अतिरिक्त पद्धति विस्तार प्रदान करते हैं।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी प्रक्रियाओं पशु के एथिकल ट्रीटमेंट और देखभाल के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार आयोजित किया, और एक अनुमोदित IACUC पशु उपयोग प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया।

1. सेल लाइन रखरखाव

  1. RPMI-1640 मध्यम संस्कृति BAF3 कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ (100 इकाइयों / मिलीलीटर और 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और Wehi प्रकोष्ठों के खर्च की संस्कृति के माध्यम से पूरक। 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक DMEM में HEK293T कोशिकाओं ग्रो (100 इकाइयों / मिलीलीटर और 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल)। 5% सीओ 2 से युक्त एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने।

2. प्लास्मिड निर्माण

  1. माउस JAK2 और एलआर द्वारा pMSCV-Puro-गीगावॉट में अपनी oncogenic isoform JAK2-V617F मानक पुनर्संयोजन क्लोनिंग प्रक्रिया का उपयोग कर clonase क्लोन।
  2. Luciferase अभिव्यक्ति वेक्टर (pMSCV ल्यूक-चेरी-गिनीकृमि) के निर्माण के लिए में छठी में इस्तेमाल कियाVO इमेजिंग, प्रयोग किया जाता है जो pENTR ल्यूक, उत्पन्न करने के लिए pENTR-एसडी topo में क्लोनिंग के साथ पीछा किया प्राइमरों (एफ पी-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC ल्यूक एसडी / आरपी TTACAATTTGGACTTTCCG और ल्यूक एसडी /) का उपयोग करते हुए पीसीआर द्वारा pLVX-Tet-पर वेक्टर से luciferase बढ़ाना एलआर clonase का उपयोग कर पुनर्संयोजन मध्यस्थता क्लोनिंग द्वारा रेट्रोवायरल वेक्टर, pMSCV-चेरी-गीगावॉट में luciferase जीन स्थानांतरण करने के लिए।

यादृच्छिक उत्परिवर्तन लाइब्रेरी 3. तैयार करना, उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग और पहचान

3.1) यादृच्छिक mutagenesis

  1. JAK2 जंगली प्रकार और एक व्यावसायिक पुनर्संयोजन क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर pMSCV-Puro-गीगावॉट रेट्रोवायरल वेक्टर में V617F उत्परिवर्तन का क्लोन पूरी लंबाई।
  2. , परिणत करने के लिए JAK2-V617F प्लास्मिड डीएनए के एक माइक्रोग्राम प्रति प्रयोग XL -1 लाल, ई इस प्रकार उन्हें प्रतिकृति के दौरान यादृच्छिक म्यूटेशन को शामिल करने की अनुमति देने के डीएनए की मरम्मत तंत्र में दोषपूर्ण है जो कोलाई कोशिकाओं,। अधिक विशेष रूप से, 50 मिक्स - डीएनए के 100 एनजी 10 के साथ (डीएनए के 100 से अधिक एनजी परिवर्तन दक्षता कम हो जाती है)0 एक पूर्व ठंडा polypropylene ट्यूब में सक्षम कोशिकाओं की μl और धीरे से हर 5 मिनट घूमता है, 30 मिनट के लिए बर्फ पर incubated। एक अच्छा पुस्तकालय कवरेज के लिए, सक्षम कोशिकाओं की 4-6 ट्यूब का उपयोग करें।
    नोट: डीएनए के 100 से अधिक एनजी परिवर्तन दक्षता कम हो जाती है
  3. 45 सेकंड के एक गर्मी सदमे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब को विसर्जित कर दिया और दो मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। अगला, समाज माध्यम से 1 मिलीलीटर (2.0% tryptone, 0.5% खमीर निकालने, 0.05% सोडियम क्लोराइड, 10 मिमी और MgCl2, 10 मिमी MgSO4, और 0.4% ग्लूकोज़) जोड़ें। 90 मिनट के लिए 225-250 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं।
  4. 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन युक्त चार 10 सेमी लेग-अगर प्लेटों पर प्रत्येक ट्यूब से प्लेट कोशिकाओं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा - 16 के लिए प्लेटें सेते हैं।
  5. दिखाई दे कालोनियों के बाद, एक बाँझ थाली खुरचनी के साथ प्लेटें scraping द्वारा उन्हें इकट्ठा। एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड निकासी किट का उपयोग कर एक थाली और अलग प्लास्मिड डीएनए से पूल कोशिकाओं।
    आमतौर पर कालोनियों में छोटे होते हैं और होने के लिए 18-24 घंटा ले ध्यान दें:दृश्यमान इन धीमी गति से बढ़ रही है जीवाणु उपभेदों हैं। इस स्तर पर, ऐसे Sau3A1 या Taq1 या अनुक्रमण के रूप में एक लगातार कटर के साथ प्रतिबंध पाचन द्वारा पुस्तकालय में म्यूटेशन की विविधता का आकलन करें।

