Abstract
שיבוט מירנה ורצף תפוקה גבוהה, המכונים miR-Seq, עומד לבד כגישת transcriptome רחבה לכמת miRNAs עם רזולוציה נוקלאוטיד יחידה. טכניקה זו לוכדת miRNAs על ידי הצמדת מתאמי 3 'ו 5' oligonucleotide למולקולות מירנה ומאפשרת גילוי דה נובו מירנה. צימוד עם פלטפורמות רצף של הדור הבא חזקות, miR-Seq כבר סייע בחקר ביולוגיה מירנה. עם זאת, הטיות משמעותיות שהוצגו על ידי צעדי קשירת oligonucleotide מנעו miR-Seq להיות מועסק ככלי quantitation מדויק. מחקרים קודמים מראים כי הטיות בשיטות miR-Seq הנוכחיים לעתים קרובות להוביל לכימות מדויק מירנה עם שגיאות עד 1,000 פי כמה miRNAs 1,2. כדי לפתור הטיות אלה הנחילה ידי קשירת RNA, שפיתחנו שיטת קשירת RNA קטנה שגורמת ליעילות קשירה של מעל 95% עבור שני 3 'ו 5' צעדי קשירה. בהשוואות im זההוכיח שיטת בניית ספרייה באמצעות miRNAs הסינתטי equimolar או באופן דיפרנציאלי המעורב, באופן עקבי תשואות קוראים מספרים עם סטייה של פחות מכפולה מהערך הצפוי. יתר על כן, שיטת miR-Seq יעילות גבוהה זו מאפשרת יצירת פרופילי מירנה מדויקת הגנום מדגימות רנ"א הכל in vivo 2.
Introduction
מתודולוגיות מבוססות רצף תפוקה גבוהה כבר מיושמות באופן נרחב הרבה דגימות ביולוגיות בשנים האחרונות מאוד להרחיב את ההבנה של המורכבות המולקולרית של מערכות ביולוגיות 3,4. עם זאת, הכנת דגימות RNA לרצף תפוקה גבוהה לעתים קרובות מקנה הטיות ספציפיות הגלומות למתודולוגיה המועסקות, המגבילות את התועלת הפוטנציאלית של טכניקות רבות עוצמה אלה. הטיות שיטה ספציפית הללו תועדו היטב להכנות ספרייה מבוססת-קשירה, הקטן-RNA 1,2,5,6. הטיות אלה מובילים לוריאצית 1,000 פי בקוראים מספרים לmiRNAs הסינתטי equimolar, מה שהופך את ההיסק של שפע מירנה מנתוני רצף נוטים בפראות משתנה וטעייה.
מחקרים המתמקדים במאפיינים של ligases RNA T4-נגזר הפאג תעדו כי האנזימים להציג את העדפות המבוסס על נוקלאוטיד 7, שבאו לידי ספריות מוטות כמו בניסויי רצף תפוקה גבוהה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: זה קריטי כדי לשמור על תנאי RNase ללא במהלך ההליך כולו.
1. Adenylation של 3 'לינקר
- לדלל oligonucleotide DNA המיועד לתגובות קשירה '3 עד 100 מיקרומטר בH nuclease ללא 2 O.
הערה: oligonucleotide צריך 'קבוצת פוספט, dinucleotide אקראי ב5' 5 הסוף, וdideoxycytosine '3. 5 'קבוצת פוספט היא דרישה של אנזים MTH ל5 יעיל' adenylation 10. פוספט ניתן להוסיף על ידי טיפול מקדים של oligonucleotide עם kinase polynucleotide, או הורה עם השינוי באופן ישיר. Dinucleotide האקראי בסוף '5 הוא חשוב למזעור העדפת הרצף שתערוכת ligases RNA לסוף-סוף מסוים הצטרפות תגובות על פני אחרים 6. 3 'dideoxycytosine מציב אלמנט חסימה ב3' סוף t oligonucleotideo מעכב את ההיווצרות של concatamers מקשר מקשר במהלך שלבי קשירה לאחר מכן ומשמש גם לחסום "סוף מולקולת מירנה-לינקר נוצרה בסוף 3 '3 תגובת קשירת 11. רצף מקשר oligonucleotide שנבחר לשיטת miR-Seq משוחד הוא כדלקמן: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 '. - להרכיב את התגובה הבאה adenylation: 200 pmol 3 'oligonucleotide מקשר, 4 μl 10x 5' חיץ adenylation DNA, 4 μl 1 מ"מ ATP, 4 μl האנזים MTH RNA, H nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 40 μl.
