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Neuroscience

की जांच Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52139
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

Summary

इस प्रोटोकॉल निकटता Ligation परख ड्रोसोफिला लार्वा neuromuscular जंक्शन पर सीटू प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दर्शाता है। इस तकनीक के साथ, डिस्क बड़े और हू-ली ताई शाओ पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एक जटिल, पहले सह immunoprecipitation के माध्यम से पहचान की एक एसोसिएशन बनाने के लिए दिखाए जाते हैं।

Introduction

बड़े ड्रोसोफिला डिस्क (dlg) प्लाज्मा झिल्ली के विशिष्ट स्थलों पर बड़े प्रोटीन परिसरों की विधानसभा आर्केस्ट्रा मदद प्रोटीन है कि मचान की झिल्ली जुड़े guanylate काइनेज परिवार का एक संरक्षित सदस्य है। एक ट्यूमर शमन प्रोटीन, dlg उपकला apicobasal polarity के 1,2,3 का एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में कार्य करता है के रूप में मूल रूप से पहचान की। Dlg भी लार्वा विकास 4 दौरान glutamatergic मोटर न्यूरॉन्स की neuromuscular जंक्शन (NMJ) में एक प्रमुख मचान मॉड्यूल के रूप में कार्य करता है। Dlg लार्वा NMJ में विविध भूमिकाएं निभाता है, और इसके pleiotropism कई प्रोटीन 5,6 के साथ संबद्ध करने की क्षमता पर निर्भर करता है। ऐसा ही एक प्रोटीन हू-ली ताई शाओ (एचटीएस), मुख्य रूप से 7 cytoskeleton एक्टिन-spectrin को विनियमित करने में अपनी भूमिका के संबंध में वर्णित किया गया है कि स्तनधारी adducins करने के लिए एक सजात है। यह पहले dlg और एचटीएस में इन विट्रो के आधार पर एक दूसरे के साथ एक जटिल फार्म कर सकते हैं दिखाया गया है कि 8 को शामिल सह immunoprecipitation प्रयोगों। इन परिणामों के एक कमी है, तथापि, वे जहां इस जटिल रूपों का संकेत नहीं है। Immunohistochemistry के उपयोग के साथ, dlg और एचटीएस का वितरण लार्वा NMJs की पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में ओवरलैप करने के लिए मनाया जाता है, लेकिन वे इस क्षेत्र में 8 में एक परिसर में कर रहे हैं? हाल ही में दिखाया गया है और आगे यहाँ विस्तृत रूप में, निकटता Ligation परख (पीएलए) लार्वा NMJ 27 पर विशेष रूप से dlg और एचटीएस के बीच सीटू सहयोग से एक के लिए देखने के लिए प्रयोग किया जाता है।

पीएलए ज्यादातर सीटू 9 में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगा सकते हैं कि सेल और ऊतक संस्कृति में इस्तेमाल एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है। इस परख में, ब्याज की दो प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी प्रजाति विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी की एक जोड़ी के साथ पता चला रहे हैं, oligonucleotides के संयुग्मित कर रहे हैं जो पीएलए जांच, कहा जाता है (चित्रा 1 ए, बी)। दो प्रोटीन हैंएस, संलग्न पीएलए जांच के बीच की दूरी दो अतिरिक्त कनेक्टर oligonucleotides (चित्रा 1C) के संकरण के माध्यम से दूर किया जा सकता है (नैनोमीटर की कुछ दसियों के भीतर यानी) एक दूसरे के करीब निकटता में हैं। इस रचना में, कनेक्टर oligonucleotides के नि: शुल्क समाप्त होता है एक दूसरे के साथ संपर्क बनाने के लिए काफी करीब हैं, और एक बंद परिपत्र डीएनए अणु सीटू बंधाव में (चित्रा -1) पर गठित किया जा सकता है। परिपत्र डीएनए अणु पीएलए जांच (चित्रा 1E) संयुग्मित oligonucleotides के एक से primed है जो बगल में रोलिंग चक्र प्रवर्धन, के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। जिसके परिणामस्वरूप प्रवर्धित, concatemeric डीएनए उत्पाद भीतर दृश्यों तो fluorescently लेबल, पूरक oligonucleotide जांच (चित्रा 1F) के साथ देखे जा सकते हैं। प्रवर्धित डीएनए पीएलए जांच में से एक, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत ढंग से की subcellular स्थानीयकरण के साथ जुड़ा रहता चूंकिNA ऊतक आसानी से पता लगाया जा सकता है।

