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Biology

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

Published: November 18, 2014 doi: 10.3791/52095
Automatic Translation
1, 1,2
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

Abstract

Mirna clonagem e sequenciamento de alto rendimento, denominada miR-Seq, assume-se como uma abordagem ampla transcriptoma quantificar miRNAs com resolução de nucleotídeo único. Esta técnica de captura miARNs, anexando os adaptadores 3 'e 5' de oligonucleótidos para moléculas de miARN e permite a descoberta de novo miARN. Acoplamento com plataformas de sequenciamento de próxima geração poderosos, miR-Seq tem sido fundamental para o estudo da biologia miRNA. Contudo, desvios significativos introduzidas por passos de ligação de oligonucleótidos têm impedido o miR-SEQ de ser empregado como uma ferramenta de quantificação precisa. Os estudos anteriores demonstram que polarizações em métodos de miR-Seq actuais conduzem frequentemente a quantificação imprecisa miARN com erros de até 1.000 vezes superior para algumas miARNs 1,2. Para resolver estes preconceitos, transmitidas por meio de ligação de ARN, temos desenvolvido um método de ligação de ARN pequenas que resulta em eficiências de ligação de mais de 95% tanto para 3 'e 5' etapas de ligação. O benchmarking este improvou método de construção da biblioteca utilizando miARNs equimolares sintéticos ou mistos diferencialmente, produz consistentemente lê números com desvio inferior a duas vezes a partir do valor esperado. Além disso, essa alta eficiência método miR-Seq permite preciso de todo o genoma miRNA perfil de in vivo total de amostras de RNA 2.

Introduction

Metodologias baseadas em alta capacidade de sequenciamento têm sido amplamente aplicada em muitas amostras biológicas nos últimos anos em expandir muito a nossa compreensão da complexidade molecular de sistemas biológicos 3,4. No entanto, a preparação de amostras de RNA de high-throughput seqüenciamento muitas vezes transmite preconceitos específicos inerentes à metodologia empregada, o que limita a utilidade potencial destas técnicas poderosas. Estes método específico polarizações ter sido bem documentado para preparações de biblioteca, de pequena ligadura de ARN baseado em 1,2,5,6. Estes preconceitos resultar em variação mil vezes na lê números de miRNAs sintéticos equimolares, fazendo inferência de abundância miRNA a partir de dados de sequenciamento descontroladamente variável e sujeito a erros.

Os estudos focam as propriedades de ligases T4 RNA derivadas de fagos têm documentado que as enzimas exibem preferências à base de nucleótidos 7, que se manifestam como bibliotecas enviesados ​​em experiências de sequenciação de alto rendimento 9, randomizando a sequência de nucleótidos do adaptador que é proximal em relação ao local de ligação 6, e empregando concentrações elevadas de adaptador de ligação 2. Através de uma combinação destes três abordagens temos desenvolvido um fluxo de trabalho para a preparação isenta de bibliotecas de ARN pequenas compatíveis para a sequenciação de alto rendimento (Figura 1). Para comparações diretas entre os protocolos atuais e nosso método otimizado, por favor consulte o nosso recente relatório 2. Este método produz optimizado eficiências de ligação de mais de 95% em ambas as 3 'e 5' etapas e permite a ligação isenta de moléculas de ARN a partir de pequenas amostras biológicas sintéticas e 2.

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Protocol

NOTA: É crítico para manter condições isentas de RNase durante todo o procedimento.