- דגירה תגובה על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לסיים תגובה על ידי חימום עד 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לזרז מקשר adenylated על ידי התוספת של 2.5 כרכים של 100% אתנול ו 1/3 נפח של 10 אצטט M אמוניום להסיר ATP שייר ולמנוע ligations בלתי צפוי בתגובות עתידיות.
- בקצרה, לערבב אלcohol, מלח, ופתרון אוליגו להומוגניות, מסתובב במהירות מלאה בmicrocentrifuge (~ 15,000 XG) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שטוף את הכדור באתנול 70%, אוויר יבש, וגלול בנפח המתאים של H nuclease ללא 2 O להניב 50-100 מיקרומטר של אוליגו adenylated.
- לאשר adenylation על ידי הפעלת ג'ל polyacrylamide 18%.
- הכן את הג'ל על ידי הערבוב הבא ביחד: 6.3 אוריאה g, 6.75 מיליליטר של acrylamide 40%, ו -1.5 מיליליטר של 10x TBE. הוספת H 2 O ל -15 מיליליטר.
- מערבבים עד האוריאה נמס לגמרי ולהוסיף 150 μl 10% (w / v) persulfate אמוניום (APS) ו -15 tetramethlyethylenediamine μl (TEMED).
- ברגע שג 'קבע, שלפני ריצה למשך 30 דקות ב 24 V / סנטימטר של רוחב ג'ל עם TBE 1x חיץ פועל בטמפרטורת חדר. ברגע 30 דקות היא עד בארות מיושרות עם הפעלת מאגר.
- לערבב 5 pmol של אוליגונוקלאוטידים adenylated עם ונפח שווה של חיץ טעינת RNA denaturing 2x (95% v / v) Formamide (,0.02% (w / v) SDS, 0.02% bromophenol כחול (w / v), 0.01% (w / v) קסילן Cyanol, 1.0 מ"מ EDTA), חום לזמן קצר ל -75 מעלות צלזיוס, וצמד מקורר בקרח. לוותר מדגם כולו לתוך הבאר של הג'ל. כמו כן כולל סכום זהה של שליטה שאינה adenylated, ותקני גודל משקל מולקולריים נמוכים.
- הפעל את הג'ל על 24 V / סנטימטר עד bromophenol הכחול הוא ¾ מהדרך לתחתית הג'ל. לפרק מנגנון, ג'ל לאחר כתם עם פתרון SYBR-זהב 1x ב1x TBE ולדמיין על תיבת UV-transilluminator (איור 2).
הערה: ג'ל לטהר את אוליגו adenylated באופן דומה לזה שתואר לעיל, אם "אין RNA קלט" בקרות וכתוצאה מכך כמות גבוהה של מוצר ה- PCR בהשוואה לדגימות עם RNA קלט.
2. לינקר קשירת 3 End "של מירנה
- קשירת '3
- להרכיב את הרכיבים על הקרח הבאים, לפי הסדר הרשום: 1.0 מיקרוליטר 50% (w / v) 8000 PEG, 0.5 &956 #; l 10x חיץ האנזים RNA (500 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 100 מ"מ MgCl 2, 10 מ"מ DTT), 1.0 מיקרוליטר adenylated 3 'לינקר (100 מיקרומטר), מעכב RNase 0.5 μl, .5-8.0 מיקרוגרם רנ"א הכל, האנזים 0.5 μl RNA T4 2, H nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 5 μl.
- מערבבים את התגובה על ידי pipetting כפתרון הוא צמיג מדי למערבולת בשל הריכוז הגבוה של PEG 8000. מעורבים ברגע יסודיות, למקם את התגובה בCycler תרמית עם מכסה מחומם. הגדר את הבלוק 16 מעלות צלזיוס, ודגירה של 4 שעות.
הערה: התגובה יכולה להיות מדורגת עד נפח סופי של 20 μl בלי לפגוע ביעילות קשירה. להגיב ל4 שעות בטמפרטורת הסביבה או הלילה ב 4 ° C כדי להניב את יעילות קשירה זהה במהות.
- טיהור ג'ל
- בעקבות קשירה '3, לערבב את התגובה עם נפח שווה של חיץ טעינת 2x RNA. חום עד 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהצמיד מגניב על קרח. הפעל את המדגם על 15% ג'ל polyacrylamide לטיהור עמוד.