कई तरीकों आमतौर पर इस तरह के सह immunoprecipitation के रूप में इन विट्रो तकनीक में शामिल प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने (-नीचे खींच assays और खमीर दो संकर स्क्रीनिंग, और इस तरह के Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) और bimolecular प्रतिदीप्ति complementation रूप विवो तकनीक में इस्तेमाल किया जाता है BiFC)। इन विट्रो तकनीकों का एक ख़तरा बातचीत endogenously उत्पन्न हो रही है, जहां में ऊपर उल्लिखित विवो तकनीक उनके अंतर्जात समकक्षों के जन्म का व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है कि संलयन प्रोटीन की कृत्रिम अभिव्यक्ति को शामिल करते हुए वे पहचान नहीं है। पीएलए का एक प्रमुख लाभ यह है कि वित्तीय संसाधन के लिए तुलनीय जा रहा है एक संकेत उत्पन्न करने के लिए आवश्यक निकटता की डिग्री के साथ, एक ऊतक के भीतर एक दूसरे के करीब निकटता में हैं और संभावना है कि एक जटिल गठन कि अंतर्जात प्रोटीन interactors के subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने में सक्षम है, वह यह है किईटी और BiFC। पीएलए के कारण एंटीबॉडी मान्यता और डीएनए प्रवर्धन की युग्मन के लिए उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ बातचीत का पता लगा सकते। इस प्रकार, परख बातचीत की सही स्थिति का पता चलता है कि puncta के रूप में असतत, उज्ज्वल संकेतों को उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, शायद ही दिखाई दे एंटीजन का पता लगाया जा सकता है। अंत में, पीएलए प्रदर्शन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है, और इसे पूरा करने के लिए एक मानक immunohistochemical प्रक्रिया से नहीं रह लेता है। इसलिए, पीएलए अक्सर लंबी तैयारी के समय और व्यापक समस्या निवारण के साथ त्रस्त हैं कि अन्य प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत assays के ऊपर एक तकनीकी लाभ प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल पीएलए बगल में अंतर्जात प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के उद्देश्य के लिए ड्रोसोफिला लार्वा NMJ करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कैसे को दर्शाता है। इधर, पीएलए dlg और एचटीएस वास्तव में NMJs की पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एक परिसर में मौजूद करने के लिए दिखाए जाते हैं, जहां लार्वा शरीर दीवार मांसपेशियों की तैयारियों पर किया जाता है। पीएलए ने पहले लार्वा NMJ अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है, और ड्रोसोफिला ऊतकों में इस परख का इस्तेमाल किया है कि प्रकाशित कागजात के केवल एक मुट्ठी वर्तमान में कर रहे हैं। यह ड्रोसोफिला समुदाय को पीएलए के आगे लोगों तक पहुंचाने के अन्य, अधिक आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत assays के पूरक करने के लिए एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में अपनी वृद्धि हुई उपयोग में परिणाम होगा कि आशा व्यक्त की है।

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Protocol

1. शरीर दीवार तैयारी

। नोट: पहले से ब्रेंट एट अल 10, या रामचंद्रन और Budnik 11,12 में वर्णित के रूप में (शरीर दीवार मांसपेशियों अंदर आना जो NMJs के अध्ययन के लिए) तीसरे instar लार्वा शरीर दीवारों की तैयारी लेकिन कुछ संशोधनों के साथ, प्रदर्शन किया गया था।

