Abstract
ميرنا الاستنساخ والإنتاجية العالية التسلسل، وصف مير تسلسل، تقف وحدها كنهج Transcriptome على صعيد لتحديد miRNAs لقرار النوكليوتيدات واحد. هذه التقنية تلتقط miRNAs عن طريق ربط محولات 3 'و 5' قليل النوكليوتيد إلى جزيئات ميرنا وتتيح دي نوفو ميرنا الاكتشاف. اقتران قوية مع الجيل المقبل من منصات التسلسل، وكان مير تسلسل دور فعال في دراسة ميرنا البيولوجيا. ومع ذلك، تحيزات كبيرة أدخلها قليل النوكليوتيد خطوات ربط منعت مير تسلسل من يجري استخدامها كأداة الكميات دقيقة. وتظهر الدراسات السابقة أن التحيز في وسائل مير يليها الحالية غالبا ما تؤدي إلى عدم دقة ميرنا الكمي مع أخطاء تصل إلى 1،000 أضعاف لبعض miRNAs 1،2. لحل هذه التحيزات الكشف عنها من قبل RNA ربط، قمنا بتطوير طريقة RNA الصغير الذي يؤدي إلى ربط الكفاءة ربط أكثر من 95٪ لكل 3 'و 5' خطوات عملية ربط. هذا القياس ايمأثبتت طريقة البناء باستخدام مكتبة miRNAs الاصطناعية متساوي المولية أو المختلطة بشكل مختلف، ينتج باستمرار يقرأ الأرقام مع الانحراف شقين من أقل من القيمة المتوقعة. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الطريقة ذات الكفاءة العالية مير تسلسل دقيق الجينوم على نطاق ميرنا التنميط في الجسم الحي من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (2).
Introduction
تم تطبيق المنهجيات القائمة على الإنتاجية العالية التسلسل على نطاق واسع في العديد من العينات البيولوجية في السنوات الأخيرة توسع إلى حد كبير فهمنا لتعقيدات النظم البيولوجية الجزيئية 3،4. ومع ذلك، وإعداد عينات الحمض النووي الريبي عن الإنتاجية العالية التسلسل غالبا ما يضفي التحيزات الكامنة محددة لالمنهجية المستخدمة، مما يحد من إمكانية الاستفادة من هذه التقنيات القوية. تم هذه التحيزات طريقة محددة موثقة جيدا عن القائم على الربط، صغير RNA الاستعدادات مكتبة 1،2،5،6. هذه التحيزات تؤدي إلى تباين 1000 أضعاف في ما يلي أرقام لmiRNAs الاصطناعية متساوي المولية، مما يجعل الاستدلال من وفرة ميرنا من البيانات التسلسل متغير بعنف والخطأ عرضة.
وقد وثقت الدراسات التي تركز على خصائص T4 ligases RNA المستمدة فج أن الإنزيمات تظهر تفضيلات القائمة على النوكليوتيدات 7، والذي يعبر عن المكتبات متحيزة كما في الإنتاجية العالية التجارب التسلسل
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: من المهم جدا للحفاظ على ظروف خالية من ريبونوكلياز خلال الإجراء بأكمله.
1. Adenylation 3 "رابط
- تمييع قليل النوكليوتيد الحمض النووي مصمم لردود الفعل 3 "ربط إلى 100 ميكرومتر في nuclease خالية H 2 O.