रेट्रोवायरल Supernatants और पारगमन के 3.2) उत्पादन

  1. एक दिन अभिकर्मक, थाली 10% एफसीएस, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी एल glutamine युक्त DMEM में 100 सेमी व्यंजन पर 4 एक्स 10 6 HEK 293T कोशिकाओं से पहले।
  2. अगले दिन, मध्यम जगह और mutagenized pMSCV-JAK2-V617F पुस्तकालय के साथ कोशिकाओं transfect। प्रत्येक 10 सेमी की थाली के लिए, सीरम मुक्त DMEM मीडिया का इस्तेमाल कर 400 μl की कुल मात्रा को FuGENE के 40 μl के साथ डीएनए के 10 माइक्रोग्राम प्रति (प्लाज्मिड पुस्तकालय के 5 माइक्रोग्राम प्रति और रेट्रोवायरल पैकेजिंग प्लाज्मिड के 5 माइक्रोग्राम प्रति, pCLEco) मिश्रण। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए डीएनए और लिपिड मिश्रण सेते हैं। 20 मिनट के बाद HEK293T कोशिकाओं के शीर्ष पर वार डीएनए लिपिड जटिल बूंद जोड़ें।
  3. छह घंटे के बाद, अभिकर्मक मीडिया डब्ल्यू बदलनेith ताजा मीडिया वायरस उत्पादन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं और। ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, एक .45 माइक्रोन acrodisc फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड वायरल supernatants इकट्ठा।

इन विट्रो में प्रतिरोधी क्लोन के 3.3) चयन

  1. दवा प्रतिरोधी JAK2-V617F म्यूटेंट के लिए, 0.5-1 X10 6 के एक वायरल अनुमापांक होने वायरस supernatants के 100 मिलीलीटर के साथ 100 मिलियन BAF3 सेल transduce। अधिक विशेष रूप से, 10% सीरम युक्त RPMI मीडिया का उपयोग कर 300 मिलीलीटर की कुल मात्रा को वायरस सतह पर तैरनेवाला की 100 मिलीलीटर, और polyberene के 24 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (ployberene के अंतिम एकाग्रता 8 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / है) के साथ 10 8 कोशिकाओं मिश्रण। कई में छह अच्छी तरह प्लेटें (4-5 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) इन सेल मिक्सर बांटो।
  2. 25 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 1250 XG पर प्लेटें अपकेंद्रित्र। Centrifugation के बाद, 24 घंटा के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  3. अगले दिन, एक साथ कोशिकाओं पूल और Ruxolitinib और मध्यम नरम अगर युक्त के साथ मिश्रण और सी में चढ़ायाएक्स अच्छी तरह प्लेटें। प्रत्येक दवा एकाग्रता के लिए, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में Ruxolitinib की उचित राशि के साथ transduced BAF3 कोशिकाओं (10-20 मिलियन कोशिकाओं) के 10 मिलीलीटर मिश्रण। RPMI 20% सीरम युक्त का उपयोग कर 40 मिलीलीटर मात्रा अप करें। छह अच्छी तरह प्लेटें में mixcarefully, कोशिकाओं को 1.2% अगर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और प्लेट।
  4. दो सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं। 0.2 एमएल पिपेट सुझाव और उप-संस्कृति उन्हें 3-4 दिनों के लिए व्यक्तिगत रूप में 24 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग प्रतिरोधी कालोनियों उठाओ।
  5. कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 450 XG पर centrifugation द्वारा प्रतिरोधी BAF3 कोशिकाओं फसल। एक वाणिज्यिक जीनोमिक डीएनए अलगाव किट का उपयोग जीनोमिक डीएनए अलग। पीसीआर जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर प्राइमरों (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG और mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) और उच्च निष्ठा पीसीआर सिस्टम का विस्तार लंबी टेम्पलेट के 100 एनजी से पूरी लंबाई JAK2 सीडीएनए बढ़ाना।
  6. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पादों अलग करें। JAK2 कोडिंग फ्रेम का प्रतिनिधित्व करने के लिए डीएनए बैंड के 3.4 केबी उत्पाद शुल्क और डीएनए को अलग-थलगएक वाणिज्यिक जेल निकालना किट का उपयोग कर। अनुक्रम 8 आंतरिक प्राइमरों (P1 - P8) का उपयोग सीडीएनए की पूरी लंबाई वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोडिंग अनुक्रम फैले और विश्लेषण दृश्यों।

