Abstract
Mirna kloning og high-throughput sekventering, kaldet miR-Seq, står alene som en transkriptom tilgang at kvantificere miRNA med enkelt nukleotid opløsning. Denne teknik indfanger miRNA ved at fastgøre 3 'og 5' oligonukleotidadaptorer til miRNA-molekyler og tillader de novo miRNA opdagelse. Kobling med kraftige næste generation sekventering platforme har MIR-Seq været medvirkende i studiet af miRNA biologi. Imidlertid har betydelige bias indført ved oligonukleotid ligeringstrin forhindret MIR-Seq fra at blive ansat som en nøjagtig kvantificering værktøj. Tidligere undersøgelser viser, at skævheder i de nuværende MIR-Seq metoder ofte føre til unøjagtige miRNA kvantificering med fejl op til 1.000 gange for nogle miRNA 1,2. At løse disse afvigelser bibragt af RNA-ligering, har vi udviklet en lille RNA ligation metode, der resulterer i ligerings- effektivitet på over 95% for både 3 'og 5' ligeringstrin. Benchmarking denne imviste sig at være bibliotek konstruktion metode anvendelse af ækvimolære eller differentielt blandede syntetiske miRNA, konsekvent giver læser tal med mindre end to gange afvigelse fra den forventede værdi. Desuden er denne højeffektiv MIR-Seq Metoden tillader nøjagtig genom-dækkende miRNA profilering fra in vivo total RNA-prøver 2.
Introduction
High-throughput sekventering baseret metoder er blevet almindeligt anvendt til mange biologiske prøver i de senere år i høj grad udvide vores forståelse af den molekylære komplekse biologiske systemer 3,4. Men forberedelsen af RNA-prøver til high-throughput sekventering ofte bibringer særlige bias forbundet til den anvendte metodologi, der begrænser den potentielle nytte af disse kraftfulde teknikker. Disse metode specifik bias er veldokumenteret til ligering-baseret, små RNA-bibliotek præparater 1,2,5,6. Disse skævheder resulterer i 1000-fold variation i læser numre til ækvimolære syntetiske miRNA, hvilket gør følgeslutning af miRNA overflod fra sekventeringsdata vildt variabel og risiko for fejl.
Undersøgelser, der fokuserer på egenskaberne af fag-afledt T4-RNA-ligaser har dokumenteret, at enzymerne udviser nukleotid-baserede præferencer 7, som manifesterer som tendentiøse biblioteker i high-throughput sekventering eksperimenter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Det er vigtigt at opretholde RNase-fri betingelser under hele proceduren.
1. adenylering af 3 'Linker
- Fortynd DNA-oligonukleotid designet til 3'ligeringsreaktioner til 100 uM i nuclease-free H 2 O.
BEMÆRK: oligonukleotid bør have en 5'-phosphatgruppe, et randomiseret dinukleotid i 5'-enden og en 3'-dideoxycytosin. 5'-phosphatgruppe er et krav i Mth enzym til effektiv 5'adenylering 10. Phosphatet kan tilføjes ved forbehandling af oligonukleotidet med en polynukleotidkinase, eller bestilles med den modifikation direkte. Det randomiserede dinukleotid i 5'-enden er vigtig for at minimere præference sekvensen som RNA-ligaser udviser for visse endelige ende sammenføjning reaktioner over andre 6. 3'-dideoxycytosin placerer en blokerende element i 3'-enden af oligonukleotidet to hæmme dannelsen af linker-linker-concatamerer under efterfølgende ligeringstrin og også tjener til at blokere 3'-enden af miRNA-linker-molekyle dannet ved enden af 3'-ligeringsreaktionen 11. Oligonukleotidet linkersekvens valgt til unbiased MIR-Seq metode er som følger: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3. - Samle følgende adenylering reaktion: 200 pmol 3 'linker oligonukleotid, 4 pi 10x 5' DNA adenylering buffer, 4 pi 1 mM ATP, 4 pi Mth RNA ligase, nuclease-free H2O til et slutvolumen på 40 pi.