1. adenilação de 3 'Linker

  1. Diluir oligonucleótido de ADN concebidos para reacções 3 'de ligação para 100 uM em meio livre de nuclease de H 2 O.
    NOTA: O oligonucleótido deve ter um 'grupo fosfato, um dinucleótido randomizados no terminal 5' 5 fim, e um "3 didesoxicitosina. A 5 'grupo fosfato é um requisito da enzima Mth para eficiente 5' 10 adenilação. O fosfato pode ser adicionado ao pré-tratamento do oligonucleótido com um polinucleótido-quinase, ou encomendado com a modificação directa. O dinucleótido randomizado na extremidade 5 'é importante para minimizar a preferência ligases de ARN que exibem determinados para-extremidade final juntando reacções sobre os outros seis sequência. A 3 'didesoxicitosina coloca um elemento de bloqueio na extremidade 3' do oligonucleótido to inibir a formação de concatâmeros ligante-ligante durante os passos de ligação subsequentes e também serve para bloquear 'extremidade da molécula de miARN-Ligante formada na extremidade de 3' da reacção de ligação 3 11. A sequência de oligonucleótido ligante escolhido para o método de miR-Seq imparcial é como se segue: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 '.
  2. Montar o seguinte reacção adenilação: 200 pmol 3 'oligonucleótido ligante, 4 ul 10x 5' tampão de adenilação de ADN, ATP 1 mM de 4 ul, 4 ul de RNA-ligase Mth, livre de nuclease H 2 O para um volume final de 40 ul.
  3. Incubar reacção a 65 ° C durante 1 hora. Terminar a reacção por aquecimento a 85 ° C durante 5 min.
  4. Precipitar ligante adenilada pela adição de 2,5 volumes de etanol a 100% e 1/3 volume de 10 M de acetato de amónio para remover o ATP residual e para evitar imprevistos em ligaduras reacções futuras.
    1. Resumidamente, misture o alcohol, sal, oligo e solução até à homogeneidade, girando à velocidade máxima numa microcentrífuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C durante 20 min. Lavou-se a pelota em etanol a 70%, ar seco, e ressuspender em um volume apropriado de livre de nuclease H 2 O para dar 50-100 uM de oligo adenilada.
  5. Confirme adenilação executando um gel de poliacrilamida 18%.
    1. Prepare o gel por mistura do seguinte em conjunto: 6,3 g de ureia, 6,75 ml de 40% de acrilamida, e 1,5 ml de 10x TBE. Adicionar H2O a 15 ml.
    2. Misturar até que a ureia é completamente dissolvido e adicionar 150 ul 10% (w / v) de persulfato de amónio (APS) e 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED).
    3. Depois gel definiu, pré-corrida por 30 minutos a 24 V / cm de largura com gel TBE 1x tampão de corrida à temperatura ambiente. Depois de 30 minutos é de até poços lave com tampão de corrida.
    4. Misturar 5 pmol de oligonucleótidos adenilada e com igual volume de tampão de carga desnaturante ARN 2x (95% (v / v) de formamida,0,02% (w / v) de SDS, 0,02% de azul de bromofenol (w / v), 0,01% (w / v), xileno cianol, EDTA 1,0 mM), o calor rapidamente para 75 ° C, e SNAP arrefecida em gelo. Dispensar amostra inteira dentro do poço do gel. Também incluem uma quantidade idêntica de controle não-adenilada e baixos padrões de tamanho peso molecular.
    5. Submeter o gel a 24 V / cm até o azul de bromofenol é ¾ do caminho para o fundo do gel. Desmonte aparelho, gel pós-mancha com uma solução de SYBR-gold 1x em 1x TBE e visualizar na caixa UV-transilluminator (Figura 2).
      NOTA: Gel purificar o oligo adenilada de um modo semelhante ao descrito acima, se "nenhum ARN de entrada" controles estão resultando numa elevada quantidade de produto de PCR, em comparação com amostras com níveis de ARN de entrada.