- הכן ג'ל polyacrylamide 15% המכיל 7 M אוריאה, באופן דומה לזה שתואר קודם לכן בשלב 1.5.
- טרום להפעיל את הג'ל על 24 V / סנטימטר של רוחב ג'ל ללפחות 30 דקות. כבה את אספקת חשמל, בארות סומק, מדגם עומס וג'ל לרוץ באותו מתח כמו לפני ריצה.
- טען את המדגם ולהפעיל את עמוד עד bromophenol הכחול יש רק יצא ג'ל. המוצר הרצוי יעבור קרוב לcyanol קסילן.
- בעקבות קשירה '3, לערבב את התגובה עם נפח שווה של חיץ טעינת 2x RNA. חום עד 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהצמיד מגניב על קרח. הפעל את המדגם על 15% ג'ל polyacrylamide לטיהור עמוד.
- מכתים, ויזואליזציה, וכריתה
- לפרק מנגנון ג'ל וג'ל המקום במגש נקי עם חיץ 1x פועל (TBE), SYBR-זהב 1x, ורוק במשך 15 דקות.
- הסר ג'ל ממנה מכתימה ולדמיין על תיבת transilluminator UV המכוסה בניילון נצמד נקי. מוצר קשירה צריך להיות סביב 45 נוקלאוטידים באורך.
- בלו האזור הכולל את מוצר קשירה עם razo נקילהב r ומקום ב0.5 מיליליטר צינור מיקרו צנטריפוגות.
- בידוד מוצר ורטיבות
- תחתון פירס של 0.5 צינור מיליליטר microcentrifuge עם מחט G 30 ובמקום צינור הפירסינג בנמוך ההחזקה נקייה שנייה,, 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב~ 15,000 x ז.
- חזותי לאשר שכל פרוסה ג'ל עברה דרך החור בצינור הפנימי. במידת צורך, להשתמש בקצה פיפטה נקי לדחוף כמה שברי ג'ל קרובים יותר לחור.
- מחק את צינור 0.5 מיליליטר הריק ולהוסיף 400 μl של חיץ טור גבוה מלח (HSCB 400 מ"מ NaCl, 25 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 0.1% SDS) לסלארי acrylamide. צינור רוק (ים) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- העבר את התרחיף לטור ספין אצטט 0.22 מיקרון תאית באמצעות פיפטה קצה רחב נשא. צנטריפוגה במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר בXG ~ 15,000 כדי לאסוף את כל הנוזל ממטריצת ג'ל acrylamide.
- העבר את הנוזל לשפל ההחזקה נקייה,, צינור 1.5 מיליליטר מכילing 1 μl של 20 מ"ג / מיליליטר גליקוגן. הוסף נפח שווה של isopropanol ו1/10 נתרן אצטט נפח ה. מערבבים פתרון על ידי היפוך כמה פעמים צינור ולזרז במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- צנטריפוגה במהירות מלאה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עד גלולה חומצות הגרעין. הסר supernatant ולשטוף באתנול 70%. גלולה האוויר יבשה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולהמשיך ישירות 5 צעד קשירה ".
3. מקשר קשירת 5 'סוף-3 מירנה' היברידי לינקר
- לחומצות גרעין pelleted, להוסיף את המרכיבים הבאים: 2 μl PEG 8000 (50% w / v), 0.5 μl 10x RNA אנזים מאגר, ATP 0.5 μl (10 מ"מ), 0.5 μl NN-RNA אוליגו (100 מיקרומטר), ו- H 2 O לנפח סופי של 4 μl.
הערה: ההרכב "אוליגו NN-רנ"א 'הוא כדלקמן 5'ההפוך dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3' והיה מטוהר באמצעות HPLC על ידי היצרן. - מערבביםמדגם זה על ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. לעשות את זה במשך זמן מה (עד 5 דקות) כדי להבטיח שהגלולה כבר לגמרי מחדש solubilized. אם מחדש solubilization הוא בעייתי, לחמם בקצרה המדגם (3-5 דקות) עד 37 מעלות צלזיוס ולחדש pipetting לערבב.
- ברגע שהכדור הוא חזרה בפתרון, להעביר את התוכן לצינור נקי PCR המכיל 1 μl של 1: 1 תערובת של מעכב RNase ו- T4 RNA אנזים 1 (5 יחידות). שוב מערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה.
- דגירה התגובה בCycler תרמית על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. פנה מייד לסינתזת cDNA.