- Inkubere reaktionen ved 65 ° C i 1 time. Afslut reaktionen ved opvarmning til 85 ° C i 5 minutter.
- Udfælde adenylerede linker ved tilsætning af 2,5 volumener 100% ethanol og 1/3 volumen 10 M ammoniumacetat for at fjerne tilbageværende ATP og forhindre uventede ligeringer i fremtidige reaktioner.
- Kort fortalt, blandes alsprit, salt og oligo opløsning til homogenitet, centrifugering ved fuld hastighed i en mikrocentrifuge (~ 15.000 xg) ved 4 ° C i 20 minutter. Vask pelleten i 70% ethanol, lufttørret og resuspender i det passende volumen af nuclease-free H2O til opnåelse af 50-100 uM adenylerede oligo.
- Bekræft adenylering ved at køre en 18% polyacrylamidgel.
- Gelopløsningen ved at blande følgende sammen: 6,3 g urinstof, 6,75 ml 40% acrylamid, og 1,5 ml 10x TBE. Tilføj H 2 O til 15 ml.
- Bland indtil urinstof er fuldstændigt opløst, og der tilsættes 150 pi 10% (w / v) ammoniumpersulfat (APS) og 15 pi tetramethlyethylenediamine (TEMED).
- Når gelen er størknet, pre-run for 30 min ved 24 V / cm af gelen bredde med 1x TBE løbende buffer ved stuetemperatur. Når 30 minutter er op flush brønde med løbebuffer.
- Bland 5 pmol adenylerede oligonukleotider med og samme volumen 2x denaturering RNA loading buffer (95% (v / v) formamid,0,02% (w / v) SDS, 0,02% bromphenolblåt (w / v), 0,01% (w / v) XylenCyanol, 1,0 mM EDTA), varme kortvarigt til 75 ° C, og snap afkølet på is. Dispensere hele prøven i brønden af gelen. Også omfatte en identisk mængde ikke-adenylerede kontrol, og molekylære vægt størrelsesstandarder lave.
- Køre gelen ved 24 V / cm, indtil bromphenolblåt er ¾ af vejen til bunden af gelen. Demontere apparatet, post-plet gel med 1x SYBR-guld opløsning i 1 x TBE og visualisere UV-transilluminator boks (figur 2).
BEMÆRK: Gel rense adenylerede oligo på en måde svarende til den beskrevet ovenfor, hvis "ingen input RNA" kontrol resulterer i en stor mængde af PCR-produkt i forhold til prøver med input RNA.
2. linkerligering til 3 'enden af miRNA
- 3'Ligering
- Saml følgende komponenter på is i rækkefølge: 1,0 pi 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 &# 956; l 10x-RNA-ligase buffer (500 mM Tris-HCI, pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 pi adenylerede 3 'Linker (100 uM), 0,5 pi RNase-inhibitor, 0,5 til 8,0 ug total RNA, 0,5 pi T4 RNA ligase 2, nuclease-free H2O til et slutvolumen på 5 pi.
- Bland reaktionen ved pipettering som opløsningen er for viskos til vortex grund af den høje koncentration af PEG 8000. Når blandes grundigt reaktionen i en termisk cycler med et opvarmet låg sted. Indstil blok til 16 ° C, og der inkuberes i 4 timer.
BEMÆRK: Reaktionen kan skaleres op til et endeligt volumen på 20 pi uden tab ligeringseffektivitet. Reagere i 4 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C til opnåelse af i det væsentlige identiske ligeringsfremgangsmåder effektivitet.
- Gel Oprensning
- Efter 3 'ligering, blandes reaktionsblandingen med et tilsvarende volumen 2x RNA loading buffer. Opvarm til 70 ° C i 5 minutter, og snap køligt på is. Kør prøven på en 15% polyacrylamidgel for side oprensning.
