Abstract
Mirna kloning og high-throughput sekvensering, kalt Mir-Seq, står alene som en transkriptomet omfattende tilnærming til å kvantifisere mirnas med singel nukleotid oppløsning. Denne teknikken fanger mirnas ved å feste 3 'og 5' oligonukleotidadaptorene til miRNA molekyler og lar de novo miRNA oppdagelse. Kobling med kraftige nestegenerasjonssekvense plattformer, har Mir-Seq vært medvirkende i studiet av miRNA biologi. Imidlertid har betydelige fordommer innført ved oligonukleotid-ligeringstrinn forhindres Mir-Seq fra å bli anvendt som en nøyaktig kvantifisering verktøyet. Tidligere studier viser at skjevheter i dagens Mir-Seq metoder ofte føre til unøyaktig miRNA kvantifisering med feil opptil 1000 ganger for noen miRNAs 1,2. For å løse disse skjevheter formidles av RNA ligation, har vi utviklet et lite RNA ligation metode som resulterer i ligation effektivitet på over 95% for både 3 'og 5' ligation trinn. Benchmarking dette imviste bibliotek byggemåten ved hjelp ekvimolære eller forskjellig blandede syntetiske mirnas, konsekvent gir leser tallene med mindre enn to ganger avvik fra forventet verdi. Videre tillater denne høyeffektive Mir-Seq metoden nøyaktig genome-wide miRNA profilering fra in vivo total RNA prøver to.
Introduction
Høy throughput sekvense baserte metoder har blitt mye brukt til mange biologiske prøver i de senere år i stor grad utvide vår forståelse av den molekylære kompleksiteten i biologiske systemer 3,4. Men utarbeidelse av RNA prøver for høy gjennomstrømming sekvense formidler ofte spesifikke skjevheter iboende til arbeidstakeren metodikk, noe som begrenser den potensielle nytten av disse kraftige teknikker. Disse fremgangsmåte spesifikk skjevheter har blitt godt dokumentert for ligering-baserte, små-RNA-bibliotek 1,2,5,6 preparater. Disse skjevheter resultere i 1000-fold variasjon i leser tallene for ekvimolære syntetiske mirnas, slik slutning av miRNA overflod fra sekvense data vilt variabel og feiling utsatt.
Studier som fokuserer på egenskapene til fag-avledet T4 RNA ligaser har dokumentert at enzymene utviser nukleotid-baserte preferanser 7, som manifesterer som partisk bibliotek i high-throughput sekvense eksperimenter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Det er viktig å opprettholde RNase-frie forhold under hele prosedyren.
1. adenylation av 3 'Linker
- Fortynne DNA oligonukleotid designet for 3 'ligation reaksjoner på 100 mikrometer i nukleasefritt H 2 O.
MERK: Oligonukleotidet bør ha en 5'-fosfatgruppe, et randomisert dinukleotid ved 5 'ende og en 3' dideoxycytosine. 5'-fosfatgruppe er et krav for den m-te enzym for effektiv 5 'adenylation 10. Fosfatet kan tilsettes ved forbehandlingen av oligonukleotidet med en polynukleotid-kinase, eller bestilt med den modifikasjon direkte. Den randomiserte dinukleotid i 5'-enden er viktig for minimalisering av sekvensen, som RNA-ligaser preferanse for visse utstillings ende-ende-sammenføyning reaksjoner fremfor andre seks. Den 3 'dideoxycytosine plasserer et blokkeringselement ved 3'-enden av oligonukleotid to hemme dannelsen av linker-linker concatamers under påfølgende ligeringstrinn og tjener også til å blokkere 3'-enden av det miRNA-Linker-molekyl dannet ved enden av den 3'-ligeringsreaksjon 11. Den oligonukleotid-linkersekvens som er valgt for objektiv Mir-Seq metode er som følger: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 '. - Monter følgende adenylation reaksjon: 200 pmol 3 'linker-oligonukleotid, 4 pl 10x 5' DNA adenylation buffer, 4 ul 1 mM ATP, 4 pl ligase Mnd RNA, nuklease-fri O H 2 til et sluttvolum på 40 ul.