  1. विच्छेदन
    1. मानक प्रक्रियाओं 13 का उपयोग करते हुए 5-6 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मक्खी स्टॉक और पार उठाएँ।
    2. ठीक संदंश का उपयोग शीशियों या बोतलों से तीसरे instar लार्वा रेंगने उठाओ।
    3. किसी भी खाद्य कणों को दूर करने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त एक छोटा सा पेट्री डिश में लार्वा धो लें।
    4. एक Sylgard डिस्क पर एक भी लार्वा प्लेस और ठंडा पीबीएस की कुछ बूंदों में यह विसर्जित कर दिया। ठंडा पीबीएस में हेरफेर करने के लिए इसे आसान बनाने के लार्वा अचेत मदद मिलेगी का उपयोग करना। विच्छेदन के दौरान, तैयारी हमेशा सुखाने से इसे रोकने के लिए पीबीएस में डूबे हुए है कि सुनिश्चित करते हैं।
    5. La स्थित करेंइसके पृष्ठीय पक्ष दो सांस की नली इलाकों एक विदारक माइक्रोस्कोप (2A चित्रा) के तहत दिखाई दे रहे हैं ताकि ऊपर का सामना करना पड़ के साथ RvA। संदंश का प्रयोग, एक minutien पिन समझ spiracles (चित्रा 2 बी) के निकट पीछे अंत में लार्वा नीचे पिन। एक और पिन के साथ, मुँह हुक के पास पूर्वकाल अंत में छल्ली के माध्यम से घुसाना। फिर धीरे लंबाई लार्वा बाहर खिंचाव (चित्रा 2B) यह नीचे पिन।
    6. Microdissection कैंची का प्रयोग, एक छोटे से खोलने बनाने के लिए पिन के पास पीछे अंत चुटकी। चीरा सिर्फ छल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए पर्याप्त सतही होना चाहिए।
    7. दो सांस की नली इलाकों (चित्रा -2) के बीच पृष्ठीय midline की पूरी लंबाई के साथ काटा, चीरा में कैंची के नीचे ब्लेड की नोक रखकर। उदर शरीर दीवार की मांसपेशियों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए जब काटने से थोड़ा ऊपर की तरफ कैंची ब्लेड प्वाइंट।
    8. थोड़ा पद के लिए पूर्वकाल एक छोटे क्षैतिज चीराeriorly रखा पिन (चित्रा -2)। एक और इसी तरह चीरा थोड़ा पूर्व से रखा पिन (चित्रा -2) के पीछे बनाओ। चीरों सिर्फ छल्ली के माध्यम से पारित करना चाहिए।
      नोट: एक समान होना चाहिए संयुक्त चरणों 1.1.7 और 1.1.8 से तीन चीरों " जब पूरा ", यानी, लार्वा शरीर के पृष्ठीय पक्ष पर एक बाएँ और दाएँ हाथ फ्लैप का उत्पादन किया जाना चाहिए।
    9. ध्यान से संदंश के साथ आंतरिक अंगों को साफ। पीबीएस के कुछ सशक्त बूँदें जोड़ने, लार्वा शरीर से बाहर अंगों विस्थापित इस प्रकार यह आसान उन्हें हटाने के लिए बनाने में मदद मिलेगी। यह शरीर की दीवार की मांसपेशियों को नुकसान हो जाएगा के रूप में लार्वा शरीर poking से बचें।
    10. खुला लार्वा शरीर फहरा और नीचे कोनों (चित्रा 2 डी) पिन। लगाए करते हैं, तो एक समान रूप से tensioned आयत फार्म करने के लिए दोनों क्षैतिज और खड़ी शरीर दीवार खिंचाव (एसईई चित्रा आकार के लिए 2 जी), देखभाल की प्रक्रिया में शरीर दीवार की मांसपेशियों को फाड़ करने के लिए नहीं।
    11. किसी भी शेष आंतरिक अंगों (चित्रा 2 ई) को हटाने खत्म करो।
  2. फिक्सेशन और Permeabilization
    1. Bouin के समाधान के कई बूंदों में टिकी शरीर दीवारों विसर्जित कर दिया। बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक वैकल्पिक लगानेवाला के रूप में 4% paraformaldehyde (पीएफए) का उपयोग करें; 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. ट्राइटन के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीटी) के साथ तीन बार कुल्ला।
    3. ठीक संदंश का प्रयोग, ध्यान पिंस हटाने और एक siliconized 0.65 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में उनके कोनों से शरीर की दीवारों हस्तांतरण।
    4. पीएलए के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीटी में शरीर की दीवारों स्टोर। इष्टतम परिणामों के लिए, एक दिन या विच्छेदन के दो भीतर शरीर दीवारों immunostaining शुरू करते हैं।
      नोट: अभिकर्मकों पर बचाने के लिए और शरीर के सभी दीवारों परख के दौरान समान रूप से व्यवहार कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए, अलग जीनोटाइप एक एकल में रखा जा सकता हैटूबे। जीनोटाइप (उदाहरण के लिए चित्रा 2 एफ देखें) अलग ढंग से शरीर की दीवारों के कोनों को काटने से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

2. Immunohistochemistry

नोट:। तीसरे instar लार्वा शरीर दीवारों के immunostaining पहले से ब्रेंट एट अल 14 और रामचंद्रन और Budnik 11 में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया है, लेकिन कुछ संशोधनों के 11,14 के साथ किया गया था।
नोट: जब तक अन्यथा कहा कमरे के तापमान पर और कोमल आंदोलन के साथ सभी चरणों को पूरा करें।

  1. को अवरूध्द
    1. 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीटी के साथ तीन बार शरीर की दीवारों को धो लें।
    2. 1 घंटे के लिए 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ ब्लॉक।
  2. Immunostaining
    1. ब्याज की दो प्रोटीन के खिलाफ माउस और खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ शरीर की दीवारों को सेते कमरे के तापमान पर 2 घंटे, या रात में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए (1% BSA में पतला)। 250 खरगोश एक: इस मामले में, 1:10 माउस विरोधी dlg और एक का उपयोगNTI-HtsM 15,16। नहीं माउस या खरगोश में बना रहे हैं कि मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी भी शामिल किया जा सकता है - उदाहरण के लिए, एक का उपयोग करें: 200 बकरी विरोधी एचआरपी न्यूरोनल झिल्ली चित्रित करने के लिए।
    2. 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीटी के साथ तीन बार धोएं।
    3. कमरे के तापमान पर 2 घंटे, या रात में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए (1% BSA में पतला) मार्करों पता लगाने के लिए फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। बकरी विरोधी एचआरपी एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए 200 FITC संयुग्मित विरोधी बकरी:, जैसे एक का उपयोग करें - पीएलए संकेत बाद में एक लाल फ्लोरोफोरे के साथ कल्पना है, एक और फ्लोरोफोरे मार्कर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कारण प्रकाश के प्रति संवेदनशील अभिकर्मकों का उपयोग करने के लिए, इस बिंदु के बाद से अंधेरे में ट्यूबों रखें।
      नोट: पीएलए confocal माइक्रोस्कोपी के तहत लाल चैनल पर कल्पित संकेत के साथ, माउस और खरगोश में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी के बीच किया जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि किट की अनुमति देता है। अगर वांछित, अन्य किट परख प्रथम के साथ किया जा करने की अनुमति है कि उपलब्ध हैंRY एंटीबॉडी अन्य प्रजातियों में उठाया, और संकेत अन्य चैनलों पर कल्पित।