- Fremstille en 15% polyacrylamidgel indeholdende 7 M urinstof, på en måde svarende til den, der tidligere er beskrevet i trin 1.5.
- Pre-køre gelen ved 24 V / cm af gelen bredde i mindst 30 min. Sluk strømforsyningen, skylles brønde, load prøve og køre gel på samme spænding som pre-run.
- Indlæse prøven og køre PAGE indtil bromphenolblåt har netop forladt gel. Det ønskede produkt vil vandre tæt på xylencyanol.
- Efter 3 'ligering, blandes reaktionsblandingen med et tilsvarende volumen 2x RNA loading buffer. Opvarm til 70 ° C i 5 minutter, og snap køligt på is. Kør prøven på en 15% polyacrylamidgel for side oprensning.
- Farvning, visualisering og Excision
- Adskil apparat gel og sted gel i ren bakke med 1x løbebuffer (TBE), 1x SYBR-guld, og rock i 15 min.
- Fjern gel fra farvning fad og visualisere på UV-transilluminator kasse dækket med ren plastic wrap. Ligeringsproduktet bør være omkring 45 nukleotider i længde.
- Udskære region indeholdende ligeringsproduktet med en ren Razor klinge og sted i 0,5 ml mikro-centrifugerør.
- Produkt Isolering og nedbør
- Pierce bunden af 0,5 ml mikrocentrifugerør med en 30 G kanyle og sæt den hullede rør i en anden ren, lav fastholdelse, 1,5 ml mikrocentrifugerør. Centrifugeres i 5 min ved ca. 15.000 x g.
- Visuelt bekræfte, at hele gelskive har bevæget sig gennem hullet i det indre rør. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en ren pipettespids til at skubbe nogle gelfragmenter tættere på hullet.
- Kassér det tomme 0,5 ml rør og tilsættes 400 pi af høj salt søjle buffer (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,1% SDS) til acrylamid opslæmning. Rock rør (s) ved 4 ° C natten over.
- Overføre opslæmning til et 0,22 mikrometer celluloseacetat spin-søjle under anvendelse af en bred boring pipettespids. Centrifuge i 3 minutter ved stuetemperatur ved ~ 15.000 xg at indsamle al væske væk fra acrylamid gel matrix.
- Væsken overføres til en ren, lav tilbageholdelse, 1,5 ml rør indeholdering 1 pi 20 mg / ml glycogen. Tilsættes et lige volumen af isopropanol og 1/10 volumen natriumacetat. Bland opløsningen ved at vende røret flere gange og udfældes i -80 ° C fryseren i 20 minutter.
- Centrifuge ved fuld hastighed ved 4 ° C i 20 min for at pelletere nukleinsyren. Fjern supernatanten og vask i 70% ethanol. Luft tør pellet i 10 minutter ved stuetemperatur og fortsætte direkte til 5'ligeringstrin.
3. linkerligering til 5 'enden af miRNA-3' Linker Hybrid
- Til pelleteret nukleinsyre, tilsæt de følgende bestanddele: 2 pi PEG 8000 (50% w / v), 0,5 pi 10x RNA Ligase Buffer, 0,5 ul ATP (10 mM), 0,5 pi NN-RNA oligo (100 uM), og H 2 O til et endeligt volumen på 4 pi.
BEMÆRK: Sammensætningen af "NN-RNA oligo 'er som følger 5'-inverteret dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3" og blev oprenset ved HPLC af fabrikanten. - Blanddenne prøve ved pipettering op og ned flere gange. Gør dette i et stykke tid (op til 5 min) for at sikre, at pillen er blevet fuldstændig re-opløst. Hvis re-solubilisering er problematisk, opvarmes prøven kort (3-5 minutter) til 37 ° C og genoptage pipettering at blande.
- Når pelleten er tilbage i opløsning, overføre indholdet til en ren PCR-rør indeholdende 1 pi af en 1: 1 blanding af RNase inhibitor og T4 RNA Ligase 1 (5 enheder). Igen blandes ved pipettering op og ned.