- Inkuber reaksjon ved 65 ° C i 1 time. Terminere reaksjonen ved oppvarming til 85 ° C i 5 min.
- Utfelle adenylated linkeren ved tilsetning av 2,5 volumer 100% etanol og 1/3 volum av 10 M ammoniumacetat for å fjerne gjenværende ATP og for å hindre uventede ligeringer i fremtidige reaksjoner.
- Kort, bland alalkoholdispergeringsmiddel, salt, og oligo-løsning til homogenitet, spinning ved full hastighet i en mikrosentrifuge (~ 15 000 xg) ved 4 ° C i 20 min. Vask pelleten i 70% etanol, lufttørkes, og resuspender i det passende volum av nuklease-fri H 2 O for å gi 50 til 100 uM av adenylated oligo.
- Bekreft adenylation ved å kjøre en 18% polyakrylamid gel.
- Klargjør gel ved å blande sammen følgende: 6,3 g urea, 6,75 ml av 40% akrylamid, og 1,5 ml 10 x TBE. Legg H 2 O til 15 ml.
- Bland til urea er fullstendig oppløst og tilsett 150 ul 10% (vekt / volum) ammonium-persulfat (APS) og 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED).
- Når gelen har satt seg, pre-løp i 30 minutter ved 24 V / cm bredde av gel med 1 x TBE-buffer ved romtemperatur. Når 30 min er opp flush brønner med rennende buffer.
- Bland 5 pmol av oligonukleotider med adenylated og likt volum av 2x ladningsbuffer denaturere RNA (95% (v / v) formamid,0,02% (w / v) SDS, 0,02% bromfenolblått (w / v), 0,01% (w / v) xylencyanol, 1,0 mM EDTA), varme en kort stund til 75 ° C, og smekk avkjølt på is. Dispensere hele prøven inn i brønnen av gelen. Inkluderer også en identisk mengde ikke-adenylated kontroll, og lavmolekylære størrelse standarder.
- Kjør gelen ved 24 V / cm inntil bromfenolblått er ¾ av veien til bunnen av gelen. Demontere apparatet, post-flekken gel med 1x SYBR-gull løsning i 1x TBE og visualisere på UV-transilluminator boksen (figur 2).
MERK: Gel rense adenylated oligo på en måte lik den som er beskrevet ovenfor dersom "noe inngangs RNA" kontroller som resulterer i en høy mengde av PCR-produkt sammenlignet med prøver med inngangs RNA.
2. Linker Ligation til 3 'End of miRNA
- 3 'hemorroider
- Monter følgende komponenter på isen i den rekkefølgen de står: 1,0 mL 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 &# 956; l 10x RNA-ligase-buffer (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 ul adenylated 3 'linker (100 uM), 0,5 ul RNase-inhibitor, 0,5 til 8,0 mikrogram total RNA, 0,5 ul T4-RNA-ligase 2, nuklease-fri O H 2 til et endelig volum på 5 ul.
- Bland reaksjonen ved å pipettere løsningen som er for viskøs til å virvle på grunn av den høye konsentrasjonen av PEG 8000. Etter grundig blandet, plasserer reaksjonen i en termosykler med et oppvarmet lokk. Sett blokken til 16 ° C, og inkuberes i 4 timer.
MERK: Reaksjonen kan bli skalert opp til et endelig volum på 20 ul uten tap i ligeringseffektivitet. Reagere i 4 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C for å gi i det vesentlige identiske ligeringseffektivitet.
- Gel Rensing
- Etter 3 'ligering, blandes reaksjonsblandingen med et likt volum av 2x ladningsbuffer RNA. Oppvarm til 70 ° C i 5 minutter, og snap kule på is. Kjør prøven på en 15% polyakrylamidgel for PAGE rensing.
- Tilbered en 15% polyakrylamidgel inneholdende 7 M urea, på en måte analogt det som er beskrevet tidligere i trinn 1.5.