3. निकटता Ligation परख

नोट: जब तक अन्यथा कहा कमरे के तापमान पर और कोमल आंदोलन के साथ सभी चरणों को पूरा करें।

  1. पीएलए जांच
    1. 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीटी के साथ तीन बार शरीर की दीवारों को धो लें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए: (5 कमजोर पड़ने 1% BSA में प्रत्येक 1) पीएलए जांच के साथ सेते हैं। इस मामले में, 5-10 शरीर दीवारों की उचित विसर्जन और मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए पीएलए जांच विरोधी माउस माइनस के 40 μl, पीएलए जांच विरोधी खरगोश प्लस के 40 μl और 1% BSA के 120 μl का उपयोग करें। पीएलए जांच की एक 1:25 कमजोर पड़ने अप करने के लिए अभी भी (इस प्रयोग के लिए यानी,) एक पर्याप्त संकेत करने वाली शोर अनुपात में परिणाम कर सकते हैं।
  2. बंधाव
    1. 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो बफर के साथ शरीर की दीवारों को धो लें।
    2. एक घंटा एक के लिए Ligation समाधान (Ligation बफर में ligase के 1:40 कमजोर पड़ने) के साथ सेतेटी 37 डिग्री सेल्सियस। इस मामले में, 5-10 शरीर दीवारों की उचित विसर्जन और मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ligase के 5 μl, 5 Ligation बफर के 40 μl और उच्च शुद्धता पानी के 155 μl का उपयोग करें।
  3. विस्तारण
    1. 2 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो बफर के साथ शरीर की दीवारों को धो लें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रवर्धन समाधान (प्रवर्धन बफर में पोलीमरेज़ के 1:80 कमजोर पड़ने) के साथ सेते हैं। इस मामले में, 5-10 शरीर दीवारों की उचित विसर्जन और मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए पोलीमरेज़ 2.5 μl, 5 प्रवर्धन बफर के 40 μl और उच्च शुद्धता पानी के 157.5 μl का उपयोग करें।
  4. इमेजिंग के लिए तैयारी
    1. 10 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो बफर बी के साथ शरीर की दीवारों को धो लें।
    2. एक मिनट के लिए एक बार 0.01x धो बफर बी के साथ धोएं।
    3. बढ़ते से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बढ़ते समाधान की कुछ बूँदें में संतुलित, या 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात दुकान।
    4. ठीक संदंश का प्रयोग, ध्यान एक मंच स्लाइड W पर शरीर की दीवारों का स्थानांतरणith उनके cuticles के नीचे का सामना करना पड़। पंक्तियों में और mountant की एक बूंद या दो के भीतर एक ही ओरिएंटेशन में शरीर की दीवारों स्थिति। तो स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सील, हवाई बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं तैयारी देखभाल पर एक 22 मिमी x 40 मिमी coverslip जगह।
    5. Confocal इमेजिंग के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड्स स्टोर।

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Representative Results

जंगली प्रकार तीसरे instar लार्वा NMJs में, dlg मुख्यतः प्रकार BOUTONS की तुलना dlg immunoreactivity स्तरों प्रकार आईबी BOUTONS में अधिक स्पष्ट होने के साथ, प्रकार मैं glutamatergic BOUTONS के पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में पाया जाता है (चित्रा 3 ए) 4। एचटीएस पेशी के दौरान मौजूद है, लेकिन एचटीएस immunoreactivity स्तरों दोनों प्रकार मैं BOUTONS में बराबर प्रदर्शित होने के साथ पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र पर केंद्रित है, और यह भी (चित्रा 3 ए ') 8,17 presynaptically पाया जाता है। Dlg और एचटीएस के वितरण में बड़े पैमाने पर पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र (चित्रा 3 ए '') 8 में ओवरलैप है कि ध्यान दें।

