Summary
Entstehung der genetischen Resistenz gegen Kinase-Hemmer-Therapie stellt große Herausforderung für eine effektive Krebstherapie. Identifizierung und Charakterisierung von Mutationen resistent gegen ein neu entwickeltes Medikament hilft bei der besseren klinischen Behandlung und der nächsten Generation Drug-Design. Hier beschreiben wir unser Protokoll für in-vitro-Screening und Validierung von resistenten Mutationen.
Abstract
Die Entdeckung von BCR / ABL als Treiber Onkogen bei chronischer myeloischer Leukämie (CML) in Folge der Entwicklung von Imatinib, die in der Tat gezeigt, das Potential von Targeting-Kinase in Tumoren durch effektive Behandlung der CML-Patienten. Diese Beobachtung revolutioniert die Medikamentenentwicklung, die onkogenen Kinasen in verschiedenen anderen Krebserkrankungen, wie zum Beispiel, EGFR, B-RAF, KIT und PDGFRs verwickelt Ziel. Jedoch ist ein Hauptnachteil der Antikinase-Therapien die Entstehung von Resistenzen Mutationen wodurch das Ziel, reduzierte oder keine Affinität für das Medikament erfolgt. Das Verständnis der durch resistente Varianten hilft nicht nur bei der Entwicklung der nächsten Generation Inhibitoren, sondern gibt auch Impulse für die klinische Behandlung mit personalisierten Medizin verwendeten Mechanismen. Wir berichteten einen retroviralen Vektor basierte Screening-Strategie, um das Spektrum der Resistenz verleihen, Mutationen in der BCR / ABL, die bei der Entwicklung der nächsten Generation der BCR / ABL-Inhibitoren geholfen hat, zu identifizieren. Mit Ruxolitinib und JAK2 als Target Paar, beschreiben wir in vitro-Screening-Verfahren, die die Maus BAF3 Zellen, die die zufällige Mutation von JAK2-Kinase-Bibliothek nutzt.
Introduction
Proteinkinasen sind wichtige regulatorische Enzyme des intrazellulären Signalübertragungswege, die scheinbar jeden Zellfunktion modulieren. Eine ordnungsgemäße Kontrolle der Kinase-vermittelten Signal ist von entscheidender Bedeutung, um die Homöostase und Entwicklung, die vor allem stützt sich auf angemessene Regelung der Kinasen, Phosphatasen und dessen Abbau durch UPS (Ubiquitin-Proteasom-System). Dereguliert Kinasen stehen im Mittelpunkt von vielen Krebsarten und in vielen menschlichen Krankheiten 1 gebracht. Menschliche Genom kodiert mehr als 500 Proteinkinasen, die in Verbindung gebracht wurden, direkt oder indirekt, zu ~ 400 Krankheiten des Menschen 2. Diese Beobachtungen unterstützt das Konzept zum therapeutischen Targeting von Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren 3-5.