- Pre-gel kjørt ved 24 V / cm bredde av gel i minst 30 min. Slå av strømforsyningen, flush brønner, lastprøve og kjøre gel på samme spenning som pre-løp.
- Laste prøven og kjøre SIDE til bromfenolblått har nettopp kommet ut av gel. Det ønskede produkt vil migrere nær xylen cyanol.
- Etter 3 'ligering, blandes reaksjonsblandingen med et likt volum av 2x ladningsbuffer RNA. Oppvarm til 70 ° C i 5 minutter, og snap kule på is. Kjør prøven på en 15% polyakrylamidgel for PAGE rensing.
- Flekker, visualisering, og Eksisjon
- Demontere gelapparatur og sted gel i rene brett med 1x buffer (TBE), 1x SYBR-gull, og rock i 15 min.
- Fjern gel fra flekker fatet og visualisere på UV transilluminator boks dekket med ren plastfolie. Ligerings produktet bør være rundt 45 nukleotider i lengde.
- Eksisere regionen inneholder ligation produkt med en ren Razor blad og plasser i 0,5 ml mikrosentrifuge-rør.
- Produkt Isolasjon og nedbør
- Pierce bunnen på 0,5 ml mikro rør med en 30 G nål og plasser boret rør i en annen ren, lav-oppbevaring, 1,5 ml mikro tube. Sentrifuger i 5 min ved 15000 x g ~.
- Visuelt bekrefte at hele gelskive har beveget seg gjennom hullet i det indre røret. Om nødvendig, bruk en ren pipette tips å presse noen gel fragmenter nærmere hullet.
- Kast den tomme 0,5 ml rør og tilsett 400 pl høy-saltbuffer kolonne av HSCB (400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) til akrylamid oppslemmingen. Rock rør (r) ved 4 ° C over natten.
- Overfør til en oppslemming 0,22 mikron celluloseacetat spinnkolonne ved anvendelse av en vid boring pipettespissen. Sentrifuger i 3 minutter ved romtemperatur på ~ 15.000 xg for å samle all væske bort fra akrylamid gel-matrise.
- Overføre væsken til en ren, lav-retensjon, 1,5 ml rør inneholdeing ul av en 20 mg / ml glykogen. Legg et like stort volum av isopropanol og 1/10 volum natriumacetat. Bland oppløsning ved å vende røret flere ganger og utfelles i -80 ° C fryser i 20 min.
- Sentrifuger ved full hastighet ved 4 ° C i 20 minutter for å pelletere nukleinsyren. Fjern supernatanten og vask i 70% etanol. Pelleten lufttørkes i 10 minutter ved romtemperatur og gå direkte til 5'-ligeringstrinnet.
3. Linker Ligation til 5 'End of miRNA-3' Linker Hybrid
- Til pelletisert nukleinsyre, tilsett de følgende komponenter: 2 pl PEG 8000 (50% w / v), 0,5 pl 10x RNA ligasebuffer, 0,5 ul ATP (10 mM), 0,5 ul NN-RNA oligo (100 uM), og H- 2 O til et sluttvolum på 4 ul.
MERK: Sammensetningen av den 'NN-RNA oligo' er som følger 5'-dideoksy-invertert TCUACAGUCCGACGAUCNN3 'og ble renset via HPLC av produsenten. - Blanddenne prøven ved å pipettere opp og ned gjentatte ganger. Gjør dette i noen tid (inntil 5 min) for å sikre at pelleten har blitt fullstendig re-oppløst. Ved re-oppløseliggjøring er problematisk, oppvarme prøven kort (3-5 min) til 37 ° C og gjenoppta pipettering for å blande.
- Når pelleten er tilbake i oppløsning, overfører innholdet til en ren PCR-rør inneholdende 1 pl av en 1: 1 blanding av RNase inhibitor og T4-RNA-ligase 1 (5 enheter). Igjen bland ved å pipettere opp og ned.
- Inkuber reaksjonen i en termosykler ved 37 ° C i 4 timer. Man går umiddelbart videre til cDNA-syntese.