2. Ligador Ligadura para 3 'Fim da miARN

  1. 3 'Ligadura
    1. Montar os seguintes componentes em gelo, na ordem indicada: 1,0 ul de 50% (w / v) de PEG 8000, 0,5 &# 956; l 10x tampão de ligase de RNA (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 ul adenilada 3 'Ligante (100 uM), 0,5 ul de inibidor de RNase, 0,5-8,0 ug de RNA total, 0,5 ul de RNA-ligase de T4 2, livre de nuclease H 2 O para um volume final de 5 mL.
    2. Misturar por pipetagem a reacção como a solução é demasiado viscoso para vórtice, devido à alta concentração de PEG 8000. Uma vez cuidadosamente misturado, coloque a reacção num termociclador com uma tampa aquecida. Definir o bloco a 16 ° C, e incubar durante 4 horas.
      NOTA: A reacção pode ser dimensionado para um volume final de 20 ul, sem qualquer perda na eficiência da ligação. Reagir durante 4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, para se obter eficiências de ligação essencialmente idênticos.
  2. Gel Purificação
    1. Após 3 'ligadura, misturar a mistura reaccional com um volume igual de 2x tampão de carga de ARN. Aquece-se a 70 ° C durante 5 min, e encaixe fria em gelo. Correr a amostra num gel de poliacrilamida a 15% para a purificação PAGE.
      1. Prepare-se um gel de poliacrilamida a 15% contendo ureia 7 M, de um modo semelhante ao descrito anteriormente no passo 1.5.
      2. Pré-correr o gel a 24 V / cm de largura do gel para, pelo menos, 30 min. Desligue a alimentação, lavar poços, amostra de carga e gel corrida em mesma tensão como pré-corrida.
      3. Coloque a amostra e execute a página até o azul de bromofenol acaba de sair o gel. O produto desejado migrará perto do cianol xileno.
  3. Coloração, visualização e Excisão
    1. Desmonte aparelho de gel e coloque gel na bandeja limpa com 1x tampão de corrida (TBE), 1x SYBR-ouro e pedra para 15 min.
    2. Retire o gel da coloração prato e visualizar na caixa transiluminador UV coberta com filme plástico limpo. O produto de ligação deve ser cerca de 45 nucleótidos de comprimento.
    3. Impostos especiais de consumo da região que contém o produto da ligação com uma razo limpor lâmina e coloque em 0,5 ml tubo micro-centrífuga.
  4. Isolamento produto e precipitação
    1. Pierce fundo do tubo 0,5 ml de microcentrífuga com uma agulha de 30 G e colocar o tubo perfurado em um segundo limpo, baixa retenção, 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Centrifugar durante 5 min a 15.000 x g ~.
    2. Visualmente confirmar que toda a fatia de gel foi movido através do furo no tubo interior. Se necessário, use uma ponta de pipeta limpa para empurrar alguns fragmentos de gel mais perto do buraco.
    3. Descartar o tubo vazio de 0,5 ml e adicionar 400 ul de tampão de coluna de alto teor salino (HSCB NaCl 400 mM, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, SDS a 0,1%) para a pasta de acrilamida. Tubo (s) de rocha, a 4 ° C durante a noite.
    4. Transferência de lodo a uma coluna de rotação de acetato de celulose de 0,22 micron, com uma pipeta de ponta de todo o furo. Centrifugar durante 3 minutos à temperatura ambiente em ~ 15.000 xg para recolher todo o líquido para longe da matriz de gel de acrilamida.
    5. Transferir o líquido para um, de baixa retenção limpo, tubo de 1,5 ml contering 1 ml de 20 mg / ml de glicogênio. Adicionar um volume igual de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio. Misturar a solução por inversão do tubo várias vezes e precipitar no freezer -80 ° C durante 20 min.
    6. Centrifugar a plena velocidade a 4 ° C durante 20 min para sedimentar o ácido nucleico. Remover o sobrenadante e lava-se em etanol a 70%. Ar sedimento seco durante 10 min à temperatura ambiente e seguir directamente a 5 'passo de ligação.

3. Ligador Ligadura para 5 'Fim da miARN-3' Ligador híbrido

  1. Para o ácido nucleico sedimentadas, adicionar os seguintes componentes: 2 uL de PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ul de RNA-ligase 10x Tampão, 0,5 ul de ATP (10 mM), 0,5 ul de RNA-NN oligo (100 uM), e H 2 O para um volume final de 4 mL.
    NOTA: A composição do 'oligo NN-ARN "é como se segue 5'-didesoxi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 invertido' e foi purificado por HPLC pelo fabricante.
  2. Misturaresta amostra por pipetagem cima e para baixo repetidamente. Fazer isso há algum tempo (até 5 minutos), para assegurar que o sedimento foi completamente re-solubilizado. Se a re-solubilização é problemático, aquecer a amostra brevemente (3-5 min) a 37 ° C e retomar pipetagem para misturar.
  3. Uma vez que o sedimento é de volta em solução, transferir o conteúdo para um tubo limpo de PCR contendo 1 ml de uma mistura 1: 1 de inibidor de RNase e T4 RNA ligase 1 (5 unidades). Novamente misture por pipetagem cima e para baixo.
  4. Incubar a reacção num termociclador a 37 ° C durante 4 h. Prosseguir imediatamente para a síntese de cDNA.