Der Nachweis der ABL-Kinase-Inhibitoren, wie Imatinib, bei der Behandlung von chronisch-myeloischer Leukämie (CML), wenn der Beweis des Konzeptes für diesen Ansatz 6,7. Diese Beobachtung nicht nur revolutioniert die Ameisei-Kinase-Therapie, sondern auch die Idee durchgesetzt, um die genetischen Läsionen in anderen Tumorerkrankungen zum therapeutischen Targeting, die Entdeckung von onkogenen Mutationen im JAK2 von Polycythaemia vera (PV) und Patienten mit myeloproliferative Neoplasien (MPN) führen könnten. Diese Entdeckung großes Interesse bei der Behandlung MPNs, indem sie auf JAK2 mit kleinen Molekül-Inhibitoren. Jetzt, fast ein Dutzend von JAK2-Inhibitoren sind in klinischen Versuchen und einer von ihnen wurde kürzlich zur Behandlung von Myelofibrose zugelassen. Während spezifische Ausrichtung der onkogenen Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren bei Krebserkrankungen zu bringen vielversprechende Ergebnisse, leidet es auch aus Entwicklungs Widerstand gegen die Behandlung. In der Tat, so weit, Patienten mit Kinase-Inhibitoren, wie Imatinib, Gefitinib, Erlotinib und Dasatinib behandelt wurden, entwickelten Resistenz-Mutationen vor allem durch den Erwerb von Mutationen in der Kinase-Domäne, zu der Droge zielt 8-10. Widerstand infolge Genmutation hebt die Einschränkungen of gezielten Monotherapie gegen die onkogenen Kinasen, und steht für die nächste Herausforderung in der Entwicklung immer erfolgreiche Krebs-Chemotherapie. Mechanistische und funktionelle Konsequenzen von Resistenzen sollte eine Begründung für die Auswahl und Gestaltung der kostenlose Verbindungen für die Medikamentenentwicklung liefern. Mutationen durch in vitro-Screens, jedoch ein hohes Maß an Übereinstimmung mit den in Patienten gefunden gezeigt. Daher wird in-vitro-Screening auf Mutationen, die Medikamentenresistenz für eine gegebene Wirkstoff-Target-Paaren in klinischen oder präklinischen Entwicklung unterstützt verleihen beim Identifizieren der Widerstandsmuster, die wahrscheinlich klinischen Rückfall verursachen. Die Identifizierung dieser Mutantenformen ist nicht nur nützlich bei der Überwachung der Patienten, die Arzneimittelreaktion und Rückfall, sondern auch für die Gestaltung der robusteren nächsten Generation Inhibitoren wesentlich. Zum Beispiel die Entwicklung der nächsten Generation von BCR / ABL-Inhibitoren Nilotinib und Ponatinib, machte wegen der größeren mec wurden möglichhanistic Vereinbarungen gewonnenen Mutagenese, strukturelle und funktionelle Untersuchungen.
Früher haben wir die Ergebnisse unserer Bildschirm mit Zufallsmutagenese von BCR / ABL, das Spektrum der Mutationen, die Resistenz gegen Inhibitoren wie Imatinib 11,12, PD166326 12 und 13 zeigen, AP24163 wiesen. Die Ergebnisse nicht nur identifiziert, die Mutationen, die klinische Festigkeit und Krankheitsrückfall, aber auch das mechanistische Verständnis der Arzneimittelresistenz und Grundsätze für die Kinasefunktion 11,14 vorgesehen. Hier finden Sie zusätzliche methodische Details, mit Ruxolitinib und JAK2 als Target-Paar, um eine breitere Anwendung dieser Screening-Strategie zu ermöglichen.
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Protocol
HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden nach dem National Institute of Health Richtlinien für die ethische Behandlung und Pflege von Tieren durchgeführt, und nach einer genehmigten IACUC Tiernutzung Protokoll.
1. Zell Line Maintenance
- Kultur BAF3-Zellen in RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und Penicillin / Streptomycin (100 Einheiten / ml und 100 ug / ml) und verbrauchtes Zuchtmedium der WEHI-Zellen. Wachsen HEK293T-Zellen in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und Penicillin / Streptomycin (100 Einheiten / ml und 100 ug / ml). Pflegen Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 enthielt.
2. Plasmidkonstruktion
- Klonen Sie die Maus JAK2 und seine onkogene Isoform JAK2 V617F-in pMSCV-puro-GW by LR Clonase mit Standard-Rekombination Klonierungsverfahren.
- Für die Konstruktion der Luciferase-Expressionsvektor (pMSCV-Luc-Kirsche-GW) vi in verwendet invo Bildgebung zu verstärken Luciferase aus pLVX-Tet-ON-Vektor durch PCR unter Verwendung von Primern (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG und LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) folgte mit Klonen in pENTR-SD-TOPO zu pENTR-Luc, die verwendet wird, zu erzeugen um die Luciferase-Gen in retroviralen Vektor, pMSCV-Kirsche-GW durch Rekombination vermittelten Klonen mit LR Clonase übertragen.