4. Reverse Transcription / cDNA Synthesis
- Legg følgende komponenter til 5 'Ligeringsreaksjon: 2 ul 5x RT-buffer, 0,75 pl 100 mM DTT, 1 pl Illumina RT primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 uM), og 0,5 ul dNTP (10 mM).
- Bland ved pipettering og oppvarm til 65 ° C i 5 min. Så sakte avkjøles på benken top.
- Når reaksjonen er avkjølt til romtemperatur, plasser røret på is og tilsett 0,5 ul av hver av revers transkriptase-enzym og RNase-inhibitor. Bland ved pipettering og plasser i termosykler for forlengelsen trinnet angitt i produsentens instruksjoner.
- Når prosessen er ferdig Tilsett 5 ul av nuklease-fri H 2 O for å bringe det endelige volum av cDNA-bibliotek opp til 15 ul.
5. Bibliotek Forberedelse
- For indeksering PCR, montere den etterfølgende reaksjon på is: 6 ul 5x Phusion buffer, 1 ul dNTP (10 mM), 0,9 ul DMSO, 0,75 ul 5 'primer (25 uM), 0,75 ul 3' primer (25 uM), 3 ul cDNA-bibliotek (variabel konsentrasjon, avhengig av mengden av inngangs), 0,5 ul Phusion-polymerase (1 enhet), nuklease-fri O H 2 til et sluttvolum på 30 pl. Velg primersekvensene å sikre kompatibilitet med malen og sekvense plattformvalg.
- Kjør PCR-reaksjon med de følgende innstillinger: innledende denaturering ved 98 ° C i 3 minutter, for de første fire sykluser, denaturering 98 ° C i 15 sekunder, annealing ved 50 ° C i 15 sek, strekker seg ved 72 ° C i 15 sek .
MERK: Avhengig av hvor mye av inngangsmaterialet, varierer den totale PCR syklus tall. Typisk, for en inngang på 1-2 ug av total-RNA, 13 totalt PCR-sykluser er tilstrekkelig til å generere den Mir-bibliotek Seq. - Utføre etterfølgende sykluser, f.eks sykluser 5-12, i en to-trinns måte hvor forlengelses sykluser annealing og kombineres og gjennomføres ved 70 ° C i 30 sek, og den er igjen denaturering 98 ° C i 15 sek.
MERK: reaksjonsvolum er 30 pl pause for å tillate PCR-programmet og fjerne en 10 ul alikvot ved forutbestemte syklusnummer for å overvåke opptreden av det ønskede produkt. Vanligvis sykluser 10, 13, og 16 er valgt for testing fra totalt RNA-prøven.
- Kjør PCR-reaksjon med de følgende innstillinger: innledende denaturering ved 98 ° C i 3 minutter, for de første fire sykluser, denaturering 98 ° C i 15 sekunder, annealing ved 50 ° C i 15 sek, strekker seg ved 72 ° C i 15 sek .
- Forbereden 8% ikke-denaturerende akrylamidgel ved å blande 2 ml av 40% akrylamid, 1 ml 10 x TBE og H2O til 10 ml. Deretter legger 100 pl 10% APS og 10 mL av TEMED. Hell gel og la sett.
- Pre-gel kjørt ved 12 V / cm bredde av gelen i 30 minutter. Skyll brønner. Tilsett 1 pl av 10 x ladningsbuffer (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) bromfenol blå), tilsett 10 ul prøve til hver brønn av dimensjoner 5 mm x 1 mm x 15 mm. Typisk kan hver brønn laste opp til 30 pl av prøvene. Kjør gelen prøven ved 10 V / cm bredde av gel i 1 x TBE-buffer inntil bromfenol blått fargestoff bare går ut av bunnen av gelen.
- Flekken og visualisere gelen som beskrevet i trinn 2.3.