ملاحظة: يجب أن يكون للقليل النوكليوتيد على "مجموعة فوسفات، وثنائي النوكليوتيد العشوائية في 5 '5 النهاية، و" dideoxycytosine 3. 5 'مجموعة الفوسفات هو شرط للانزيم MTH لكفاءة 5 "adenylation 10. الفوسفات يمكن أن تضاف لما قبل العلاج للقليل النوكليوتيد مع كيناز عديد النوكليوتيد، أو أمر مع التعديل مباشرة. وثنائي النوكليوتيد العشوائية في النهاية 5 'مهم لتقليل تفضيل تسلسل الحمض النووي الريبي التي ligases معرض لبعض نهاية نهاية الانضمام ردود الفعل على الآخرين 6. 3 'dideoxycytosine يضع عنصر الحجب في نهاية 3' للر قليل النوكليوتيدس تمنع تشكيل concatamers رابط، رابط أثناء الخطوات اللاحقة ربط ويخدم أيضا لمنع 3 "نهاية جزيء ميرنا-رابط شكلت في نهاية 3 'رد فعل ربط 11. تسلسل قليل النوكليوتيد رابط اختياره للأسلوب متحيز مير تسلسل كما يلي: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 ". - تجميع التفاعل التالي adenylation: 200 بمول 3 "قليل النوكليوتيد رابط، 4 ميكرولتر 10X 5" عازلة adenylation DNA، 4 ميكرولتر 1 ملم ATP، 4 ميكرولتر MTH RNA يغاز، nuclease خالية H 2 O إلى الحجم النهائي من 40 ميكرولتر.
- احتضان رد الفعل عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إنهاء رد فعل عن طريق تسخين إلى 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- يعجل رابط adenylated بإضافة 2.5 حجم الإيثانول بنسبة 100٪ وحجم 10 1/3 خلات الأمونيوم M لإزالة ATP المتبقية ومنع عملية ربط غير متوقعة في ردود الفعل المستقبلية.
- باختصار، مزيج آلcohol، والملح، والحل بنسبة ضئيلة إلى التجانس، والغزل بأقصى سرعة في microcentrifuge (~ 15000 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. غسل بيليه في الايثانول 70٪، والهواء الجاف، وresuspend في حجم مناسب من nuclease خالية H 2 O لانتاج 50-100 ميكرومتر من adenylated بنسبة ضئيلة.
- تأكيد adenylation عن طريق تشغيل هلام بولي أكريلاميد 18٪.
- تحضير هلام عن طريق خلط التالية معا: 6.3 ز اليوريا، 6.75 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد، و 1.5 مل من 10X TBE. إضافة H 2 O إلى 15 مل.
- المزيج حتى يذوب تماما اليوريا وإضافة 150 ميكرولتر 10٪ (ث / ت) فوق كبريتات الأمونيوم (APS) و 15 ميكرولتر tetramethlyethylenediamine (TEMED).
- مرة واحدة وقد وضعت جل، قبل تشغيل لمدة 30 دقيقة عند 24 فولت / سم من العرض هلام مع 1X TBE تشغيل عازلة في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة 30 دقيقة هو ما يصل آبار الاحمرار مع تشغيل العازلة.
- مزيج 5 بمول من [أليغنوكليوتيد adenylated وعلى قدم المساواة مع حجم 2X تغيير طبيعة عازلة RNA تحميل (95٪ (V / V) الفورماميد،0.02٪ (ث / ت) SDS، 0.02٪ برموفينول الأزرق (ث / ت)، 0.01٪ (ث / ت) سيانول زايلين، 1.0 ملي EDTA)، لفترة وجيزة الحرارة إلى 75 درجة مئوية، والمفاجئة تبريده على الجليد. الاستغناء عينة بأكملها إلى البئر من هلام. وتشمل أيضا مبلغ مماثل من السيطرة غير adenylated، وانخفاض مستويات الجزيئية حجم الوزن.
- تشغيل هلام في 24 فولت / سم حتى الأزرق برموفينول هو ¾ من الطريق إلى أسفل هلام. تفكيك الجهاز، جل ما بعد صمة عار مع حل 1X SYBR الذهب في 1X TBE وتصور على مربع UV-نقل transilluminator (الشكل 2).
ملاحظة: جل تنقية جزئية adenylated بطريقة مماثلة لتلك المذكورة أعلاه إذا "أي إدخال RNA" الضوابط الناجمة عنها في كمية عالية من الناتج PCR بالمقارنة مع عينات الحمض النووي الريبي المدخلات.