4. שעתוק לאחור / cDNA סינתזה
- מוסיף את הרכיבים הבאים ל5 'תגובת קשירת: 2 μl חיץ 5x RT, 0.75 μl 100 מ"מ DTT, μl 1 Illumina RT פריימר 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 "(1 מיקרומטר), ו -0.5 dNTPs μl (10 מ"מ).
- מערבבים על ידי pipetting וחום עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן לקרר לאט בt הספסלop.
- ברגע שהתגובה מתקררת לטמפרטורת חדר, צינור מקום על קרח ולהוסיף 0.5 μl כל אחד מאנזים טרנסקריפטאז ההפוך ומעכב RNase. מערבבים על ידי pipetting והמקום בCycler תרמית לצעד הסיומת מצויינים בהוראות היצרן.
- ברגע שתוספת שלמה 5 μl של H nuclease ללא 2 O להביא את הנפח הסופי של ספריית cDNA עד 15 μl.
5. ספריית הכנה
- לאינדקס PCR, להרכיב את התגובה על קרח הבא: 6 μl 5x Phusion מאגר, dNTPs 1 μl (10 מ"מ), 0.9 μl DMSO, 0.75 μl 5 'פריימר (25 מיקרומטר), 0.75 μl 3' פריימר (25 מיקרומטר), ספריית 3 μl cDNA (ריכוז משתנה בהתאם לכמות של הקלט), 0.5 μl Phusion פולימראז (יחידת 1), H-nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 30 μl. בחר רצפי פריימר כדי להבטיח תאימות עם התבנית ואת פלטפורמת הרצף שלבחירה.
- הפעל את תגובת PCR עם ההגדרות הבאות: denaturation הראשוני על 98 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, במשך 4 המחזורים הראשונים, לפגל 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, לחשל על 50 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, להאריך ב 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות .
הערה: בהתאם לכמות חומר ההזנה, להשתנות כולל מספרי מחזור PCR. בדרך כלל, לקלט של 1-2 מיקרוגרם של רנ"א הכל, 13 מחזורי PCR כולל מספיקים כדי ליצור את ספריית miR-Seq. - לבצע מחזורים שלאחר מכן, לדוגמא, מחזורי 5-12, באופן דו-שלבים שבו מחזורי חישול וסיומת משולבים ויבוצעו על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות וdenaturation הוא שוב 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות.
הערה: נפח התגובה היא 30 μl להתיר השהיית תכנית ה- PCR ולהסיר aliquot 10 μl במספרי מחזור שנקבע מראש כדי לפקח על מראה של מוצר רצוי. בדרך כלל, מחזורי 10, 13, ו -16 נבחרו לבדיקה מסך מדגם RNA.
- הפעל את תגובת PCR עם ההגדרות הבאות: denaturation הראשוני על 98 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, במשך 4 המחזורים הראשונים, לפגל 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, לחשל על 50 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, להאריך ב 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות .
- הכן8% ג'ל acrylamide שאינו denaturing על ידי ערבוב 2 מיליליטר של acrylamide 40%, 1 מיליליטר של 10x TBE, ו- H 2 O ל 10 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 10% APS 100 μl ו -10 μl של TEMED. יוצקים ג'ל ולתת סט.
- טרום להפעיל את הג'ל על 12 V / סנטימטר של רוחב ג'ל למשך 30 דקות. בארות סומק. הוסף 1 μl של חיץ טעינת 10x (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 טריס-HCl pH 8.0 מ"מ, 0.1% (w / v) SDS, 0.01% (w / v) bromophenol הכחול), להוסיף 10 μl של מדגם היטב בכל ממדים 5 מ"מ x 1 מ"מ x 15 מ"מ. בדרך כלל, כל אחד גם יכול לטעון עד 30 μl של דגימות. הרץ את הג'ל המדגם ב 10 V / סנטימטר של רוחב ג'ל במאגר 1x TBE עד הצבע הכחול bromophenol רק נגמר תחתית הג'ל.
- כתם ולדמיין ג'ל כמתואר בשלב 2.3.
- בלו להקת זוג 146 הבסיס וelute לילה ב0.25 מיליליטר של HSCB באופן דומה למה שתואר בסעיף 2.4. משקע DNA בנפח שווה של isopropanol ו1/10 נתרן אצטט נפח ה. גלולה לשטוף בדואר 70%thanol וגלול במאגר TE.