- Eksisere 146 basepar band og elueres over natten i 0,25 ml HSCB på en måte som ligner på det som er beskrevet i kapittel 2.4. DNA utfelles i et like stort volum av isopropanol og 1/10 volum natriumacetat. Vask pelleten i 70% ethanol og resuspender i TE buffer.
- Kvantifisere biblioteket ved hjelp picogreen i henhold til produsentens anbefalinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forventede resultater for den foregående metode skal i utgangspunktet være observasjon av et enkelt nukleotid skift (økning) i størrelsen av DNA-oligonukleotid som var gjenstand for adenylation av Mnd RNA-ligase (figur 2). Etter 3 'ligering, visualisering av akrylamid gel indikerer (se figur 3) med høy molekylvekt skarpe band tydelig i nukleotid 100-300 regionen av gelen. Dette indikerer at den totale RNA-prøven som anvendes er av høy kvalitet (ikke degradert). For det andre bør man observere en meget lys signal ved 25 nukleotid-regionen av gelen, noe som er overflødig, unligated 3 'linker. Det kan også være nyttig å inkludere en RNA noe inngangskontroll i 3 'ligering. Dette vil indikere renheten av 3'-linkeren, og også kan utføres gjennom til PCR-trinnet for indikasjon av syklusen når antallet ikke-spesifikt signal blir problematisk. Det er ingen diagnostisk for 5 'LigeringsEr imidlertid vist i figur 4 er et reaksjons identisk med den som er beskrevet utført med radio-merket RNA som indikerer viktigheten av den høye konsentrasjonen av PEG8000 anvendes. Til slutt, etter PCR og nativ PAGE, et DNA-produkt på 146 basepar i samsvar med størrelsen av adapterkragene sekvenser, en miRNA innsats, og ytterligere sekvens fra de forlengede PCR-primere kan observeres. Det er viktig å merke seg at hvis den riktige antall PCR-sykluser (som er bestemt empirisk) er overskredet, kan det hende at ingen miRNA innsatsen produkt tilsløre amplikonet ønsket størrelse. Vist i figur 5 er et resultat fra 5 pmol av syntetisk miRNA, typisk i 2 mikrogram av total RNA 13-18 cykler av PCR er nødvendige.
Figur 1. Skjematisk av arbeidsflyten for 2-trinns ligation små-RNA bibliotek forberedelse. Shown generelle trinn for utarbeidelse av en objektiv Mir-Seq bibliotek. Vist i sort er 3 'DNA-ligerings adapter, som aktiveres via adenylation i trinn 1, blir miRNA vist i grønt, og er ligert til 3'-adapter i trinn 2, og 5' adapter ligation RNA er i blått som er ligert til kimært molekyl i trinn 3. nummererte trinn er beskrevet i detalj i det protokoll delen, kursiv indikerer enzymatiske trinn.
Figur 2. adenylation av 3 '. Bindende gruppe med Mnd RNA-Ligase 18% PAGE-gel fra Urea adenylation av DNA oligonukleotid som skal brukes for etterfølgende 3' ligeringsreaksjonen, (+) angir at prøven ble inkubert med Mnd RNA-ligase, (- ) viser prøven inkuberes uten enzym, og (m) angir størrelse standarder (tall vist ent rett i basepar). På venstre side er et skjematisk av oligonukleotidet arter som er tilstede. Asterisk indikerer større DNA-produkter generert av avvik oligonukleotidsyntese.
Figur 3. 3 'Ligation av syntetisk og Total RNA prøver. A) 15% PAGE-gel av urea 3 'ligeringsreaksjoner, (m) indikerer størrelsesstandarder (tallene på venstre side indikerer basepar), (ingen RNA) indikerer en reaksjon med noe inngangs RNA og 3' linker som ikke ble gel-renset , (+) indikerer ligering utført med 5 pmol av syntetisk miRNA og en 3 'linker som var gel-renset, (2 og 1 ug) angir mengden av mus total RNA utsatt for 3' ligering med det samme, gelrenset linkeren indikerer stjerne overflødig 3 'linker. B) autoradiogram av lignende 3' ringsreaksjonen utført med P 32 5 'ende-merket syntetisk miRNA. Nummer på toppen angir tiden (timer) ble reaksjonen tillatt å fortsette, og ved bunnen indikerer mengden ligert som en prosentandel av summen av unligated og ligert.