2. رابط لربط 3 "نهاية ميرنا
- 3 "ربط
- تجميع المكونات التالية على الجليد في الترتيب المسرود: 1.0 ميكرولتر 50٪ (ث / ت) PEG 8000، 0.5 و# 956؛ ل 10X عازلة RNA يغاز (500 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 100 ملي MgCl 2 و 10 ملي DTT)، 1.0 ميكرولتر adenylated 3 "رابط (100 ميكرون)، 0.5 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، 0،5-8،0 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع، 0.5 ميكرولتر T4 RNA يغاز 2، nuclease خالية H 2 O إلى الحجم النهائي من 5 ميكرولتر.
- مزيج رد فعل من قبل pipetting هو الحل هو لزج جدا لدوامة بسبب تركيز عال من PEG 8000. مختلطة مرة واحدة بدقة، ووضع رد الفعل في cycler الحرارية مع غطاء ساخنة. تعيين كتلة إلى 16 درجة مئوية، واحتضان لمدة 4 ساعات.
ملاحظة: قد يتم تحجيم رد الفعل يصل إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر من دون أي خسارة في الكفاءة ربط. تتفاعل لمدة 4 ساعة عند درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لانتاج الكفاءات ربط متطابقة في جوهرها.
- هلام تنقية
- بعد 3 'ربط، مزيج التفاعل مع حجم مساو من RNA 2X العازلة تحميل. الحرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والمفاجئة باردة على الجليد. تشغيل العينة على 15٪ هلام بولي أكريلاميد لتنقية PAGE.
- إعداد 15٪ هلام بولي أكريلاميد تحتوي على 7 M اليوريا، بطريقة مماثلة لتلك التي سبق وصفها في الخطوة 1.5.
- قبل تشغيل هلام في 24 فولت / سم من العرض هلام لمدة 30 دقيقة على الأقل. إيقاف إمدادات الطاقة، وتدفق الآبار، عينة الحمل وهلام المدى في نفس الجهد كما ما قبل التشغيل.
- تحميل العينة وتشغيل الصفحة حتى الأزرق برموفينول قد خرجت للتو من هلام. المنتج المطلوب سوف تنتقل قريبا من cyanol زيلين.
- بعد 3 'ربط، مزيج التفاعل مع حجم مساو من RNA 2X العازلة تحميل. الحرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والمفاجئة باردة على الجليد. تشغيل العينة على 15٪ هلام بولي أكريلاميد لتنقية PAGE.
- تلطيخ، والتصور، والختان
- تفكيك جهاز جل وهلام مكان في علبة نظيفة مع 1X تشغيل عازلة (TBE)، 1X SYBR الذهب، والصخور لمدة 15 دقيقة.
- إزالة هلام من تلطيخ طبق وتصور على مربع نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية مغطاة غلاف بلاستيكي نظيف. يجب أن يكون المنتج ربط حوالي 45 النيوكليوتيدات في الطول.
- استئصال المنطقة التي تحتوي على المنتج ربط مع razo نظيفةشفرة ص ومكان في 0.5 مل أنبوب الطرد المركزي الصغيرة.
- عزل المنتج والهطول
- بيرس أسفل أنبوب 0.5 مل ميكروسنتريفوج مع 30 G إبرة ووضع أنبوب مثقوب في الثانية نظيفة ومنخفضة الاحتفاظ، 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ~ 15000 ز س.
- تأكيد بصريا أن شريحة هلام كلها تحركت من خلال ثقب في الانبوب الداخلي. إذا لزم الأمر، استخدم طرف ماصة نظيفة لدفع بعض شظايا هلام أقرب إلى ثقب.
- تجاهل فارغة أنبوب 0.5 مل وإضافة 400 ميكرولتر من العازلة العمود عالية من الملح (كلوريد الصوديوم HSCB 400 ملم، 25 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 0.1٪ SDS) إلى الطين مادة الأكريلاميد. أنبوب الروك (ق) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
- تحويل الطين إلى 0.22 ميكرون خلات السليلوز عمود الدوران باستخدام ماصة واسعة الجوف. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في ~ 15000 x ج لجمع كل السائل بعيدا عن هلام الأكريلاميد المصفوفة.