Dlg और एचटीएस NMJ में एक परिसर में मौजूद तो यह निर्धारित करने के लिए, पीएलए दो प्रोटीन के बीच लार्वा शरीर दीवार मांसपेशियों तैयारियों पर प्रदर्शन किया गया था। इस परख, एन टर्मिनस और एक खरगोश विरोधी HtsM एंटीबॉडी में दूसरे PDZ डोमेन का पता लगाता है कि एक माउस विरोधी dlg एंटीबॉडी के लिएकि सी टर्मिनस पर MARCKS-अनुरूपता डोमेन 15,16 इस्तेमाल किया गया पता लगाता है। जंगली-प्रकार में, dlg और एचटीएस के बीच पीएलए संकेत विशेष रूप से NMJ (चित्रा -3 सी-सी '') पर मनाया गया। संकेत ज्यादातर इस प्रकार dlg और एचटीएस एक दूसरे के करीब निकटता में हैं और संभावना पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एक जटिल है कि फार्म का संकेत है, एचआरपी द्वारा demarked किया गया था जिस प्रकार मैं BOUTONS के प्रीसानेप्टिक झिल्ली को circumferentially स्थानीयकृत। परिणाम एचटीएस immunoreactivity कि कमी एचटीएस 01,103 उत्परिवर्ती NMJs शामिल है, हमारी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में विशिष्ट होने के लिए निर्धारित किया गया था (चित्रा 3 बी-बी ''), कोई नमूदार पीएलए संकेत (चित्रा 3 डी) 8,17,18 दिखाया। इसके अलावा, पीएलए (नहीं दिखाया डेटा) कोई संकेत उत्पादित खरगोश विरोधी HtsM एंटीबॉडी जोड़ने के बिना प्रदर्शन किया। BOUTONS के उच्च बढ़ाई विचारों dlg और एचटीएस immunoreactivity निहायत पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में छा पता चला है कि (चित्रा 3E), दो प्रोटीन के बीच पीएलए जबकि कुल dlg और एचटीएस प्रोटीन का केवल एक सबसेट जटिल (चित्रा 3F) में हैं यह दर्शाता है कि विचारशील puncta में हुई।

आगे लार्वा NMJ अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में पीएलए की विश्वसनीयता का परीक्षण करने के लिए, हम भी सेरीन / threonine P21 सक्रिय काइनेज, पाक, और अन्य अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन 19 के बीच बातचीत का मूल्यांकन किया। पिछला सह immunoprecipitation प्रयोगों पाक dlg भी एक सदस्य 20 है, जिनमें से घसीटना जटिल, का एक सदस्य है कि पता चला है। जंगली प्रकार NMJs में, पाक यह dlg स्थानीयकरण 15,21 के लिए आवश्यक है, जहां पोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व (चित्रा -4 ए, सी), के लिए localizes। पाक और dlg की immunoreactive वितरण विशेष रूप से NMJ (चित्रा 4 बी) पर एक सकारात्मक संकेत के परिणामस्वरूप दो प्रोटीन के बीच पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र (चित्रा -4 ए '') में ओवरलैप करते हैं, और पीएलए। इन परिणामों के दो प्रोटीन सी में संकेत मिलता है कि एक दूसरे से निकटता खो देते हैं और संभावना है कि इस क्षेत्र में एक जटिल आकार लेते हैं। हम बाध्यकारी पाक जटिल के लिए परीक्षण किया एक और synaptic प्रोटीन पंखहीन (विंग), NMJ 22 में कई भूमिकाएं निभाता है जो ड्रोसोफिला Wnt ligand था। जंगली-प्रकार में, विंग मैं BOUTONS प्रकार की presynaptic और postsynaptic पक्षों में समृद्ध है, लेकिन यह भी मांसपेशी कोशिका द्रव्य (चित्रा 4C ') 23 भर puncta के रूप में मौजूद है। पाक और विंग की immunoreactive वितरण आंशिक रूप से पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र (चित्रा 4C '') पर छा हालांकि दिलचस्प बात यह है, पीएलए दो प्रोटीन के बीच कोई प्रत्यक्ष संकेत (चित्रा 4D) का उत्पादन किया। इसलिए, पाक और विंग NMJ में एक दूसरे के करीब निकटता में नहीं हैं। इस परिणाम पारंपरिक सह स्थानीयकरण प्रयोगों के माध्यम से अतिव्यापी immunoreactivities चलता है कि नहीं सभी प्रोटीन एक पीएलए संकेत उत्पन्न होगा यह दर्शाता है कि, और एक अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।