3. Herstellung von Zufallsmutation Bibliothek, Screening und Identifizierung der Mutationen
3.1) Zufallsmutagenese
- Klon voller Länge von JAK2 Wildtyp und die Mutation V617F in pMSCV-puro-GW retroviraler Vektor mit einem handelsüblichen Rekombination Klonen Technologie.
- Verwenden Sie 1 ug JAK2 V617F-Plasmid-DNA zu transformieren, XL-1 Red, E. coli-Zellen, die in DNA-Reparaturmechanismen defekt und dass sie daher zufällige Mutationen während der Replikation zu integrieren ist. Genauer gesagt, mischen 50-100 ng DNA (mehr als 100 ng DNA verringert Transformationseffizienz) mit 100 & mgr; l kompetente Zellen in ein vorgekühltes Polypropylen Rohr und auf Eis für 30 min inkubiert, leicht schwenken alle 5 min. Für eine gute Bibliothek Berichterstattung verwenden vier vor sechs Röhren kompetenter Zellen.
HINWEIS: Mehr als 100 ng DNA verringert Transformationseffizienz - Eintauchen der Röhre in ein Wasserbad bei 42ºC einem Hitzeschock von 45 sec und Inkubation auf Eis für 2 min. Als nächstes wird mit 1 ml SOC-Medium (2,0% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,05% NaCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 und 0,4% D-Glucose). Das Röhrchen bei 37 ° C unter Schütteln bei 225-250 rpm für 90 min.
- Platten Zellen aus jedem Röhrchen auf vier 10 cm-LB-Agarplatten enthaltend 100 ug / ml Ampicillin. Die Platten für 16 inkubieren - 24 h bei 37 ° C.
- Nach sichtbaren Kolonien, sammeln sie durch Abschaben der Platten mit einer sterilen Platte Schaber. Pool-Zellen von jeder Platte und Plasmid-DNA-Isolat mit einem handelsüblichen Plasmid-Extraktions-Kits.
HINWEIS: In der Regel Kolonien sind kleiner und nehmen 18-24 h zu seinsichtbar, da es sich langsam wachsende Bakterienstämme. Zu diesem Zeitpunkt beurteilt die Heterogenität von Mutationen in der Bibliothek durch Restriktionsverdau mit häufig vorkommenden Schnittstellen, wie Sau3A1 oder Taq1 oder Sequenzierung.
3.2) Herstellung von Retrovirale Überstände und Transduction
- Einen Tag vor der Transfektion Platte 4 x 10 6 HEK 293T Zellen auf 100-cm-Schalen in DMEM, enthaltend 10% FCS, Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
- Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium und Transfektion der Zellen mit mutierten pMSCV-JAK2-V617F-Bibliothek. Für jede 10-cm-Platte, nimm 10 & mgr; g DNA (5 ug der Plasmid-Bibliothek und 5 ug von retroviralen Verpackungsplasmid, pCLEco) mit 40 ul FuGENE auf ein Gesamtvolumen von 400 & mgr; l unter Verwendung von serumfreiem DMEM-Medium. Inkubieren der DNA und Lipidmischung für 20 min bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten wird die DNA-Lipid-Komplex tropfenweise auf der Oberseite der HEK293T-Zellen.
- Nach sechs Stunden, ändern Sie das Transfektionsmedium with frisches Medium und Inkubation der Platten für 48 Stunden bei 37 ° C für die Virusproduktion. Nach 48 Stunden Inkubation gesammelt viralen Überstände durch ein 0,45 um Acrodisc-Filter filtriert.
3.3) Selektion resistenter Klone In-vitro-
- Für arzneimittelresistente JAK2 V617F-Mutanten, transduzieren 100 Millionen BaF3-Zelle mit 100 ml Virusüberstände mit einem Virustiter von 0,5-1 x10 6. Genauer mischen 10 8 Zellen mit 100 ml Virusüberstand bis zu einem Gesamtvolumen von 300 ml unter Verwendung von RPMI-Medium, das 10% Serum und 24 & mgr; g / ml polyberene (Endkonzentration ployberene beträgt 8 & mgr; g / ml). Verteilen Sie diese Zellenmischer in mehreren sechs Well-Platten (4-5 ml pro Vertiefung).