- نقل السائل نظيفة ومنخفضة الاحتفاظ، أنبوب 1.5 مل تحتوي علىجي 1 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الجليكوجين. إضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول و1/10 عشر حجم خلات الصوديوم. مزيج حل عن طريق أنبوب قلب عدة مرات ويعجل في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- الطرد المركزي بأقصى سرعة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتكوير الحمض النووي. إزالة طاف ويغسل في الايثانول 70٪. بيليه الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والانتقال مباشرة إلى 5 "خطوة الربط.
3. ربط رابط ل5 "نهاية ميرنا-3" رابط الهجين
- لالحمض النووي مكعبات، إضافة العناصر التالية: 2 ميكرولتر PEG 8000 (50٪ ث / ت)، و 0.5 ميكرولتر 10X RNA يغاز العازلة، 0.5 ميكرولتر ATP (10 ملم)، و 0.5 ميكرو لتر NN-RNA بنسبة ضئيلة (100 ميكرون)، وH 2 O إلى الحجم النهائي من 4 ميكرولتر.
ملاحظة: تكوين "بنسبة ضئيلة NN-RNA" كما يلي مقلوب 5'dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 "وتنقيته عبر HPLC من قبل الشركة المصنعة. - مزيجهذه العينة من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. القيام بذلك لبعض الوقت (تصل إلى 5 دقائق) للتأكد من أن بيليه قد تم الانتهاء من إعادة يذوب. إذا إعادة الإذابة هو إشكالي، تسخين لفترة وجيزة العينة (3-5 دقيقة) إلى 37 درجة مئوية واستئناف pipetting لخلط.
- مرة واحدة بيليه يعود في حل، ونقل المحتويات إلى أنبوب PCR نظيفة تحتوي على 1 ميكرولتر من 1: 1 خليط من ريبونوكلياز المانع و T4 RNA يغاز 1 (5 وحدات). مرة أخرى عن طريق خلط pipetting صعودا وهبوطا.
- احتضان رد الفعل في cycler الحرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. الشروع فورا في التوليف [كدنا].
4. عكس النسخ / [كدنا] التجميعي
- إضافة المكونات التالية ل5 'رد فعل الربط: 2 ميكرولتر عازلة 5X RT، 0.75 ميكرولتر 100 ملي DTT، 1 ميكرولتر RT التمهيدي البورشيد 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 "(1 ميكرون)، و 0.5 ميكرولتر dNTPs (10 ملم).
- مزيج من قبل pipetting والحرارة إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم تبرد ببطء على مقاعد البدلاء رالمرجع.
- بمجرد أن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة رد فعل، أنبوب مكان على الجليد وإضافة 0.5 ميكرولتر كل من إنزيم الناسخ العكسي وريبونوكلياز المانع. مزيج من قبل pipetting ومكان في cycler الحرارية للخطوة التمديد المشار إليها في تعليمات الشركة الصانعة.
- مرة واحدة كاملة إضافة 5 ميكرولتر من nuclease خالية H 2 O لجلب الحجم النهائي للمكتبة [كدنا تصل إلى 15 ميكرولتر.
5. إعداد المكتبة
- لفهرسة PCR، تجميع التفاعل التالي على الجليد: 6 ميكرولتر 5X Phusion العازلة، 1 ميكرولتر dNTPs (10 ملم)، 0.9 ميكرولتر DMSO، 0.75 ميكرولتر 5 'التمهيدي (25 ميكرومتر)، 0.75 ميكرولتر 3 "التمهيدي (25 ميكرومتر)، مكتبة 3 ميكرولتر [كدنا] (تركيز متغير اعتمادا على كمية من المدخلات)، 0.5 ميكرولتر Phusion البلمرة (1 وحدة)، nuclease خالية H 2 O إلى الحجم النهائي من 30 ميكرولتر. اختيار متواليات التمهيدي لضمان التوافق مع القالب ومنصة تسلسلالاختيار.