4. Transcrição Reversa / cDNA Synthesis

  1. Adicionar os seguintes componentes para a 5 'da reacção de ligação: 2 ul de tampão 5x RT, 0,75 ul de DTT 100 mM, 1 ul Iniciador RT Ilumina-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA 5'-3' (1 uM), e 0,5 ul de dNTPs (10 mM).
  2. Misturar por pipetagem e aquecer a 65 ° C durante 5 min. Em seguida, resfriar lentamente no banco top.
  3. Depois da reacção ter arrefecido até à temperatura ambiente, coloque o tubo em gelo e adicionar 0,5 ul de cada enzima transcriptase inversa e um inibidor de RNase. Misturar por pipetagem, e colocados no termociclador para o passo de extensão indicado nas instruções do fabricante.
  4. Uma vez completa suplemento de 5 ul livre de nuclease H2O para levar o volume final da biblioteca de cDNA até 15 ul.

5. Preparação Biblioteca

  1. Para a indexação de PCR, montar a seguinte reacção em gelo: 6 ul de 5x Tampão Phusion, 1 ul de dNTPs (10 mM), 0,9 ul de DMSO, 0,75 ul 5 'iniciador (25? M), 0,75 ul iniciador 3' (25? M), biblioteca de cDNA de 3 ul (concentração variável, dependendo da quantidade de entrada), 0,5 ul Phusion polimerase (1 unidade), isento de nuclease de H 2 O para um volume final de 30 ul. Escolha as seqüências de primers para garantir a compatibilidade com o modelo ea plataforma de sequenciamento deescolha.
    1. Executar a reacção de PCR com as seguintes definições: desnaturação inicial a 98 ° C durante 3 minutos, durante os primeiros 4 ciclos, desnaturar a 98 ° C durante 15 seg, recozimento a 50 ° C durante 15 seg, estender a 72 ° C durante 15 seg .
      NOTA: Dependendo da quantidade de material de entrada, variar o total de números de ciclos de PCR. Tipicamente, para uma entrada de 1-2 ug de RNA total, 13 ciclos de PCR no total são suficientes para gerar a biblioteca de miR-Seq.
    2. Realizar os ciclos subsequentes, por exemplo, ciclos de 5-12, de um modo em duas etapas, onde os ciclos de recozimento e de extensão são combinados e realizados a 70 ° C durante 30 seg e desnaturação é novamente 98 ° C durante 15 seg.
      NOTA: O volume de reacção é de 30 uL para permitir a pausa do programa de PCR e remover uma alíquota de 10 ul em números de ciclos pré-determinados para monitorizar a aparência do produto desejado. Tipicamente, os ciclos de 10, 13, e 16 são escolhidos para o teste a partir de uma amostra de ARN total.
  2. Preparara 8% não desnaturante em gel de acrilamida por mistura de 2 ml de 40% de acrilamida, 1 ml de 10x TBE, e H 2 O a 10 ml. Em seguida, adicione 100 ml de 10% de APS e 10 ml de TEMED. Despeje gel e deixe set.
    1. Pré-correr o gel a 12 V / cm de largura de gel durante 30 min. Poços flush. Adicionar 1 ml de tampão de carregamento de 10x (15% de Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) de SDS, 0,01% (w / v) de azul de bromofenol), adicionar 10 ul de amostra a cada poço de dimensões 5 milímetros x 1 mm x 15 milímetros. Normalmente, cada poço pode carregar até 30 l de amostras. Executar o gel de amostra a 10 V / cm de largura de gel em tampão 1 x TBE até que o corante azul de bromofenol apenas corre para fora do fundo do gel.
    2. Mancha e visualizar gel como descrito no passo 2.3.
    3. Excisar o par de banda de base 146 e elui-se durante a noite em 0,25 mL de HSCB de uma forma similar ao que é descrito na secção 2.4. Precipitar o DNA num volume igual de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio. Lavar o granulado em 70% eThanol e ressuspender em tampão TE.
    4. Quantificar a biblioteca usando PicoGreen de acordo com as recomendações do fabricante.