- לכמת את הספרייה באמצעות PicoGreen פי המלצות יצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות הצפויות לשיטה הקודמת צריכים להיות בתחילת תצפית של משמרת אחת נוקלאוטיד (גידול) בגודל של oligonucleotide DNA שהיה כפוף לadenylation על ידי האנזים MTH RNA (איור 2). בעקבות קשירה '3, להדמיה של ג'ל acrylamide מציינת (ראה איור 3) להקות חדות משקל מולקולרי גבוהות באו לידי ביטוי באזור נוקלאוטיד 100-300 של הג'ל. זה מצביע על כך מדגם RNA הכולל בשימוש הוא באיכות גבוהה (לא מושפל). שנית יש לבחון אות בהירה מאוד באזור 25 נוקליאוטידים של ג'ל, שהוא עודף, unligated מקשר 3 '. זה גם עשוי להיות מועיל לכולל שליטה אין RNA קלט בקשירה '3. זה יציין את הטוהר של מקשר '3, וגם יכול להתבצע דרך לשלב PCR לאינדיקציה למספר המחזור כאשר אות שאינה ספציפית הופכת להיות בעייתית. אין אבחון לקשירה של 5, אולם מוצג באיור 4 היא תגובה זהה לזו שתוארה בוצעה עם RNA שכותרתו רדיו שמצביעה על חשיבותו של הריכוז הגבוה של PEG8000 המועסק. לבסוף, לאחר שניתן להבחין PCR ועמוד ילידים, מוצר ה- DNA של זוגות 146 בסיס בקנה אחד עם הגודל של רצפי המתאם, להכניס מירנה, ורצף נוסף מפריימרים PCR המורחב. חשוב לציין כי אם המספר הנכון של מחזורי PCR (אשר נקבע באופן אמפירי) הוא חריגה, המוצר הכנס לא מירנה עלול לטשטש את גודל amplicon הרצוי. שמוצגת באיור 5 היא תוצאה של 5 pmoles של מירנה סינתטית, בדרך כלל עבור 2 מיקרוגרם של רנ"א הכל 13-18 מחזורים של PCR נחוצים.
איור 1. סכמטי של זרימת העבודה להכנת ספרייה הקטנה-RNA קשירת 2-צעד. Shown הם צעדים כלליים להכנת ספריית miR-Seq משוחד. מוצג בשחור 3 'מתאם קשירת ה- DNA, אשר מופעל באמצעות adenylation בשלב 1, מירנה מוצגת בירוק וגבעול ל3' מתאם בשלב 2, ו -5 מתאם קשירת RNA 'הוא בכחול אשר ligated ל מולקולת chimeric בשלב 3. צעדים ממוספרים מתוארות בפירוט בסעיף הפרוטוקול, נטויים מצביע על צעדים אנזימטית.
איור 2. Adenylation של 3 '. לינקר עם MTH RNA-אנזים 18% ג'ל עמוד-אוריאה מadenylation של oligonucleotide DNA להיות בשימוש במשך 3 הבאה' תגובת קשירה, (+) מצביע על מדגם שהודגרו עם האנזים MTH RNA, (- ) מצביע על מדגם מודגרות ללא אנזים, ו( מ ') מציין את הסטנדרטים הגודל (מספרים המוצגיםימין לא בזוגות בסיסים). בצד השמאל הוא סכמטי של מיני oligonucleotide הנוכחיים. כוכבית מציינת מוצרי DNA גדולים שנוצרו על ידי סינתזת oligonucleotide חריגה.
איור 3. 3 קשירת "של דוגמאות סינטטיים וסה"כ RNA. ) 15% ג'ל עמוד-אוריאה של 3 'תגובות קשירה, (מ') מצביע על סטנדרטים גודל (מספרים בצד שמאל מצביעים על זוגות בסיסים), (לא RNA) מציין תגובה ללא קלט RNA ו 3 'מקשר שלא היה מטוהר ג'ל , (+) מצביע על קשירה הופיעה עם 5 pmol של מירנה סינתטית ו3 'מקשר שהיה מטוהר ג'ל, (2 ו1 מיקרוגרם) מציין מהו הסכום של RNA הכולל עכבר נתון 3' קשירה עם אותו המקשר מטוהר ג'ל, , כוכבית מציינת עודף 3 'מקשר. B) Autoradiogram של 3 דומה "תגובת קשירה הופיעה עם P-32 5 'בסופו שכותרתו מירנה סינתטית. המספר בחלק העליון מציין זמן (שעה) התגובה הורשה להמשיך, ובחלק תחתון מציין את הכמות ligated כאחוז מהסכום של unligated וligated.