प्रतिरोधी परिवर्तन के 4. इन विट्रो मान्यकरण

कई सेल क्लोन, प्रतिरोध फेनोटाइप में प्रत्येक उत्परिवर्तन के योगदान का परीक्षण टेम्पलेट के रूप में pMSCV-JAK2V-617F प्लाज्मिड का उपयोग कर साइट निर्देशित mutagenesis के द्वारा चयनित वेरिएंट को उत्पन्न करने के लिए एक से अधिक उत्परिवर्तन ले।

  1. एक वाणिज्यिक mutagenesis के किट और बिंदु उत्परिवर्तन बनाने के लिए डिज़ाइन oligonucleotides का उपयोग कर pMSCV-JAK2-V617F प्लाज्मिड पर साइट निर्देशित mutagenesis प्रदर्शन करते हैं। अनुक्रमण द्वारा उत्परिवर्ती क्लोन की पहचान की पुष्टि करें।
  2. रेट्रोवायरस साथ BAF3 कोशिकाओं transduce चयन 1μg / एमएल puromycin उपयोग करने के साथ पीछा किया उत्परिवर्ती प्लास्मिड का उपयोग किया।
  3. प्लेट 10 4 BAF3-JAK2-V617F कोशिकाओं को एक 96 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में (10% एफसीएस साथ RPMI के 50 μl)। अलग37 डिग्री सेल्सियस पर 60 घंटे के लिए प्लेटें: (0, 1, 3, 5, 10, और 20 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता), और सेते हैं ly थाली भर में वेल्स को ruxolitinib युक्त मीडिया के 50 μl जोड़ें।
  4. 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक अच्छी तरह से ऊष्मायन के साथ पीछा करने WST-एक अभिकर्मक के 10 μl जोड़कर सेल व्यवहार्यता का आकलन करें। एक प्लेट रीडर का उपयोग A450 पर रिकॉर्ड absorbance के। तीन प्रतियों और साजिश में सभी assays के प्रदर्शन INCB018424 सांद्रता के खिलाफ absorbance के औसत। एक nonlinear वक्र ढाले कलन विधि का उपयोग एक सबसे अच्छा फिट sigmoidal वक्र प्रदर्शन करते हैं। सेलुलर IC50 के रूप में 50% सेल व्यवहार्यता में जिसके परिणामस्वरूप दवा एकाग्रता स्कोर।
  5. अगला, ruxolitinib की सांद्रता बढ़ रही है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 घंटे के लिए incubated साथ 10% सीरम युक्त RPMI माध्यम में छह अच्छी तरह प्लेटें में JAK2 वेरिएंट व्यक्त थाली छह लाख BAF3 कोशिकाओं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 450 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा। 20 मिमी Tris-CL में कोशिकाओं एक पीबीएस के साथ समय है, और lyse धो (पीएच 7.5), 50मिमी NaCl, 1% एनपी 40, 0.1% एसडीएस, 5 मिमी EDTA, 1mm EGTA, 1 मिमी सोडियम फ्लोराइड, 2 मिमी सोडियम वैनेडेट, और 5% ग्लिसरॉल protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल और फॉस्फेट inhibitors के साथ पूरक। 5x जेल लोड हो रहा बफर (के अलावा द्वारा पीछा 1 मिनट के लिए सेल निलंबन Sonicate 350 मिमी Tris-एचसीएल [पीएच 6.8], 500 मिमी डीटीटी, 15% एसडीएस, 10 मिमी Benzamidine, 5 मिमी EDTA, 5 मिमी EGTA, 5 मिमी सोडियम वैनेडेट , protease कॉकटेल, 50% ग्लिसरॉल, और 5-10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 0.001% Bromophenol नीला) और विकृतीकरण।
  7. Denaturing शर्तों के तहत एक 8% एसडीएस polyacrylamide जेल पर प्रोटीन का समाधान करें। माउस मोनोक्लोनल विरोधी phopsho STAT5 साथ immunoblotting प्रदर्शन करते हैं। दाग पट्टी और एक खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी SATA5 एंटीबॉडी के साथ reprobed। आपूर्तिकर्ता की सिफारिश के अनुसार ईसीएल अभिकर्मकों का उपयोग कर बैंड कल्पना।

विवो सत्यापन में 5.