Figur 4. 5 'Ligering av Radio-merket miRNA-3'Linker Hybrid. Autoradiogram av 5' ringsreaksjonen utført med P 32 5 'enden merket syntetisk miRNA-3' linker hybrid. Nummer på toppen indikerer mengden av PEG som anvendes i reaksjonen, og nummeret på bunnen indikerer mengden ligert som en prosentandel av summen av unligated og ligert. Linjer på venstre side er et skjematisk riss av de ligerte molekyler hvor miRNA er i grønt, 5 'og 3' adaptere er blå og svart, respektivt.
pload / 52095 / 52095fig5highres.jpg "/>
Figur 5. PCR-avledet små-RNA DNA Library. 8% Native PAGE av PCR produktene generert fra Mir-Seq ligation prosedyre. Tallene på toppen indikerer sykluser av PCR, tallene på side indikerer molekylære størrelse standarder. Hver DNA-arter fra PCR-er identifisert på riktig måte. Rutenett mønster skyldes auto-fluorescens av prøven parabolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metodikk som er beskrevet her gjør bruk av flere viktige variable for å maksimere ligerings-effektivitet, nemlig høye konsentrasjoner av PEG, anvendelse av linkere, randomiserte og høy konsentrasjon av 2,6,9-linkere. Denne tilnærmingen tillater pålitelig kvantitative sekvense biblioteker fra total RNA prøver to. Vi har gjennomført flere titreringer av innspill RNA og har konkludert med at den foregående metodikk som er best egnet for total RNA beløp i 1-8 mikrogram området (data ikke vist). Når beløp i 10-500 ng serien er brukt, er et flertall av lese mellomrom fortært av adapter concatamers og bakterie sekvenser hvorfra RNA ligaser blir renset. Det er imidlertid verdt å merke seg i disse lave inngangs eksperimenter som Mir arter til stede, men lav i leser-nummer, er fortsatt gjenspeiler faktiske beløp sammenlignet med identiske høyere inngangsprøver. For å sikre at de MIR profiler observert fra de totale RNA-prøvene er reflekterende av selvebeløp, og å tillate kryssforhør av forskjellige prøver, vi rutinemessig inkludere 10-fold fortynninger av tre syntetiske kalibrator RNA 12. Vi har funnet at inkludering av 0,1: 0,01: 0,001 pmol av distinkte RNA kalibrator gi anvendelige leser tall for å bekrefte den kvantitative innholdet av analysen.
Som angitt på figur 1 (se stjerne) syntetiske oligonukleotider inneholder ofte avvikende molekyler som er forskjellig i størrelse fra sekvensen som er bestilt. Dersom disse produktene er i stand til å ko-renser med miRNA-3 'linker-hybrid, så kan det være nødvendig å rense PAGE 3'-linkeren etter Mnd adenylation. Vi har funnet dette å være nyttig for å redusere mengden av ikke-spesifikk PCR-produktet ble observert i negative kontrollprøver.
Selv om metoden beskrevet ovenfor ble benchmarket for kvantitativ utarbeidelse av miRNA bibliotekene to, vi fullt forventer at det er lett applicable til mer generelle prosedyrer samt; nemlig RNA-seq og CLIP-Seq (Cross Link Immuno-Nedbør) bibliotek forberedelse. Faktisk har vi ansatt noen av de samme prinsippene fra den forrige metodikk til clip-Seq eksperimenter som resulterer i robust bibliotek PCR i forhold til tidligere publiserte rapporter 13 (data ikke vist). Til slutt, som serum mirnas få trekkraft som en medisinsk diagnostisk verktøy, forventer vi foregående metodikk vil hjelpe mye i identifisering av de mest robuste og pålitelige miRNA biomarkører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10x Ligation buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10x Ligation buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina index primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2x Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low retention microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