- Zentrifugieren der Platten bei 1.250 xg für 90 min bei 25 ° C. Nach der Zentrifugation inkubiert, die Platten bei 37 ° C für 24 Stunden.
- Am nächsten Tag, bündeln die Zellen untereinander und mit Ruxolitinib und Medium mit weichem Agar mischen und in si verchromtx-Well-Platten. Für jede Arzneistoffkonzentration, Mischungs 10 ml transduziert BAF3-Zellen (10-20 Millionen Zellen) mit der entsprechenden Menge an Ruxolitinib in ein 50 ml Röhrchen. Stellen Sie die Lautstärke auf 40 ml mit RPMI mit 20% Serum. 10 ml 1,2% Agar zu den Zellen, mixcarefully und Platte in sechs Well-Platten.
- Die Platten bei 37 ° C inkubieren, für zwei Wochen. Wählen Sie die resistenten Kolonien mit 0,2 ml Pipettenspitzen und Subkultur sie einzeln in 24-Well-Platten für 3-4 Tage.
- Ernte der beständigen BAF3-Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Isolieren der genomischen DNA mit einem handelsüblichen Isolierung genomischer DNA Kit. PCR zu amplifizieren voller Länge JAK2 cDNA von 100 ng genomischer DNA unter Verwendung der Primer (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG und mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) und langfris Vorlage erweitern High Fidelity PCR-Systeme.
- Trennen der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Verbrauchsteuern Das 3,4 kb-DNA-Bande, die JAK2 Codierrahmen und zu isolieren, die DNA-mit einem handelsüblichen Gelextraktionskit. Sequenz der vollen Länge der cDNA mit 8 internen Primer (P1 - P8) überspannt die codierende Sequenz und Analyse-Sequenzen unter Verwendung kommerzieller Software.
4. In-vitro-Validierung Beständig Mutationen
Viele Zellklone tragen mehr als eine Mutation, um den Beitrag jeder Mutation in Resistenzphänotyp testen erzeugen ausgewählten Varianten durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung pMSCV-JAK2V-617F-Plasmid als Matrize.
- Führen ortsgerichtete Mutagenese auf pMSCV-JAK2-V617F-Plasmid mit einem handelsüblichen Mutagenese-Kits und Oligonukleotide entwickelt, um Punktmutationen erstellen. Bestätigen Sie die Identität der Mutante Klone durch Sequenzierung.
- Transduzieren BAF3 Zellen mit Retroviren unter Verwendung mutierten Plasmide folgte mit Auswahl mit Puromycin bei 1 ug / ml.
- Platte 10 4 BAF3-JAK2 V617F-Zellen (50 ul RPMI mit 10% FCS) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Getrenntly werden 50 ul der Ruxolitinib haltigen Medien zu den Vertiefungen in der Platte (Endkonzentration: 0, 1, 3, 5, 10, und 20 & mgr; M), und Inkubieren der Platten für 60 Stunden bei 37 ° C.
- Beurteilen Zellviabilität durch Zugabe von 10 & mgr; l WST-1 Reagens zu jeder Vertiefung mit einer Inkubation bei 37 ° C für 2-4 Std. Nehmen Absorption bei A450 mit einem Plattenlesegerät. Führen Sie alle Tests in dreifacher Ausfertigung und Grundstück gemittelte Extinktion gegen INCB018424 Konzentrationen. Führen Sie eine Best-Fit-sigmoidalen Kurve mit einem nicht-linearen Kurvenanpassungsalgorithmus. Note die Arzneimittelkonzentration, die zu 50% Lebensfähigkeit der Zellen als zelluläre IC50.
- Als nächstes Platte sechs Millionen BAF3-Zellen, die JAK2 Varianten in sechs Lochplatten in RPMI-Medium mit 10% Serum mit ansteigenden Konzentrationen von Ruxolitinib und für 4-6 h bei 37 ° C inkubiert.
- Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g für fünf Minuten bei 4 ° C. In 20 mM Tris-Cl Waschen der Zellen einmal mit PBS und Lyse (pH 7,5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 2 mM Natriumvanadat, und 5% Glycerol mit Protease-Inhibitor-Cocktail und Phosphatase-Inhibitoren ergänzt wird. Beschallen die Zellsuspension für 1 min, gefolgt von der Zugabe von 5x Gel-Ladepuffer (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM Benzamidin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM Natriumvanadat , Protease-Cocktail, 50% Glycerin und 0,001% Bromphenolblau) und Denaturierung bei 70 ° C für 5-10 min.
- Lösung der Proteine auf einem 8% SDS-Polyacrylamid-Gel unter denaturierenden Bedingungen. Führen Immunoblotting mit monoklonalen Maus anti-phopsho STAT5. Isolieren Sie die Flecken und sondiert mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-SATA5 Antikörper. Visualisieren Sie die Bänder unter Verwendung von ECL-Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.
5. In-vivo-Validierung
- Transduzieren BAF3 Zellen Luciferase und Kirsch Ausdruck (transduziert mit Retroviren aus pMSCV-Luc-cher gemachtry GW) mit Viren, die JAK2 V617F-und resistente Varianten. Wählen Sie die Zellen, die Puromycin-Selektion für die Expression von JAK2 und sein Widerstand Varianten überleben.
- Injizieren zwei Millionen aktiv wachsenden BAF3-Luc / Kirsch tragenden Zellen JAK2 V617F-und seine resistente Varianten in 200 ul PBS bis 6 Balb / C-Mäusen über eine Schwanzvenen-Injektion.
- Nach drei Tagen Zelltransplantationen, spritzen die Mäuse mit Ruxolitinib (100 mg / kg) zweimal täglich für zwei Wochen.
- Führen Luciferase basierenden Biolumineszenz-Bildgebung mit einem Bildgebungssystem. .
- Kurz gesagt, bereiten Luciferin durch Auflösen von 300 mg auf 25 ml sterilem deionisiertem Wasser, aliquoten in kleineren Mengen und zu speichern.
HINWEIS: Shop Luciferin bei -80 ° C und vor Licht geschützt bis zur Verwendung. - Volumina von 250 ul jeder Maus durch IP 125 mg / kg in jeder Maus zu erzielen. Anesthetize die Mäuse von derselben Unternehmensgruppe zusammen mit inhalativen Isofluran (1,5% -2,0%) in einer verschlossenen Box. Bewerben Tierarzt Salbe auf the Auge bis zur Trockenheit zu verhindern.
HINWEIS: Die Zeit für Mäuse genommen zu schlafen (10-15 min) erlaubt Luciferin Aktivität zu Spitze. Halten Sie die Zeit konsistent zwischen den Gruppen der Variation zu vermeiden.
- Kurz gesagt, bereiten Luciferin durch Auflösen von 300 mg auf 25 ml sterilem deionisiertem Wasser, aliquoten in kleineren Mengen und zu speichern.
- Übertragen Sie die Maus sofort auf Imaging-Kammer Bühne und Aufrechterhaltung einer Narkose bei 1,5-2% Isofluran bei bildgebenden Verfahren. Bild Mäusen mit sequentieller 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 und 300 s Belichtung. Machen Sie Bilder und zu quantifizieren Biolumineszenz-Intensität mit der Bildaufnahme und Analyse-Software. Nach Bildgebung zurückzukehren die Mäuse wieder in seinen Käfig.
- Für In-vivo-Chimärismus Ernte Gesamtknochenmark-Zellen. Euthanize die Mäuse mit CO 2 für 5 min mit zervikaler Dislokation. Ernten Sie die Knochen und zerschlagen in 4 ml kaltem PBS, um das Knochenmark zu sammeln. Analysieren Sie die Kirsche Prozent positiver Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop und quantifiziert mittels FACS. Sammeln zwanzigtausend Veranstaltungen von jeder Probe.