  1. Luciferase और चेरी व्यक्त BAF3 कोशिकाओं transduce (pMSCV ल्यूक-चर से बनाया रेट्रोवायरस साथ transducedJAK2-V617F और प्रतिरोधी वेरिएंट व्यक्त वायरस के साथ RY गिनीकृमि)। JAK2 और उसके प्रतिरोध वेरिएंट की अभिव्यक्ति के लिए puromycin चयन है कि जीवित कोशिकाओं का चयन करें।
  2. पूंछ-नस में इंजेक्शन के माध्यम से 6 BALB / ग चूहों को पीबीएस के 200 μl में JAK2-V617F और उसके प्रतिरोधी वेरिएंट को ले जाने के लिए दो लाख सक्रिय रूप से बढ़ BAF3 ल्यूक / चेरी कोशिकाओं इंजेक्षन।
  3. सेल प्रत्यारोपण के तीन दिनों के बाद, दो सप्ताह के लिए दो बार दैनिक Ruxolitinib (100 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों इंजेक्षन।
  4. एक इमेजिंग प्रणाली के साथ luciferase आधारित bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन। ।
    1. संक्षेप में, बाँझ विआयनीकृत पानी की 300 मिलीग्राम से 25 मिलीग्राम, छोटे संस्करणों और दुकान में विभाज्य भंग करके luciferin समाधान तैयार है।
      नोट: -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर luciferin और उपयोग करें जब तक प्रकाश से रक्षा करते हैं।
    2. प्रत्येक माउस में 125 मिलीग्राम / किग्रा प्राप्त करने के लिए आईपी से प्रत्येक माउस के लिए 250 μl इंजेक्षन। एक साथ एक मोहरबंद बॉक्स में साँस isoflurane (1.5% -2.0%) का उपयोग कर एक ही समूह से चूहों anesthetize। वें पर पशु चिकित्सक मरहम लागूई आंख सूखापन को रोकने के लिए।
      नोट: चूहों के लिए लिया गया समय सोने के लिए (10-15 मिनट) शिखर को luciferin गतिविधि की अनुमति दी। विभिन्नता से बचने के लिए समूहों के बीच लगातार समय रखें।
  5. इमेजिंग कक्ष चरण के लिए तुरंत चूहों स्थानांतरण और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान 1.5-2% isofluorane पर संज्ञाहरण बनाए रखें। अनुक्रमिक 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60, और 300 सेकंड जोखिम के साथ छवि चूहों। छवियों को पकड़ने और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर bioluminescence तीव्रता quantitate। इमेजिंग अपने पिंजरे वापस करने के लिए चूहों लौटने के बाद।
  6. , इन विवो काइमेरावाद फसल कुल bonemarrow कोशिकाओं के लिए। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ पीछा किया 5 मिनट के लिए सीओ 2 के साथ चूहों euthanize। हड्डियों फसल और अस्थि मज्जा इकट्ठा करने के लिए ठंड पीबीएस 4 मिलीलीटर में कुचलने। प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे प्रतिशत चेरी सकारात्मक कोशिकाओं का विश्लेषण और FACS का उपयोग कर यों। प्रत्येक नमूने से बीस हजार की घटनाओं ले लीजिए।