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चित्रा 1: निकटता Ligation परख की योजनाबद्ध आरेख। (ए) के प्राथमिक एंटीबॉडी मानक immunohistochemical प्रक्रियाओं का उपयोग ब्याज की दो प्रोटीन के लिए बाध्य। (बी) प्राथमिक एंटीबॉडी तो प्रजाति विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी की एक जोड़ी के साथ पता चला रहे हैं, oligonucleotides के संयुग्मित कर रहे हैं जो पीएलए जांच, कहा जाता है। (ग) यदि दो प्रोटीन एक दूसरे के करीब निकटता में हैं, संलग्न पीएलए जांच के बीच की दूरी दो अतिरिक्त कनेक्टर oligonucleotides के संकरण के माध्यम से दूर किया जा सकता है। (डी) इस रचना में, कनेक्टर oligonucleotides के सीटू बंधाव इन पर बंद हुआ परिपत्र डीएनए अणु फार्म कर सकते हैं । (ई) परिपत्र डीएनए अणु ओली में से एक ने primed है जो वृत्त प्रवर्धन, रोलिंग सीटू के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता हैप्रवर्धित डीएनए उत्पाद भीतर पीएलए जांच संयुग्मित gonucleotides। (एफ) दृश्यों तो fluorescently लेबल, पूरक oligonucleotide जांच के साथ पाया जाता है। आंकड़ा Weibrecht एट अल। 24 के आधार पर किया गया था कि ध्यान दें। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2: तीसरे instar लार्वा शरीर दीवारों की तैयारी। पूर्वकाल और कूल्हों सिरों पर (वायुसेना) एक शरीर दीवार विच्छेदन का प्रतिनिधित्व योजनाबद्ध चित्र। (ए) ने अपने पृष्ठीय पक्ष दो सांस की नली इलाकों दिखाई दे रहे हैं इतना है कि ऊपर का सामना करना पड़ के साथ एक Sylgard डिस्क पर एक भी लार्वा रखें। (बी) पिन लार्वा नीचे इस प्रक्रिया में लंबाई में लार्वा बाहर खींच minutien पिन, के साथ। (सी) (डी) एक समान रूप से tensioned आयत फार्म करने की प्रक्रिया में दोनों क्षैतिज और खड़ी शरीर दीवार खींच, खुले लार्वा शरीर फहरा और नीचे कोनों पिन। (ई) सदृश चाहिए बाहर किसी भी शेष आंतरिक अंगों। (एफ) दिखाए अलग जीनोटाइप भेद करने के क्रम में शरीर की दीवारों के कोने में कटौती करने के लिए अलग अलग तरीकों के उदाहरण हैं। एक बढ़ाकर शरीर दीवार तैयारी (G) देखें जब पूरा। तस्वीर एक विदारक माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की है एक डिजिटल कैमरा के साथ लिया गया था। पैनल एफ में स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। आंकड़ा रामचंद्रन और Budnik, 2010 से 12 के आधार पर किया गया था कि ध्यान दें। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3:। Dlg और एचटीएस 'उत्परिवर्ती NMJs जंगली प्रकार में dlg (लाल) और एचटीएस (हरा) के वितरण और एचटीएस (एए। लार्वा NMJs की पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एक परिसर में (एबी') 'अस्तित्व') जंगली में NMJs प्रकार, dlg मुख्य रूप से dlg स्तरों BOUTONS की तुलना प्रकार आईबी में अधिक स्पष्ट होने के साथ, प्रकार मैं BOUTONS के पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में पाया जाता है। एचटीएस पेशी के दौरान मौजूद है, लेकिन यह भी एचटीएस स्तरों दोनों प्रकार मैं BOUTONS में इसी प्रकार के साथ किया जा रहा पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र के आसपास केंद्रित है। dlg और एचटीएस का वितरण पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र। (बी बी '') HTS के लिए NMJs उत्परिवर्ती एचटीएस immunoreactivity के अभाव में ओवरलैप। एचटीएस 01,103 उत्परिवर्तन प्रभाव NMJ आठ शाखाओं में नोट करें कि। (सीडी '') dlg और एचटीएस के बीच पीएलए (लाल) जंगली प्रकार पर प्रदर्शन किया और उत्परिवर्ती NMJs एचटीएस। एचआरपी न्यूरोनल झिल्ली (हरा) चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कुछ BOUTONS। (सीसी '') जंगली प्रकार में की उच्च वृद्धि विचार कर रहे हैं दिखाया गया है, पीएलए संकेत NMJ पर विशेष रूप से मनाया जाता है। संकेत ज्यादातर dlg और एचटीएस एक दूसरे के करीब निकटता में हैं और पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एक परिसर में मौजूद यह दर्शाता है कि प्रकार मैं BOUTONS के प्रीसानेप्टिक झिल्ली को circumferentially स्थानीय है। एचटीएस के लिए (डी) NMJs उत्परिवर्ती कोई नमूदार पीएलए संकेत दिखाया। प्रोटीन का केवल एक सबसेट एक परिसर में कर रहे हैं यह दर्शाता है कि (एफई) एकल BOUTONS की उच्च वृद्धि विचार कर रहे हैं दिखाया गया है। (ई) पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एचटीएस और dlg immunoreactivity निहायत ओवरलैप। अलग puncta में dlg और एचटीएस परिणाम के बीच (एफ) पीएलए । 'पैनल बी में स्केल बार' ('40 माइक्रोन एबी) का प्रतिनिधित्व करता है'; 'पैनल विकास में बड़े पैमाने बार' ('10 माइक्रोन सीडी) का प्रतिनिधित्व करता है'; scalपैनल एफ में ई बार 5 माइक्रोन (एफई) का प्रतिनिधित्व करता है। सब दिखाया NMJs 4. छवियाँ एनआईएस-तत्वों सॉफ्टवेयर के साथ एक Nikon A1R लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग विलय कर दिया ढेर के रूप में लिया, और एडोब फोटोशॉप के साथ कार्रवाई कर रहे थे पेट खंड में मांसपेशियों 6/7 से कर रहे हैं। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