איור 4. 5 'הקשירה היברידית מירנה 3'Linker שכותרתו רדיו. Autoradiogram של 5' תגובת קשירה הופיעה עם P-32 5 'הסוף שכותרתו מירנה-3 סינתטית "היברידי מקשר. מספר בחלק העליון מציין סכום של PEG משמש בתגובה, ומספר בתחתית מציין את הכמות ligated כאחוז מהסכום של unligated וligated. קווים בצד השמאל הם סכמטי של מולקולות ligated בי מירנה היא בירוק, 5 'ו 3' מתאמים הם כחולים ושחורים, בהתאמה.
טען / 52,095 / 52095fig5highres.jpg "/>
איור 5. PCR-נגזר DNA הספרייה. 8% עמוד קטן-RNA ילידים של מוצרי ה- PCR שנוצרו מהליך קשירת miR-Seq. מספרים בראש מצביעים על מחזורים של PCR, מספרים בצד מצביעים על סטנדרטים גודל מולקולריים. כל מיני DNA מPCR מזוהה בצד ימין. דפוס רשת נובע אוטומטית הקרינה של צלחת דגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המתודולוגיה שתוארה במסמך זה עושה שימוש במספר משתנה מפתח למקסם את יעילות קשירה, כלומר ריכוז גבוה של PEG, השימוש בlinkers אקראי, וריכוז גבוה של linkers 2,6,9. גישה זו מאפשרת ספריות רצף אמין כמותי מדגימות RNA הכולל 2. ערכנו titrations מרובה של RNA הקלט והגעתי למסקנה כי המתודולוגיה הקודמת היא מתאימה ביותר עבור כמויות RNA הכוללת בטווח 1-8 מיקרוגרם (מידע לא מוצג). כאשר כמויות בטווח 10-500 ng משמשות, רוב שטח הקריאה הוא נצרך על ידי concatamers מתאם ורצפי חיידקים שממנו ligases RNA מטוהר. עם זאת, ראוי לציין בניסויי קלט הנמוכים אלה שמין miR הנוכחי, אם כי נמוך קורא מספר, עדיין משקף כמויות בפועל בהשוואה לדגימות קלט גבוהות יותר זהות. על מנת להבטיח כי פרופילי miR נצפו מסך דגימות RNA הם שיקוף של ממשיסכומים, ועל מנת לאפשר חקירה נגדית של מדגמים שונים, אנו כוללים באופן שגרתי דילולים של פי 10 של שלושה RNAs כיל הסינתטי 12. מצאנו כי ההכללה של 0.1: 0.01: 0.001 pmol של RNA כיל שונה יניב שימושי קוראת מספרים הלמאשר את טבע כמותי של assay.
כפי שצוין באיור 1 (ראה כוכבית) אוליגונוקלאוטידים סינטטיים לעתים קרובות מכילים מולקולות חריגות הנבדלות בגודל רצף הורה. אם מוצרים אלה יכולים לשתף לטהר עם מירנה-3 "היברידי מקשר, אז זה עשוי להיות נחוץ כדי לטהר עמוד 3 'מקשר הבא adenylation MTH. מצאנו את זה כדי להיות מועיל להפחתת הכמות של מוצר ה- PCR שאינו ספציפי נצפתה בדגימות בקרה שליליות.
למרות שהמתודולוגיה שתוארה לעיל השוותה להכנת כמותי של ספריות מירנה 2, אנו צופים באופן מלא שזה בקלות אפליקציהlicable לנהלים כלליים יותר, כמו גם; כלומר RNA-seq וCLIP-Seq (צלב קישור החיסוני-רטיבות) הכנת ספרייה. למעשה, יש לנו מועסקים חלק מאותם העקרונות של המתודולוגיה שקדמה לקליפ Seq-ניסויים וכתוצאה מספרייה חזקה PCR ביחס לדיווחים שפורסמו בעבר 13 (מידע לא מוצג). לבסוף, כmiRNAs סרום לצבור תאוצה ככלי אבחון רפואי, אנו צופים את המתודולוגיה הקודמת תסייע במידה רבה בזיהוי הסמנים הביולוגיים מירנה החזקה ואמינים ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10x Ligation buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10x Ligation buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina index primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2x Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low retention microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