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Representative Results

आनुवंशिक परिवर्तन के उद्भव लक्षित विरोधी काइनेज उपचार के लिए बड़ी चुनौती बन गया है। Mutational पढ़ाई, चयन और अगली पीढ़ी के नशीली दवाओं के विकास के डिजाइन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई हैं कि यंत्रवत और कार्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के अलावा, यह भी बेहतर चिकित्सीय प्रबंधन की अनुमति देता है और भविष्य में व्यक्तिगत उपचार के लिए और अधिक उपयोगी हो सकता है। इस प्रयोग में, हम JAK2-V617F काइनेज में ruxolitinib प्रतिरोध म्यूटेशन (चित्रा 1) के लिए स्क्रीनिंग दिखा। हम pMSCV-चेरी-गीगावॉट में पूर्ण लंबाई माउस JAK2-V617FcDNA शुरू करने से pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway सदिश का निर्माण किया। यह वजह से अपनी अनुक्रम पूर्वाग्रह और बड़ा जीन टुकड़े के साथ जुड़े सीमाओं बढ़ाना मुश्किल हो जाता है करने के लिए, पीसीआर है जो विधि के सबसे लोकप्रिय विकल्प है, पर यादृच्छिक म्यूटेशन विकसित करने के लिए जीवाणु मेजबान (ई कोलाई के XL -1 लाल तनाव) का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । बेतरतीब ढंग से mutagenized डीएनए पुस्तकालय रेट्रोवायरस उत्पादन के लिए HEK293T कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। इन उत्परिवर्ती वीरका उपयोग करता है, एक या 5 Ruxolitinib की माइक्रोन के साथ या तो आईएल -3 के अभाव में मुलायम-अगर में कॉलोनी के विकास के लिए चयन किया गया था कि BAF3 कोशिकाओं transduce करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इन शर्तों के तहत, कालोनियों काइनेज के कार्यात्मक और प्रतिरोधी संस्करण व्यक्त करता है कि JAK2V-617F cDNAs ले जाने की कोशिकाओं से ही उत्पन्न होती हैं। 10 के बाद - 14 दिन, अच्छी तरह से अलग व्यक्ति कालोनियों आकार में विविध, और तरल संस्कृति में उन्हें विस्तार किया है, जो उठाया गया था। जीनोमिक डीएनए इन कोशिकाओं से पृथक किया गया। provirus प्रत्यक्ष बचाव करके या पीसीआर से बरामद किया गया था। बरामद proviruses म्यूटेशन (चित्रा 1) की पहचान करने के लिए अनुक्रम थे। अनुक्रम विश्लेषण Lasergene की DNASTAR पैकेज का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया।

कई सेल क्लोन एक से अधिक उत्परिवर्तन किया जाता है, क्योंकि हम दृढ़ता से इन विट्रो में और vivo assays में दोनों से अलगाव में इन म्यूटेशन मान्य करने की सलाह देते हैं (आंकड़े 2 और 3)। अलगाव में वेरिएंट की गतिविधि को सत्यापित करने के लिए,साइट के द्वारा उत्पन्न किया गया चयनित वेरिएंट JAK2V-617F क्रम की mutagenesis के निर्देश दिए। ये वेरिएंट BAF3 कोशिकाओं में पुनः शुरू किया, और IC50 (IC50 मूल्यों, 2A चित्रा) का मूल्यांकन करने के Ruxolitinib के विभिन्न खुराक पर सेल प्रसार की क्षमता के लिए मापा गया। जैव रासायनिक assays किसी भी बंद लक्ष्य मध्यस्थता प्रतिरोध (चित्रा 2B) बाहर शासन करने के लिए Ruxolitinib की खुराक में वृद्धि के साथ incubated रहे थे कि BAF3 कोशिकाओं की प्रोटीन lysates पर immunoblot विश्लेषण द्वारा phosphotyrosine या phospho-STAT5 के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। उच्च Ruxolitinib सांद्रता में बढ़ाया IC50 मूल्यों और लगातार autophosphorylation प्रदर्शन म्यूटेंट इस प्रकार दवा प्रतिरोधी वेरिएंट होने की पुष्टि कर रहे हैं। कई प्रतिरोधी म्यूटेशन चर खुराक प्रतिक्रिया दिखाने की वजह से है, इसलिए यह इन म्यूटेशन के रूप में अच्छी तरह से विवो प्रतिरोध में प्रदान करेगा कि क्या परीक्षण करने के लिए आवश्यक है। वे महंगे हैं और जैसा कि आम तौर पर, हम इन विवो प्रयोगों के लिए केवल 2 -3 अलग वेरिएंट का परीक्षण करने की सिफारिशश्रमसाध्य। इन विवो प्रतिरोध को मान्य करने के लिए, BAF3 कोशिकाओं में विवो ट्रैकिंग सक्षम करने के लिए JAK2-V617F वेरिएंट और luciferase / चेरी व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थे। चूहे दो सप्ताह के लिए Ruxolitinib इंजेक्शन द्वारा पीछा 1-2 लाख चेरी सकारात्मक कोशिकाओं (JAK2 वेरिएंट और luciferase व्यक्त), इंजेक्शन के साथ किया गया। दो सप्ताह के बाद, चूहों चेरी सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति (चित्रा 3) को मापने के द्वारा bonemarrow और परिधीय रक्त में BAF3 काइमेरावाद के लिए भी luciferase उत्प्रेरित bioluminescence (चित्रा 3) के लिए imaged, और कर रहे थे। प्रतिरोधी वेरिएंट इस प्रकार JAK2-V617F संस्करण व्यक्त BAF3 कोशिकाओं vivo में Ruxolitinib उपचार के लिए प्रतिरोधी है, सुझाव है कि उपचार की अवधि में bioluminescence में प्रगतिशील वेतन वृद्धि दिखाने जबकि JAK2-V617F व्यक्त चूहे, Ruxolitinib के प्रति संवेदनशील हैं।