- تشغيل تفاعل PCR مع الإعدادات التالية: تمسخ الأولي في 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، لأول 4 دورات، تفسد 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، ويصلب عند 50 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، تمتد على 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية .
ملاحظة: اعتمادا على كمية من المواد المدخلات، وتختلف الأرقام الإجمالية دورة PCR. عادة، للحصول على مدخلات من 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع، مجموع 13 دورات PCR تكفي لتوليد مكتبة مير تسلسل. - تنفيذ دورات لاحقة، على سبيل المثال، دورات 5-12، بطريقة من خطوتين حيث يتم الجمع بين دورات الصلب والإرشاد ونفذت في 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وتمسخ مرة أخرى 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
ملاحظة: حجم رد الفعل هو 30 ميكرولتر للسماح التوقف برنامج PCR وإزالة قسامة 10 ميكرولتر في دورة أرقام محددة مسبقا لمراقبة ظهور المنتج المطلوب. عادة، دورات 10 و 13 و 16 يتم اختيارهم للاختبار من عينة الحمض النووي الريبي مجموع.
- تشغيل تفاعل PCR مع الإعدادات التالية: تمسخ الأولي في 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، لأول 4 دورات، تفسد 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، ويصلب عند 50 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، تمتد على 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية .
- إعداد8٪ غير تغيير طبيعة هلام الأكريلاميد عن طريق خلط 2 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد، 1 مل من 10X TBE، وH 2 O إلى 10 مل. ثم إضافة 100 ميكرولتر من 10٪ APS و 10 ميكرولتر من TEMED. صب جل وترك مجموعة.
- قبل تشغيل هلام في 12 فولت / سم من العرض هلام لمدة 30 دقيقة. آبار الاحمرار. إضافة 1 ميكرولتر من 10X العازلة تحميل (15٪ Ficoll-400، 66 ملي EDTA، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 0.1٪ (ث / ت) SDS، 0.01٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق)، وإضافة 10 ميكرولتر من عينة إلى كل بئر من أبعاد 5 مم × 1 مم × 15 مم. عادة، يمكن تحميل كل بئر يصل إلى 30 ميكرولتر من العينات. تشغيل هلام عينة في 10 V / سم من العرض هلام العازلة في 1X TBE حتى صبغة زرقاء برموفينول يعمل فقط من الجزء السفلي من هلام.
- وصمة عار وتصور الجل كما هو موضح في الخطوة 2.3.
- استئصال قاعدة الفرقة 146 زوج وأزل بين عشية وضحاها في 0.25 مل من HSCB بطريقة مماثلة لما هو موضح في القسم 2.4. ترسيب الحمض النووي في حجم مساو من الأيزوبروبانول و1/10 عشر حجم خلات الصوديوم. غسل بيليه في 70٪ هthanol وresuspend في TE العازلة.
- قياس المكتبة باستخدام picogreen وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب أن النتائج المتوقعة للطريقة السابقة تكون في البداية رصد تحولا النوكليوتيدات واحد (الزيادة) في حجم قليل النوكليوتيد الحمض النووي التي كانت تخضع لadenylation كتبها MTH RNA يغاز (الشكل 2). بعد 3 'الربط، والتصور من هلام الأكريلاميد يشير (انظر الشكل 3) حادة عالية الوزن الجزيئي فرق واضح في المنطقة النوكليوتيدات من هلام 100-300. هذا يشير إلى أن عينة الحمض النووي الريبي مجموع المستخدمة هي ذات جودة عالية (لا تتحلل). ثانيا ينبغي للمرء أن نلاحظ إشارة ساطعة جدا في المنطقة 25 النوكليوتيدات من هلام، وهي الزائدة، unligated 3 "رابط. كما قد يكون من المفيد لتشمل مراقبة أي إدخال RNA في 'ربط 3. وهذا يدل على نقاء رابط 3 '، وأيضا يمكن أن يتم من خلال إلى الخطوة PCR للدلالة على رقم الدورة عندما يصبح إشارة غير محددة إشكالية. لا يوجد تشخيص لربط 5 'ولكن هو مبين في الشكل (4) هو رد فعل مماثلة لتلك المذكورة نفذت مع RNA المسمى الراديو مما يدل على أهمية تركيز عال من PEG8000 المستخدمة. أخيرا، وبعد يمكن ملاحظة PCR وPAGE الأم، منتج الحمض النووي من 146 أزواج قاعدة متسقة مع حجم متواليات محول، وإدراج ميرنا، وتسلسل إضافي من الاشعال PCR الموسعة. من المهم أن نلاحظ أنه إذا تجاوز عدد مناسب من دورات PCR (والتي يتم تحديدها تجريبيا)، والمنتج إدراج أي ميرنا قد تخفي حجم amplicon المطلوب. هو مبين في الشكل رقم 5 هو نتيجة من 5 pmoles الاصطناعية ميرنا، عادة لمدة 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع 13-18 دورات PCR ضرورية.