चित्रा 4
चित्रा 4: पाक लार्वा NMJs की पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में, विंग dlg के साथ एक परिसर में मौजूद है, लेकिन नहीं दिखाया (ई) कुछ BOUTONS की उच्च वृद्धि विचार कर रहे हैं (एए '') पाक (हरा) और dlg के वितरण (।। जंगली प्रकार NMJs में लाल)। पाक पोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व को localizes। पाक और dlg की immunoreactive वितरण पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में ओवरलैप है कि ध्यान दें। (बी) पीएलए बीetween पाक और dlg (लाल) जंगली प्रकार NMJs पर प्रदर्शन किया। पीएलए संकेत दो प्रोटीन इस क्षेत्र में एक दूसरे के करीब निकटता में हैं यह दर्शाता है कि NMJ पर विशेष रूप से मनाया जाता है। (सीसी '') जंगली प्रकार NMJs में पाक (हरा) और विंग (लाल) के वितरण। विंग NMJ की presynaptic और postsynaptic दोनों पक्षों में समृद्ध है, लेकिन यह भी पेशी के दौरान puncta के रूप में मौजूद है। पाक की immunoreactive वितरण भी आंशिक रूप से पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में विंग के साथ ओवरलैप करने के लिए मनाया जाता है कि ध्यान दें। पाक और विंग (लाल) के बीच (डी) पीएलए जंगली प्रकार NMJs पर प्रदर्शन किया। कोई विशिष्ट पीएलए संकेत दो प्रोटीन उनके ओवरलैपिंग वितरण के बावजूद NMJ में एक दूसरे के करीब निकटता में नहीं हैं, यह दर्शाता मनाया जाता है। पैनल डी में स्केल बार 5 माइक्रोन (ई) का प्रतिनिधित्व करता है। पेट खंड में अंदर आना सभी NMJs मांसपेशियों 07/06 4. छवियाँ एनआईएस-तत्वों सॉफ्टवेयर के साथ एक Nikon A1R लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग विलय कर दिया ढेर के रूप में लिया, और समर्थक थेएडोब फोटोशॉप साथ cessed। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस रिपोर्ट में पीएलए ड्रोसोफिला लार्वा NMJ को लागू किया जा सकता है दर्शाता है। परख NMJ में उपस्थित अंतर्जात प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के उद्देश्य के लिए लार्वा शरीर दीवार मांसपेशियों की तैयारियों पर किया जाता है। इस तकनीक के साथ, dlg और एचटीएस एक दूसरे के करीब निकटता में हो सकता है, और इस प्रकार विशेष रूप से पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र 27 पर, एक परिसर में मौजूद करने के लिए दिखाए जाते हैं। इस परिणाम के समर्थन में, पिछले एक अध्ययन निम्न डेटा के साथ अपने सहयोग के सबूत प्रदान की गई है: dlg और एचटीएस की immunoreactive वितरण लार्वा NMJs की पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में ओवरलैप 1), 2) dlg और एचटीएस सह पर आधारित एक जटिल प्रपत्र immunoprecipitation के पूरे वयस्क lysates उड़ान भरने से जुड़े प्रयोगों, और 3) dlg और एचटीएस उपकला और synaptic जंक्शनों आठ दोनों में बातचीत। पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में पीएलए संकेत भी dlg और पाक, पहले से अन्य अध्ययन में पहचान एक बातचीत के बीच मनाया गया, जिससे आगे crede उपलब्ध करानेNMJ 15,20,21 में इस परख का उपयोग करने का nce। दिलचस्प है, पाक और विंग के बीच पीएलए उनके immunoreactive वितरण NMJ पर छा है, भले ही कोई प्रत्यक्ष संकेत में हुई। इस परिणाम immunoreactive वितरण ओवरलैपिंग चलता है कि नहीं सभी प्रोटीन इसलिए पीएलए पारंपरिक सह स्थानीयकरण अध्ययनों की तुलना में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में एक उच्च संकल्प प्रदान करता है यह दर्शाता है कि एक पीएलए संकेत उत्पन्न होगा यह दर्शाता है कि।