चित्रा 1

चित्रा 2
चित्रा 2:। एक योजना खुराक निर्भर सेल प्रसार assays के (ए) और पश्चिमी सोख्ता (बी) का उपयोग कर इन विट्रो सत्यापन में दिखा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3: इन विवो सत्यापन का उपयोग कर luciferase का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व bioluminescence माप उत्प्रेरित। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के संस्करण।

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Discussion

नैदानिक ​​पतन और लक्ष्य जीन में दवा प्रतिरोध म्यूटेशन के उद्भव: CML के उपचार में imatinib के नैदानिक ​​सफलता छोटे अणु अवरोधकों से लाली kinases को निशाना बनाने का संभावित है, लेकिन लक्षित चिकित्सा की भी खुला सीमाओं को न केवल प्रदर्शन किया। प्रतिरोध उत्परिवर्तन की पहचान बेहतर नैदानिक ​​प्रबंधन और अगली पीढ़ी के अवरोधकों के विकास में मदद करता है। इस प्रोटोकॉल लक्षित जीन में दवा प्रतिरोधी म्यूटेशन की पहचान करने के लिए एक पद्धति का वर्णन है। इस विधि ई में बनाया गया एक बेतरतीब ढंग से mutagenized प्लाज्मिड पुस्तकालय का उपयोग करता है कोलाई, उत्परिवर्ती प्रोटीन व्यक्त करने के लिए। पुस्तकालय तो BAF3 कोशिकाओं (एक ओंकोजीन द्वारा परिवर्तन करने के लिए अतिसंवेदनशील) में शुरू की है, एजेंटों की उपस्थिति में सेल क्लोन के चयन के साथ पीछा किया। प्रतिरोधी क्लोन से लक्षित जीन का अनुक्रमण प्रतिरोध प्रदान म्यूटेशन को पहचानती है। अंत में, साइट के द्वारा निर्मित कर रहे हैं की पहचान की म्यूटेशन के लिए उन्हें मान्य करने के लिए उत्परिवर्तजनन निर्देशितदवा प्रतिरोध।