الشكل 1. تخطيطي لسير العمل ل2-خطوة ربط صغير RNA إعداد مكتبة. Shown هي الخطوات العامة لإعداد مكتبة مير تسلسل متحيزة. يظهر باللون الأسود هو 3 "محول ربط الحمض النووي، والتي يتم تفعيلها من خلال adenylation في الخطوة 1، يظهر باللون الأخضر وميرنا هو ligated إلى 3" محول في الخطوة 2، و 5 'محول ربط RNA هو باللون الأزرق الذي هو ligated ل ووصف جزيء خيالية في الخطوة 3. الخطوات مرقمة بالتفصيل في قسم البروتوكول، مائل تشير الخطوات الأنزيمية.
الشكل 2. Adenylation من 3 ". رابط مع MTH-RNA يغاز 18٪ هلام صفحة اليوريا من adenylation من قليل النوكليوتيد الحمض النووي لاستخدامه في وقت لاحق 3 رد فعل ربط، (+) إلى العينة التي تم تحضين مع MTH RNA يغاز، (- ) يدل على عينة حضنت دون الانزيم، و (م) يشير إلى معايير الحجم (الأرقام الظاهرة ور الحق في أزواج القاعدة). على اليسار هو التخطيطي من الأنواع قليل النوكليوتيد الحالية. وتشير النجمة المنتجات DNA اكبر الناتجة عن التوليف قليل النوكليوتيد الشاذة.
الرقم 3. 3 "ربط العينات الاصطناعية وإجمالي RNA. A) 15٪ هلام صفحة 3 من اليوريا "ردود الفعل ربط، (م) إلى معايير حجم (أرقام على اليسار تشير أزواج القواعد)، (أي RNA) يشير إلى وجود رد فعل مع أي RNA المدخلات و3" رابط هذا لم يكن هلام تنقية (+) إلى ربط يؤديها مع 5 بمول الاصطناعية ميرنا و3 "رابط الذي كان هلام تنقية، (2 و 1 ميكروغرام) تشير إلى كمية من الحمض النووي الريبي مجموع الماوس يتعرض ل3 'الربط مع نفسه، هلام تنقية رابط ، النجمة تشير إلى فائض 3 "رابط. ب) صورة الإشعاع الذاتي مماثل من 3 رد فعل ربط يؤديها مع P 32 5 "إنهاء المسمى الاصطناعية ميرنا. رقم في أعلى يشير الوقت (ساعة) سمح للرد فعل على المضي قدما، وعلى القاع يشير إلى كمية و ligated كنسبة مئوية من مجموع unligated وو ligated.