- Inkuber reaktion i en termisk cycler ved 37 ° C i 4 timer. Fortsæt straks til cDNA syntese.
4. Reverse Transcription / cDNA-syntese
- Tilføj følgende komponenter til 5'ligeringsreaktionen: 2 pi 5x RT-buffer, 0,75 pi 100 mM DTT, 1 pi Illumina RT Primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 '(1 uM), og 0,5 pi dNTPs (10 mM).
- Blandes ved pipettering og opvarm til 65 ° C i 5 minutter. Derefter langsomt afkøle på bænken top.
- Når reaktion er afkølet til stuetemperatur, sted rør på is, og der tilsættes 0,5 pi hver af revers transkriptase-enzym og RNase inhibitor. Blandes ved pipettering og sted i thermocycler for udvidelse trin anført i fabrikantens anvisninger.
- Når fuldstændig add 5 pi nuclease-free H 2 O for at bringe det endelige volumen af cDNA-biblioteket op til 15 pi.
5. Library Preparation
- For indeksering PCR, samle den følgende reaktion på is: 6 pi 5x Phusion buffer, 1 pi dNTPs (10 mM), 0.9 pi DMSO, 0,75 pi 5 'Primer (25 uM), 0,75 pi 3' Primer (25 uM), 3 pi cDNA-bibliotek (variabel koncentration afhængigt af mængden af input), 0,5 pi Phusion polymerase (1 enhed), nuclease-free H2O til et slutvolumen på 30 pi. Vælg primersekvenserne at sikre kompatibilitet med skabelonen og sekventering platformvalg.
- Køre PCR-reaktion med følgende indstillinger: indledende denaturering ved 98 ° C i 3 min i de første 4 cyklusser, denaturering 98 ° C i 15 sekunder, anneal ved 50 ° C i 15 sekunder, strækker sig 72 ° C i 15 sekunder .
BEMÆRK: Afhængigt af mængden af input-materiale, varierer det samlede PCR-cyklus numre. Typisk for en indgang på 1-2 ug af total RNA, 13 samlede PCR-cykler er tilstrækkelige til at generere MIR-Seq bibliotek. - Udføre efterfølgende cyklusser, fx cykler 5-12, i en to-trins måde hvor annealing og forlængelse cyklusser kombineres og udføres ved 70 ° C i 30 sekunder og denaturering er igen 98 ° C i 15 sek.
BEMÆRK: Reaktionsvolumenet er 30 pi at tillade en pause i PCR, og fjerne en 10 pi alikvot på forudbestemte cyklus numre for at monitorere forekomsten af det ønskede produkt. Typisk blok 10, 13 og 16 er valgt til afprøvning af en total RNA-prøve.
- Køre PCR-reaktion med følgende indstillinger: indledende denaturering ved 98 ° C i 3 min i de første 4 cyklusser, denaturering 98 ° C i 15 sekunder, anneal ved 50 ° C i 15 sekunder, strækker sig 72 ° C i 15 sekunder .
- Forbered8% ikke-denaturerende acrylamidgel ved at blande 2 ml 40% acrylamid, 1 ml 10x TBE og H 2 O til 10 ml. Derefter tilsættes 100 pi 10% APS og 10 pi TEMED. Hæld gelen og lad sæt.
- Pre-køre gelen ved 12 V / cm gel bredde for 30 min. Flush brønde. Tilsæt 1 pi 10x loading buffer (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (vægt / volumen) bromphenolblåt) tilsættes 10 pi prøve i hver brønd med dimensionerne 5 mm x 1 mm x 15 mm. Typisk kan hver brønd lægge op til 30 pi prøver. Kør prøven gel ved 10 V / cm af gelen bredde i 1 x TBE-buffer, indtil bromphenolblåt-farvestof blot løber ud af bunden af gelen.
- Farv og visualisere gel som beskrevet i trin 2.3.