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Representative Results

Os resultados esperados para o método anterior deve, inicialmente, ser observação de uma única troca de nucleótidos (aumento) no tamanho do oligonucleótido de ADN que foi sujeita a adenilação por Mth RNA ligase (Figura 2). Após 3 'ligadura, a visualização do gel de acrilamida indica (ver Figura 3) bandas de peso molecular elevado afiadas evidentes na região de nucleótidos 100-300 do gel. Isto indica que a amostra de ARN total a ser utilizado é de alta qualidade (não degradado). Em segundo lugar deve-se observar um sinal muito brilhante na região de 25 nucleótidos do gel, que é em excesso, sem ligadura 3 'ligante. Também pode ser útil incluir um controlo sem ARN de entrada no 3 'ligadura. Isto irá indicar a pureza do ligante 3 ', e também pode ser realizada através do passo de PCR para a indicação do número do ciclo, quando o sinal não-específico torna-se problemática. Não há de diagnóstico para ligação a 5 ', No entanto, mostrado na Figura 4 é uma reacção idêntica à descrita realizada com ARN marcado com rádio que indica a importância da elevada concentração de PEG8000 empregue. Finalmente, após a PCR e PAGE nativa, um produto de DNA de 146 pares de bases consistentes com o tamanho das sequências de adaptador, uma inserção de miARN, e sequência adicional a partir dos iniciadores de PCR estendidos pode ser observada. É importante notar que, se o número adequado de ciclos de PCR (o que é determinado empiricamente) for excedido, o produto de inserção não miARN pode obscurecer o tamanho do fragmento amplificado desejado. Mostrado na Figura 5 é um resultado de 5 pmol de miARN sintética, tipicamente durante 2 ug de ARN total são necessários 13-18 ciclos de PCR.

A Figura 1
Figura 1. Diagrama esquemático do fluxo de trabalho de 2-passo de ligação-ARN preparação pequena biblioteca. Shown os passos gerais para a preparação de uma biblioteca de miR-Seq imparcial. Mostrado em preto é 3 'do adaptador de ligação de ADN, que é activado através de adenilação no passo 1, miARN é mostrado em verde e está ligado ao terminal 3' do adaptador no passo 2, e 5 'do adaptador de ARN ligadura está no azul, que está ligado ao molécula quimérica no passo 3. As etapas numeradas são descritos em detalhe na secção de protocolo, itálico indicam passos enzimáticos.

A Figura 2
Figura 2. adenilação de 3 '. Linker com Mth ARN-ligase de 18% de gel de PAGE-ureia a partir de adenilação de oligonucleótido de ADN para ser utilizado para a subsequente 3' da reacção de ligação, (+) indica que a amostra foi incubada com ARN-ligase Mth, (- ) indica amostra incubada sem enzima, e (m) indica os padrões de tamanho (número mostrado umt direita em pares de bases). À esquerda é uma representação esquemática das espécies presentes oligonucleotídicos. O asterisco indica produtos de ADN maiores geradas por síntese de oligonucleótidos aberrante.

A Figura 3
Figura 3. 3 'Ligadura de Amostras de RNA total e sintéticas. A) 15% de gel de PAGE-Ureia de reacções de ligação 3 ', (m) indica padrões de tamanho (esquerda indicam os números em pares de bases), (ARN n) indica uma reacção sem ARN de entrada e 3' não ligante que foi purificado em gel , (+) indica a ligação realizada com 5 pmol de miARN sintético e um 3 'ligante que foi purificado em gel, (2 e 1 ug) indicar a quantidade de ARN total de rato submetido a 3' de ligação com a mesma, ligante purificado em gel , asterisco indica excesso 3 'vinculador. B) Autorradiograma de semelhante 3' reação de ligação realizada com P 32 5 'acabam rotulados miRNA sintético. Número no topo indica o tempo (h) a reacção foi deixada prosseguir, e na parte inferior indica a quantidade ligada como uma percentagem da soma de não ligada e ligada.

Figura 4
Figura 4. 5 'Ligadura da Rádio marcado miRNA-3'Linker Hybrid. Autorradiograma de 5' reação de ligação realizada com P 32 5 "fim marcado miRNA-3 sintética 'vinculador híbrido. Número no topo indica quantidade de PEG utilizado na reacção, e, no fundo, número indica a quantidade ligada como uma percentagem da soma de não ligada e ligada. Linhas na esquerda são uma esquemática das moléculas ligadas onde miRNA está no verde, 5 'e 3' adaptadores são azul e preto, respectivamente.

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Figura 5.-PCR derivado de ADN-ARN pequena biblioteca. 8% PAGE nativo de produtos de PCR gerados a partir de procedimento de ligadura miR-Seq. Números no topo indicar ciclos de PCR, os números no lado indicam padrões de tamanho molecular. Cada espécie de DNA da PCR é identificado à direita. Grade padrão é devido a auto-fluorescência da amostra prato.