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Representative Results
Entstehung von genetischen Mutationen wirft große Herausforderung für die gezielte Anti-Kinase-Therapie. Mutationsstudien, neben der Bereitstellung von Mechanismen und funktionelle Erkenntnisse, die maßgeblich an der Auswahl und Gestaltung der nächsten Generation der Medikamentenentwicklung sind, ermöglicht auch eine bessere klinische Behandlung und können in Zukunft mehr hilfreich für personalisierte Behandlung. In diesem Experiment zeigen wir Screening Ruxolitinib Resistenzmutationen in JAK2 V617F-Kinase (Abbildung 1). Wir konstruierten pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway Vektor durch die Einführung der in voller Länge der Maus-JAK2 V617FcDNA in pMSCV-Kirsche-GW. Es wird empfohlen, bakteriellen Wirt (XL-1-rot-Stamm von E. coli), um zufällige Mutationen über die beliebteste Wahl der Methode, die PCR ist aufgrund ihrer Einschränkungen Folge Bias und größeren Genfragmente verbunden sind schwer zu verstärken entwickeln . Zufällig mutagenisierten DNA-Bibliothek wurde für Retrovirusproduktion zu HEK293T-Zellen transfiziert. Diese Mutante virVerwendungen wurden verwendet, um, transduzieren BaF3-Zellen, die für Wachstum der Kolonien in Weichagar in Abwesenheit von IL-3 mit 1 oder 5 uM Ruxolitinib ausgewählt. Unter diesen Bedingungen entstehen Kolonien nur aus Zellen, die JAK2V-617F cDNAs, die funktionell und resistente Variante der Kinase exprimiert. Nach 10-14 Tagen wurden gut getrennte einzelne Kolonien ausgewählt, die in der Größe variiert, und erweitert sie in Flüssigkultur. Genomische DNA wurde aus diesen Zellen isoliert. Das Provirus wurde durch direkte Rettung oder durch PCR gewonnen. Die wiedergewonnenen Proviren wurden sequenziert, um Mutationen (1) zu identifizieren. Sequenzanalysen wurden unter Verwendung von DNASTAR Lasergene-Paket.
Da viele Zellklonen durchgeführt mehr als eine Mutation, empfehlen wir dringend Validierung dieser Mutationen in Isolation von in vitro und in vivo-Tests (Abbildungen 2 und 3). Um die Aktivität von Varianten für sich zu überprüfen,ausgewählten Varianten wurden durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt der JAK2V-617F-Sequenz. Diese Varianten wurden in BAF3-Zellen wieder zugeführt, und für die Zellproliferationsfähigkeit bei unterschiedlichen Dosierung Ruxolitinib IC50 (IC50 Werte, 2A) zu bewerten, gemessen. Biochemischen Assays für Phosphotyrosin oder Phospho-STAT5 durch Immunoblot-Analyse auf Proteinlysate von BAF3 Zellen, die mit steigenden Dosen von Ruxolitinib um jede vorbei vermittelte Resistenz (2B) inkubiert wurden durchgeführt. Mutants bei höheren Konzentrationen Ruxolitinib ausstellenden verbesserten IC50-Werte und anhalt Autophosphorylierung ist damit festgestellt, um arzneimittelresistente Varianten sein. Da viele Mutationen resistent zeigen variable Dosiswirkung, ist es daher unerlässlich, um zu testen, ob diese Mutationen in vivo Beständigkeit sowie verleihen. In der Regel empfiehlt es sich, nur 2 -3 verschiedene Varianten für die in-vivo-Experimente zu testen, da sie teuer sind undmühsam. Um in vivo Widerstand zu validieren, wurden BAF3 Zellen entwickelt, um JAK2 V617F-Varianten und Luciferase / Kirsch ausdrücken, in vivo-Tracking aktivieren. Mäuse wurden mit 1 bis 2.000.000 Kirsch positive Zellen (exprimierenden JAK2 Varianten und Luciferase), gefolgt von Injektion Ruxolitinib für zwei Wochen injiziert. Nach zwei Wochen wurden die Mäuse auf Luciferase-katalysierter Biolumineszenz (Abbildung 3) zum BAF3 Chimärismus im Knochenmark und peripheren Blut durch Messen der Fluoreszenz der Kirsche positive Zellen (3) abgebildet wird, und auch. Mäuse, die JAK2 V617F-empfindlich sind Ruxolitinib, während resistente Varianten zeigen progressive Zunahme der Biolumineszenz über den Zeitraum der Behandlung, was darauf schließen lässt, dass BAF3-Zellen JAK2 V617F-Variante exprimieren, resistent gegenüber Ruxolitinib Behandlung in vivo.