- Udskære par bånd 146 base og elueres natten over i 0,25 ml HSCB på en måde svarende til, hvad der er beskrevet i afsnit 2.4. Udfældes DNA i et lige volumen af isopropanol og 1/10 volumen natriumacetat. Vask pellet i 70% ethanol og resuspender i TE buffer.
- Kvantificere biblioteket ved hjælp PicoGreen henhold til producentens anbefalinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forventede resultater for det foregående metode bør initialt være observation af et enkelt nukleotid skift (stigning) i størrelsen af det DNA-oligonukleotid, der var genstand for adenylering af Mth RNA ligase (figur 2). Efter 3 'ligering visualisering af acrylamid gel viser (se figur 3) skarpe højmolekylære bånd tydeligt i 100-300 nukleotid region af gelen. Dette indikerer, at den samlede RNA-prøve, der anvendes, er af høj kvalitet (ikke nedbrudt). For det andet bør man iagttage en meget lys signal på 25 nukleotid-regionen af gelen, som er overskydende, ikke-ligeret 3 'linker. Det kan også være nyttigt at medtage en ingen input RNA kontrol i 3'ligering. Dette vil indikere renheden af 3'-linker, og også kan gennemføres til PCR-trin til angivelse af antallet af cykler, når ikke-specifikt signal bliver problematisk. Der er ingen diagnostisk for 5'ligeringDog vist i figur 4 er en reaktion identisk med den beskrevne udført med radioaktivt mærket RNA, der viser vigtigheden af den høje koncentration af PEG8000 anvendes. Endelig, efter PCR og nativ PAGE, et DNA-produkt på 146 basepar i overensstemmelse med størrelsen af adaptorsekvenser en miRNA insert, og yderligere sekvens fra de udvidede PCR-primere kan iagttages. Det er vigtigt at bemærke, at hvis det korrekte antal af PCR-cykler (som bestemmes empirisk) overskrides, kan det ikke miRNA insert produkt tilsløre den ønskede amplikonstørrelse. Vist i figur 5 er et resultat fra 5 pmol syntetiske miRNA, typisk 2 ug af total RNA er nødvendige 13-18 cyklusser af PCR.
Figur 1. Skematisk af arbejdsgangen for 2-trins ligering små RNA-bibliotek forberedelse. Shown er generelle trin til forberedelse af en fordomsfri MIR-Seq bibliotek. Vist i sort er 3'-DNA-ligering adapter, som aktiveres via adenylering i trin 1, er miRNA vist i grønt og ligeret til 3'-adapter i trin 2, og 5-RNA-ligering adapteren er i blå, der er ligeret til kimære molekyle i trin 3. Nummererede trin er beskrevet detaljeret i protokol afsnittet kursiv angiver enzymatiske trin.
Figur 2. adenylering af 3 '. Linker med Mth RNA-ligase 18% PAGE-Urea gel fra adenylering af DNA-oligonukleotid, der skal anvendes til efterfølgende 3'ligeringsreaktionen (+) indikerer, at prøven blev inkuberet med Mth RNA ligase (- ) angiver inkuberes prøven uden enzym, og (m) angiver standarderne størrelse (tal vist ent ret i basepar). Til venstre er en skematisk afbildning af oligonucleotid arter. Asterisk angiver større DNA-produkter genereres af afvigende oligonukleotidsyntese.
Figur 3. 3 'Ligering af syntetisk og Total RNA prøver. A) 15% PAGE-urea-gel af 3 'ligeringsreaktioner (m) angiver størrelsesstandarder (tal på venstre angiver basepar) (nr RNA) viser en reaktion med noget input RNA og 3'-linker, der ikke var geloprenset (+) angiver ligering udføres med 5 pmol syntetiske miRNA og en 3'-linker, som blev gel-oprenset, (2 og 1 ug) angiver mængden af mus totalt RNA underkastet 3'ligering med det samme, geloprenset linker , asterisk angiver overskydende 3'linker B). Autoradiogram af tilsvarende 3'ligeringsreaktionen udføres med P 32 5'-enden mærket syntetisk miRNA. Antal øverst angiver tiden (timer) reaktionen fik lov at fortsætte, og i bunden indikerer mængden ligeret som en procentdel af summen af ikke-ligeret og ligeret.