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Discussion

A metodologia aqui descrita faz uso de diversas variáveis-chave para maximizar a eficiência de ligação, ou seja, altas concentrações de PEG, o uso de ligantes randomizados, e alta concentração de ligantes 2,6,9. Esta abordagem permite que bibliotecas de sequenciamento de forma confiável quantitativos a partir de amostras de RNA total de 2. Nós conduzimos várias titulações de ARN de entrada e concluíram que a metodologia anterior é o mais adequado para quantidades de ARN total na gama de 1-8 ug (dados não mostrados). Quando quantidades no intervalo de 10-500 ng são usados, a maior parte do espaço de leitura é consumido por concat�eros adaptador e sequências bacterianas a partir do qual as ligases de ARN são purificados. No entanto, é importante notar nestas experiências de entrada baixas que as espécies miR presente, embora baixa em lê número, ainda são um reflexo dos valores reais quando comparado com amostras de entrada mais altas idênticas. A fim de assegurar que os perfis de miR observados a partir de amostras de ARN total são o reflexo de realValores, e para permitir que o interrogatório de diferentes amostras, nós rotineiramente incluem diluições de 10 vezes de três RNAs calibrador sintéticos 12. Descobrimos que a inclusão de 0,1: 0,01: 0,001 pmol de ARN calibrador distintas rendimento útil lê os números para confirmar a natureza quantitativa do ensaio.

Como observado na Figura 1 (ver asterisco) oligonucleotídeos sintéticos freqüentemente contêm moléculas aberrantes que são distintas em tamanho da seqüência ordenada. Se estes produtos são capazes de co-purificam com a miARN-3 'linker híbrido, então pode ser necessário purificá-PAGE a 3' na sequência ligante Mth adenilação. Descobrimos que isso seja útil para reduzir a quantidade de produto de PCR não-específica observada em amostras de controlo negativo.

Apesar da metodologia descrita acima foi aferido para a preparação quantitativa de bibliotecas miRNA 2, prevemos plenamente que é prontamente applicable a procedimentos mais gerais, bem; ou seja, RNA-seq e CLIP-Seq (Cross link Imuno-Precipitação) preparação biblioteca. Na verdade, nós empregamos alguns dos mesmos princípios da metodologia anterior para clip-Seq experiências resultantes na biblioteca robusta PCR em relação aos relatórios publicados anteriormente 13 (dados não mostrados). Finalmente, como miRNAs soro ganhar força como uma ferramenta de diagnóstico médico, prevemos a metodologia anterior vai ajudar muito na identificação dos mais robustos e confiáveis ​​biomarcadores miRNA.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) Integrated DNA Technologies custom
5' Linker Integrated DNA Technologies custom 5' blocked, HPLC purified
T4RNL2 (1-249 K227Q) New England Biolabs M0351S Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters
10x Ligation buffer (without ATP) New England Biolabs Included with M0351S
10x Ligation buffer (with ATP) New England Biolabs Included with M0204L
RNaseOUT Invitrogen 10777-019
Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000) New England Biolabs Included with M0204L
Nuclease-free water Ambion AM9937 We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.
T4RNL1 New England Biolabs M0204L
Superscript III RT kit Invitrogen 18080-051 
Phusion PCR kit New England Biolabs M0530S
Illumina RP1 primer Integrated DNA Technologies custom Sequence information available from Illumina
Illumina RT primer Integrated DNA Technologies custom Sequence information available from Illumina
Illumina index primer(s) Integrated DNA Technologies custom Sequence information available from Illumina
40% Acrylamide Fisher Scientific BP14081
Urea Sigma Aldrich U6504
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678
Tetramethyethylenediamine (TEMED) Sigma Aldrich T9281
2x Denaturing RNA loading buffer New England Biolabs Included with M0351S
Razor blades VWR 55411-050
SpinX Centricon tubes Costar CLS8161
Low retention microfuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
Sybr Gold Invitrogen S-11494
Adenylation kit New England Biolabs E2610L

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References

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Lee, J. E., Yi, R. Highly Efficient… More

Lee, J. E., Yi, R. Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (93), e52095, doi:10.3791/52095 (2014).

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