इस रणनीति का प्रयोग हम क्रमश: Ruxolitinib और imatinib के लिए प्रतिरोध प्रदान JAK2 और बीसीआर / एबीएल में म्यूटेशन के स्पेक्ट्रम में परिभाषित किया। हम बीसीआर / एबीएल में सौ से अधिक उत्परिवर्तन की पहचान की। इसके अलावा, रोगियों में पाया सभी प्रमुख म्यूटेशन की पहचान करने, हमारी स्क्रीनिंग विधि हमारे भीतर और काइनेज डोमेन परे दोनों अवशेषों के उपन्यास प्रतिस्थापन की पहचान करने की अनुमति दी। दिलचस्प बात यह है कि हमारे स्क्रीन से सभी म्यूटेशन रोगी के नमूने में पहचान की गई है, लेकिन इस प्रक्रिया इस प्रकार चिकित्सकीय समस्याग्रस्त दवा प्रतिरोध खड़ा करेंगे कि म्यूटेशन पूर्वानुमान करने के लिए इस स्क्रीन की क्षमता का प्रदर्शन, लगभग 10 से अधिक वर्षों के 15 में ले लिया। यादृच्छिक mutagenesis का उपयोग कर प्रतिरोधी स्क्रीनिंग अन्य तरीकों की तुलना में कई लाभ प्रदान करता है, संभावित नुकसान एक स्क्रीनिंग प्रक्रिया के बाद जब से अवगत होने के लिए कर रहे हैं। किसी भी जांच के लिए, यह दृढ़ता से लक्ष्य पर पूरी तरह से निर्भर होना BAF3 कोशिकाओं के लिए सिफारिश की है, जो निवासियों के खिलाफरुख की मांग की है। लक्ष्य जीन पर एक विफलता या आंशिक निर्भरता सच प्रतिरोधी क्लोन विकसित करने और सबसे अधिक संभावना झूठी सकारात्मक विकास नहीं हो सकता है। उदाहरण के लिए, चार अलग-अलग अध्ययनों JAK2-V617F निर्भरता 16-19 की सुविधा के लिए ईपीओ या एमपीएल रिसेप्टर्स के साथ या तो transduced BAF3 कोशिकाओं का उपयोग JAK2 अवरोधकों के खिलाफ प्रतिरोधी स्क्रीनिंग प्रदर्शन किया है। कई प्रतिरोधी क्लोन कारण साइटोकाइन रिसेप्टर्स के साथ JAK1 और JAK3 की heterodimerization करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, जो झूठी सकारात्मक, के उद्भव के लिए मुमकिन है, म्यूटेशन का अभाव है कि विकसित हालांकि डोमेन kinase तक ही सीमित केवल आठ प्रतिरोधी म्यूटेशन, इन स्क्रीन से पहचान की गई। इसलिए, JAK2 निर्भरता के नुकसान से बचने के लिए हम प्रतिरोधी म्यूटेशन की मौजूदगी से पता चला Ruxolitinib और इन क्लोन के सभी के खिलाफ प्रतिरोधी क्लोन के मजबूत चयन से पता चला है कि सादा BAF3 में प्रतिरोधी स्क्रीनिंग बाहर किया। इन टिप्पणियों के आधार पर, प्रतिरोधी म्यूटेशन का पूरा स्पेक्ट्रम का दोहन करने के क्रम में, हम अनुशंसा करते हैं कि BaF3 सेलJAK2 अवरोधकों 16,17 के खिलाफ प्रदर्शन किया पिछले प्रतिरोधी चोकर में एक आदर्श की गई है के रूप में है, झूठी सकारात्मक के उद्भव से बचने के लिए लक्षित काइनेज पर पूरी तरह से निर्भर होना चाहिए। इस बेहद कुछ दवा प्रतिरोधी वेरिएंट की प्रतिरूप प्रभुत्व के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के बाद से ही, यह अलग म्यूटेशन को शरण देने की कोशिकाओं को एक साथ जमा और तरल संस्कृति में विस्तार करने के लिए अनुमति दी जाती है जिसमें थोक संस्कृति की स्थिति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, थोक तरल संस्कृति में mutagenized बीसीआर-एबीएल के imatinib-प्रतिरोध के लिए प्रारंभिक चयन के दौरान, हम पहले 100 हम अनुक्रम आइसोलेट्स के भीतर कई बार प्रतिनिधित्व कर रहे थे कि केवल चार उत्परिवर्ती रूपों में पाया गया। इसलिए, नरम अगर का उपयोग कर स्क्रीनिंग थोक संस्कृति का उपयोग कर पहचाना नहीं होगा कि बरामद किए जाने की दवा प्रतिरोध की अधिक विनम्र डिग्री के साथ धीमी गति से बढ़ रही क्लोन की अनुमति देता है। इस कारण से, यह पहले केवल 14 घंटा से 16 के लिए चयन करने के लिए थोक संस्कृति विकसित करने के लिए सिफारिश की है, मुलायम अगर में IL3 बिना दवा के चयन के साथ पीछा किया। हमारे पूर्व मेंवायरल पारगमन धीमी गति से बढ़ रही क्लोन कम करने के लिए एक जोखिम (कमजोर परिवर्तनकारी) बन गया है जो अत्यधिक proliferative क्लोन, का प्रभुत्व हो जाते हैं के बाद अनुभव, 36 घंटा से परे संस्कृतियों से बढ़ रही है। इसी तरह, एक पहले के समय बिंदुओं से कोशिकाओं का उपयोग वायरल पारगमन के बाद 6-8 घंटा इस प्रकार प्रतिरोध क्लोन की पहचान और आवृत्ति में एक पूर्वाग्रह और गलत बयानी के कारण अत्यधिक परिवर्तनकारी या overexpressing क्लोन के लिए चयन करने के लिए प्रवण हैं जैसे। इसलिए, हम व्यक्तिगत क्लोन के तंग चयन प्रदान करता है और आम तौर पर थोक तरल संस्कृतियों में मनाया प्रतिरूप प्रभुत्व को रोकता है जो स्क्रीनिंग के लिए 14-16 घंटे बाद वायरल पारगमन के लिए विकसित कोशिकाओं का उपयोग करना चाहिये।