Figur 4. 5 'Ligation af Radio-mærket miRNA-3'Linker Hybrid. Autoradiogram af 5'ligeringsreaktion udført med P 32 5' enden mærket syntetisk miRNA-3 'linker hybrid. Antal øverst angiver mængden af PEG anvendes i reaktionen, og antallet nederst angiver mængden ligeret som en procentdel af summen af ikke-ligeret og ligeret. Linjer på venstre er en skematisk afbildning af de ligerede molekyler hvor miRNA er i grønt, 5 'og 3' adaptere blå og sort hhv.
pload / 52.095 / 52095fig5highres.jpg "/>
Figur 5. PCR-afledte små RNA-DNA-bibliotek. 8% Native PAGE af PCR-produkter der genereres fra MIR-Seq ligation procedure. Numbers foroven angiver cyklusser af PCR, tal på side indikerer molekylære størrelse standarder. Hver DNA-arter fra PCR er identificeret til højre. Gittermønster skyldes autofluorescens prøve skålen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den heri beskrevne metode gør brug af flere vigtige variabler for at maksimere effektiviteten ligeringsprodukter, nemlig høje koncentrationer af PEG, anvendelse af randomiserede linkere og høj koncentration af linkere 2,6,9. Denne fremgangsmåde tillader pålideligt kvantitative sekventering biblioteker fra total RNA-prøver 2. Vi har udført flere titreringer af input-RNA og har konkluderet, at den foregående metode er bedst egnet for den samlede RNA-mængder i 1-8 ug område (data ikke vist). Når der anvendes beløb i 10-500 ng rækkevidde, et flertal af den læste plads forbruges af adapter konkatamerer og bakterielle sekvenser, hvorfra RNA-ligaser renses. Men det er værd at bemærke i disse lave input eksperimenter, MIR arter, selv om lav i læser nummer, stadig er reflekterende af de faktiske beløb, når der sammenlignes med identiske højere input prøver. For at sikre, at MIR profiler observeret fra de samlede RNA-prøver er reflekterende faktiskebeløb, og for at give krydsforhør af forskellige prøver, vi rutinemæssigt omfatte 10-folds fortyndinger af tre syntetiske kalibratorzoner RNA'er 12. Vi har fundet, at optagelse af 0,1: 0,01: 0,001 pmol særskilte kalibratorværdier RNA'er give nyttige læser numre til at bekræfte den kvantitative natur af assayet.
Som bemærket i figur 1 (se asterisk) syntetiske oligonukleotider indeholder ofte afvigende molekyler, som adskiller sig i størrelse fra sekvensen bestilt. Hvis disse produkter er i stand til at co-rense med miRNA-3 'linker hybrid, så kan det være nødvendigt at SIDE rense 3'linker efter Mth adenylering. Vi har fundet dette at være nyttigt for at reducere mængden af ikke-specifikke PCR-produkt observeret i negative kontrolprøver.
Selvom metoden beskrevet ovenfor, blev benchmarkes for kvantitativ fremstilling af miRNA biblioteker 2, fuldt forventer vi, at det er let applicable til mere generelle procedurer samt; nemlig RNA-seq og CLIP-Seq (Cross Link Immuno-Nedbør) bibliotek forberedelse. Faktisk har vi ansat nogle af de samme principper i den foregående metode til clip-Seq eksperimenter resulterer i robust bibliotek PCR i forhold til tidligere offentliggjorte rapporter 13 (data ikke vist). Endelig da serum miRNA vinde trækkraft som et medicinsk diagnostisk værktøj, forventer vi den foregående metode vil hjælpe meget i identifikation af de mest robuste og pålidelige miRNA-biomarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10x Ligation buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10x Ligation buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina index primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2x Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low retention microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