الرقم 4. 5 'ربط الإذاعة وصفت-ميرنا-3'Linker الهجين. صورة الإشعاع الذاتي من 5 رد فعل ربط أجريت مع 32 P 5' نهاية المسمى الاصطناعية ميرنا-3 "رابط الهجين. رقم يشير إلى أعلى كمية PEG المستخدمة في رد فعل، وعدد في القاع يشير إلى كمية و ligated كنسبة مئوية من مجموع unligated وو ligated. خطوط في اليسار هي التخطيطي للجزيئات و ligated حيث ميرنا هي باللون الأخضر، 5 'و 3' محولات والأزرق والأسود، على التوالي.
pload / 52095 / 52095fig5highres.jpg "/>
الشكل 5. PCR-RNA المستمدة من الحمض النووي مكتبة صغيرة. PAGE 8٪ الأصليين من المنتجات PCR ولدت من مير تسلسل إجراءات الربط. أرقام في أعلى تشير دورات PCR، إلى جانب أرقام تشير إلى معايير حجم الجزيئية. يتم تعريف كل نوع من الحمض النووي PCR في الحق. ومن المقرر أن صناعة السيارات في مضان من طبق عينة نمط الشبكة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منهجية الموصوفة هنا يجعل من استخدام العديد من المتغيرات الرئيسية لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ربط، وهي تركيزات عالية من PEG، واستخدام linkers العشوائية، وتركيز عال من linkers 2،6،9. هذا النهج يسمح مكتبات التسلسل الكمية موثوق من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (2). قمنا بإجراء المعايرة متعددة من المدخلات RNA والتي خلصت إلى أن المنهجية السابقة هو الانسب لمجموع المبالغ RNA في حدود 1-8 ميكروغرام (لا تظهر البيانات). عندما تستخدم كميات في حدود 10-500 نانوغرام، ويستهلك معظم مساحة للقراءة من قبل concatamers محول وسلاسل من البكتيريا التي يتم تنقيته من ligases RNA. ومع ذلك، فمن الجدير بالذكر في هذه التجارب المدخلات المنخفضة التي الأنواع مير الحالية، على الرغم من انخفاض عدد يقرأ، لا تزال تعكس المبالغ الفعلية مقارنة عينات مطابقة المدخلات أعلى. من أجل ضمان أن ملامح مير احظ من مجموع عينات الحمض النووي الريبي هي انعكاس الفعليةالمبالغ، والسماح للاستجواب من عينات مختلفة، ونحن تشمل عادة التخفيفات 10 أضعاف من ثلاثة الرنا تدريج الاصطناعية 12. وقد وجدنا أن إدراج 0.1: 0.01: 0.001 بمول من الرنا تدريج متميزة تسفر مفيد يقرأ الأرقام لتأكيد الطبيعة الكمية للفحص.
كما هو موضح في الشكل 1 (انظر النجمة) [أليغنوكليوتيد الاصطناعية في كثير من الأحيان تحتوي على جزيئات الشاذة التي تختلف في الحجم من تسلسل أمر. إذا كانت هذه المنتجات قادرة على المشاركة في تطهير مع ميرنا-3 "رابط الهجين، ومن ثم قد تكون ضرورية لتنقية PAGE 3 'رابط التالية MTH adenylation. لقد وجدت هذا مفيدا لتقليل كمية المنتجات PCR غير محددة لوحظت في عينات السيطرة السلبية.
على الرغم من أن المنهجية المذكورة أعلاه تم إجراء مقارنة معيارية لإعداد الكمي للمكتبات ميرنا 2، ونحن نتوقع تماما أن ذلك هو بسهولة التطبيقlicable إلى إجراءات أكثر عمومية كذلك؛ وهي RNA-يليها وCLIP تسلسل (كروس لينك المناعي-الهطول) إعداد مكتبة. في الواقع، لقد استخدمنا بعض من نفس المبادئ المنهجية السابقة لكليب يليها التجارب مما أدى إلى مكتبة قوية PCR نسبة إلى تقارير منشورة سابقا 13 (لا تظهر البيانات). أخيرا، وكما miRNAs المصل اكتساب الجر كأداة تشخيصية الطبية، نتوقع أن المنهجية السابقة تساعد إلى حد كبير في تحديد المؤشرات الحيوية الأكثر قوية وموثوق بها ميرنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10x Ligation buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10x Ligation buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina index primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2x Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low retention microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