Abb. 2: Eine schematische Darstellung, in-vitro-Validierung mit der Dosis abhängigen Zellproliferationsassays (A) und Western-Blot (B) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. 
Abbildung 3: Eine schematische Darstellung der in vivo Validierung mit Luciferase katalysierte Biolumineszenz-Messung. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion dieser Figur.
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Discussion
Der klinische Erfolg von Imatinib in der Behandlung von CML zeigten nicht nur das Potenzial der gezielt die rouge Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren, sondern auch aufgedeckt Grenzen der zielgerichteten Therapie: klinischen Rückfall und Entstehung von Resistenzen Mutationen im Zielgen. Identifikation von Resistenzmutationen hilft bei der besseren klinischen Management und die Entwicklung der nächsten Generation von Inhibitoren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Arzneimittel-resistente Mutationen im Zielgen identifiziert. Dieses Verfahren benutzt einen zufällig mutagenisierter Plasmidbibliothek in E. gebaut coli, die Mutanten-Proteine exprimieren. Die Bibliothek wird dann in BAF3-Zellen (empfänglicher für die Transformation durch ein Onkogen) eingeführt, gefolgt von Selektion von Zellklonen in Gegenwart von chemotherapeutischen Mitteln. Die Sequenzierung des Zielgens aus resistente Klone identifiziert Mutationen eine Resistenz. Schließlich identifizierten Mutationen durch ortsgerichtete Mutagenese neu erstellt, um sie für die ValidierungResistenzen.
Mit dieser Strategie definierten wir das Spektrum von Mutationen in JAK2 und BCR / ABL, die Resistenz gegen Ruxolitinib und Imatinib auf. Wir identifizierten mehr als hundert Mutationen in der BCR / ABL. Außerdem identifiziert alle wichtigen Mutationen bei Patienten festgestellt, erlaubt unsere Screeningmethode mit uns neue Substitutionen von Resten innerhalb und außerhalb der Kinase-Domäne zu identifizieren. Interessanterweise haben alle Mutationen von unserem Bildschirm in Patientenproben identifiziert worden, aber dieser Prozess dauerte fast mehr als 10 Jahren 15 und bewiesen damit die Fähigkeit dieser Bildschirm, um Mutationen, die klinisch problematischen Resistenzen stellen wird zu antizipieren. Während beständig Screening mittels Zufallsmutagenese bietet viele Vorteile im Vergleich zu anderen Methoden gibt es Fallstricke zu beachten, wenn nach einer Screening-Verfahren sein. Für jede Screening, wird dringend empfohlen, für BAF3 Zellen vollständig abhängig von der Ziel zu sein, gegen die resiHaltung angestrebt wird. Ein Ausfall oder teilweise abhängig von der Ziel-Gen kann sich nicht entwickeln wahr resistenten Klone und wahrscheinlich entwickeln Fehlalarme. Zum Beispiel sind vier verschiedene Studien beständigen Abschirmung gegen JAK2 Inhibitoren mit BAF3-Zellen entweder EPO oder MPL-Rezeptoren transduziert JAK2 V617F-Abhängigkeit 16-19 erleichtern geführt. Nur acht beständig Mutationen beschränkt auf Domain-Kinase wurden aus diesen Bildschirmen identifiziert, obwohl zahlreiche resistente Klone entwickelt, die Mutationen durch Entstehung von False Positives, die Heterodimerisierung von JAK1 und JAK3 mit Zytokin-Rezeptoren zugeschrieben wurde, fehlte, vermutlich. Deshalb, um den Verlust von JAK2 Abhängigkeit vermeiden, führten wir beständig Screening im Klar BAF3 die robust Selektion resistenter Klone gegen Ruxolitinib und alle diese Klone