यह कुछ क्लोन कई उत्परिवर्तन है करने के लिए पहचान की गई है, क्योंकि अलगाव में प्रतिरोध प्रदान करने के लिए एक उम्मीदवार उत्परिवर्तन की क्षमता की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है। JAK2-V617F स्क्रीन के लिए, हम साइट निर्देशित mutage का उपयोग हमारे यादृच्छिक mutagenesis के पुस्तकालय से पहचान म्यूटेशन के बहुमत निर्मितNesis। ताजा कोशिकाओं में पृथक म्यूटेंट शुरू करने के बाद, वे तो प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए IC50s निर्धारित करने के लिए विभिन्न दवाओं की उपस्थिति में बड़े हो रहे थे। हम भी आगे vivo में दवा प्रतिरोध पैदा करने के लिए इन एकल म्यूटेशन की क्षमता की पुष्टि करने के लिए bioluminescence की निगरानी के द्वारा vivo में प्रतिरोध के लिए दो अलग अलग प्रतिरोधी वेरिएंट का परीक्षण किया।

क्लीनिक में काइनेज अवरोधकों की वृद्धि जस्ती कैंसर है कि इलाज में विरोधी काइनेज चिकित्सा की सफलता को देखते हुए यह बेहतर रोगी प्रबंधन और उन्हें लक्षित कर सकते हैं कि विकासशील दवाओं के लिए म्यूटेशन प्रदान चिकित्सकीय समस्याग्रस्त प्रतिरोध की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस स्क्रीनिंग रणनीति को सफलतापूर्वक बीसीआर / एबीएल, JAK2 और FLT3 20 में म्यूटेशन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, हम यह विरोधी नियोप्लास्टिक एजेंटों की एक व्यापक श्रेणी के लिए आम तौर पर लागू हो जाएगा कि विश्वास करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell and Tissue culture 
BaF3 Cells ATCC
HEK293T cells ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW A gift from Ross Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW Made in house
pMSCV-V617F-Cherry.GW Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW Made in house
pMSCV-Luciferase-puro.GW Made in house
RPMI Cellgro (corning) 15-040-CV
DMEM Cellgro (corning) 15-013-CV
Penn/Strep Cellgro (corning) 30-002-CI
FBS Atlanta biological S11150
Trypsin EDTA 1X Cellgro (corning) 25-052-CI
1x PBS Cellgro (corning) 21-040-CV
L-Glutamine Cellgro (corning) 25-005-CL
Puromycin Gibco (life technologies) A11138-03
Protamine sulfate Sigma P3369 5 mg/ml stock in water
Trypan Blue solution (0.4%) Sigma T8154
DMSO Cellgro (corning) 25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib) ChemieTeK 941678-49-5
WST-1 Roche 11644807001
0.45 micron disc filter PALL 2016-10
70 micron nylon cell strainer Becton Dickinson 352350
Bacterial Culture
XL-1 red E. coli cells Agilent Tech 200129
SOC New England Biolabs B90920s
Ampicillin Sigma A0166 100 mg/ml stock solution 
Bacto agar Difco 214050
Terrific broth Becton Dickinson 243820
Agarose Genemate E-3119-500
Kits
Dneasy Blood& tissue kit Qiagen 69506
Expand long template PCR system Roche 1168134001
Wizard Sv gel and PCR clean up system Promega A9282
Pure Yield plasmid mini prep system Promega A1222
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells Invitrogen 12535029
Gateway  LR Clonase Enzyme mix  Invitrogen 11791019
Mouse reagents
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade Promega P1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 Becton Dickinson 329461
Mortor pestle Coor tek  60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM) Butler Schien 29405
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator Thermo scientific
Swing bucket rotor centrifuge 5810R Eppendorf
TC-10 automated cell counter Bio-RAD This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting

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References

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जेनेटिक्स अंक 94 JAK2 बीसीआर / एबीएल TKI यादृच्छिक mutagenesis दवा प्रतिरोध काइनेज निरोधक,
Kinase Inhibitors के खिलाफ प्रतिरोधी परिवर्तन की स्क्रीनिंग और सत्यापन के लिए एक विधि
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Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors. J. Vis. Exp. (94), e51984, doi:10.3791/51984 (2014).

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