zeigten zeigten Gegenwart resistenter Mutationen. Basierend auf diesen Beobachtungen, um das gesamte Spektrum der Mutationen resistent zu nutzen, empfehlen wir, die BaF3 Zells sollten vollständig abhängig von der Proteinkinasen richtet, um die Entstehung von False Positives zu vermeiden, da es eine Norm in früheren beständig Abschirmungen gegen JAK2-Hemmer 16,17 durchgeführt. Zusätzlich ist es entscheidend, Großkulturbedingungen, bei denen Zellen, die verschiedene Mutationen enthalten, werden vereinigt und man ließ sie in Flüssigkultur expandieren zu vermeiden, da dieses zu einem klonalen Dominanz weniger hoch Arzneimittel-resistenten Varianten führen. Zum Beispiel während der anfänglichen Auswahl von Imatinib-Widerstand des mutagenisierten BCR-ABL in Großflüssigkultur, fanden wir nur 4 Mutantenformen, die mehrmals innerhalb der ersten 100 Isolaten sequenzierten wir vertreten waren. Daher Screening mit Weichagar ermöglicht langsam wachsenden Klone mit bescheidener Grad der Arzneimittelresistenz zurückgewonnen werden, die nicht mit Groß Kultur identifiziert werden würde. Aus diesem Grund ist es empfehlenswert, Groß Kultur vor der Auswahl nur für 14 bis 16 Stunden wachsen, gefolgt mit Drogenauswahl ohne IL3 in Weichagar. In unserem ExErfahrung, wachsen die Kulturen über 36 Stunden nach der Virusübertragung sind in der Regel von hoch proliferativen Klone, die eine Gefahr für langsam wachsende Klone verlieren (schwach transformative) stellt dominiert. Ebenso mit Zellen aus einer früheren Zeitpunkten, wie 6-8 Stunden nach der Virusübertragung sind anfällig für hochtransformative oder Überexpression Klone auszuwählen, wodurch eine Vorspannung und Täuschung in der Identität und Häufigkeit der Resistenz-Klone. Daher empfehlen wir die Verwendung von Zellen, die für 14 bis 16 Stunden nach der Virusübertragung für das Screening, die enge Auswahl von einzelnen Klonen bietet und verhindert, dass klonale Dominanz in der Regel in Großflüssigkulturen beobachtet gewachsen.
Es ist wichtig, ein Kandidat die Mutation die Fähigkeit zur Resistenz isoliert bestätigen, da einige Klone identifiziert, mehrere Mutationen. Für die JAK2 V617F-Bildschirm, neu wir einen Großteil der von unserem Zufallsmutagenese Bibliothek identifizierten Mutationen mit ortsgerichteter MutageGenese. Nach Einbringen der isolierten Mutanten in frischen Zellen wurden sie dann in Gegenwart verschiedener Arzneimittel zu bestimmen IC50s für jede Mutante gezüchtet. Wir testeten auch zwei verschiedene resistente Varianten für die in vivo Beständigkeit durch Überwachen der Biolumineszenz, die Fähigkeit dieser Einzelmutationen Arzneimittelresistenz in vivo führen weiter zu bestätigen.
Angesichts des Erfolgs Antikinase-Therapie bei der Behandlung von Krebsarten, die eine Welle von Kinase-Inhibitoren in Kliniken verzinkt, ist es entscheidend, die klinisch problematisch Beständigkeit verleih Mutationen für bessere Behandlungsmanagement und die Entwicklung von Arzneimitteln, die sie als Ziel identifizieren können. Dieses Screening-Strategie wurde erfolgreich eingesetzt, um Mutationen in der BCR / ABL, JAK2 und FLT3 20 zu identifizieren; Jedoch glauben wir, dass es im Allgemeinen anwendbar auf einen weiten Bereich von Antitumormitteln sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
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- Melnikova, I., Golden, J.
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