अनेक परिवर्तनों लार्वा NMJ के लिए परख का अनुकूलन करने के क्रम में मूल पीएलए प्रोटोकॉल के लिए किए गए 9,25 (डेटा) नहीं दिखाया। सबसे पहले, यह 1% बीएसए शरीर दीवारों के बजाय प्रदान की अवरुद्ध समाधान के लिए एक बेहतर अवरुद्ध एजेंट है कि निर्धारित किया गया था। दूसरा, प्रतिक्रिया समाधान में शरीर की दीवारों का एक मजबूत संकेत करने वाली शोर अनुपात, उचित विसर्जन और मिश्रण का निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक 0.65 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 09:55 शरीर दीवारों के लिए 200 μl की एक न्यूनतम suitab समझा थाअधिक शरीर की दीवारों प्रसंस्करण जब संस्करणों तदनुसार बढ़ाया जा सकता है, हालांकि ले, पीएलए जांच, ligase या पोलीमर्स के साथ incubating है। सिग्नल की शक्ति भी सिफारिश से अधिक बार 30 मिनट से प्रतिक्रिया समय को बढ़ाने के द्वारा बढ़ाया गया था। तीसरा, पीएलए जांच के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने परीक्षण अभिकर्मक संरक्षण और सिग्नल की शक्ति के बीच संतुलन का अनुकूलन करने के लिए प्रदर्शन किया था। की सिफारिश की एक से - अप 1:25 कमजोर पड़ने के लिए, इस रिपोर्ट में प्रदर्शन प्रयोगों के लिए: 5 कमजोर पड़ने - अभी भी एक उचित संकेत करने वाली शोर अनुपात उत्पादन कर सकते हैं। बंधाव और प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं की है कि अनुकूलन नोट प्रदर्शन नहीं कर रहे थे। पीएलए मिनट में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हो सकता है के रूप में अंत में, यह दृढ़ता से नियंत्रण और प्रयोगों परख के दौरान समान रूप से व्यवहार कर रहे हैं इतना है कि एक ही प्रयोग के अलग जीनोटाइप एक एकल ट्यूब में रखा जाता है कि सिफारिश की है। जीनोटाइप अलग तरह से शरीर की दीवारों के कोनों को काटने से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

Severaएल विधियों खमीर दो संकर स्क्रीनिंग, सह immunoprecipitation और झल्लाहट सहित ड्रोसोफिला प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए किया जाता है। लेकिन इन तरीकों पीएलए और बगल में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत कल्पना करने के लिए अपनी क्षमता के खिलाफ तुलना कैसे करते हैं? खमीर दो संकर खमीर में व्यक्त ड्रोसोफिला प्रोटीन के बीच बाध्यकारी प्रत्यक्ष पता लगा सकते हैं, और यह उच्च throughput जीनोम चौड़ा स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया है। पहचान की बातचीत के कई जैविक रूप से प्रासंगिक हैं, परख अक्सर झूठी सकारात्मक पैदा करता है। इसके अलावा, झूठी नकारात्मक कई कारणों से हो सकता है: प्रोटीन बंधन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो प्रतिलेखन कारक डोमेन के लिए जुड़े हुए हैं, कई मुलाकातों बाद translational खमीर में नहीं होती है, जो संशोधनों, और (परख जगह लेता है जहाँ) नाभिक आवश्यकता हो सकती है कुछ बातचीत ठीक से फार्म करने के लिए एक उपयुक्त वातावरण नहीं हो। यह उनके पैतृक माहौल में अंतर्जात प्रोटीन के साथ सौदों जैसे मुद्दों पीएलए के साथ सामना नहीं कर रहे हैंonment। अंतर्जात प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक विधि सह immunoprecipitation है। ड्रोसोफिला lysates से जुड़े प्रयोगों एक बातचीत तब होता है, जिसमें जीवन चक्र में ऊतक और मंच प्रकट कर सकते हैं। Lysate गठन प्रोटीन निकालने के लिए कोशिकाओं में खलल न डालें शामिल है लेकिन, जैसा कि बातचीत में होता है, जिसमें ऊतक के भीतर कोशिकाओं, साथ ही इसकी subcellular स्थानीयकरण का मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है - पीएलए में विपरीत है। इसके अलावा, सह immunoprecipitation बाध्यकारी प्रोटीन जटिल पता लगाता है और परिसर के भीतर प्रोटीन एक दूसरे के करीब निकटता में हैं जो भेद नहीं कर सकते। कोशिका के भीतर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के दृश्य की अनुमति है कि Drosophilists के लिए उपलब्ध ऐसी झल्लाहट के रूप तरीके हैं। हालांकि, झल्लाहट फ्लोरोसेंट टैग के लिए जुड़े हुए ट्रांसजेनिक प्रोटीन की overexpression शामिल है और पीएलए के रूप में अंतर्जात प्रोटीन व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं।

अपने फायदे के बावजूद, कुछ limitat कर रहे हैंआयनों पीएलए का उपयोग करते समय। ऐसा ही एक सीमा विभिन्न प्रजातियों में किया जाता है, जो ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी की उपलब्धता है। वे अंतर्जात बातचीत का सही मायने में प्रतिनिधि नहीं हो सकता है, हालांकि यह समस्या आसानी से टैग किया ट्रांसजेनिक प्रोटीन के उपयोग के साथ धोखा किया जा सकता है। एक और मुद्दा दो प्राथमिक एंटीबॉडी sterically एक दूसरे को या प्राथमिक एंटीबॉडी में से एक का मिलान प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत साइट शामिल है जब बाधा जब पीएलए, जैसे झूठी नकारात्मक उत्पादन हो सकता है। पीएलए एक दूसरे के करीब निकटता में हैं, जो प्रोटीन का पता लगाता है, हालांकि इसके अलावा, यह पुल से नीचे assays और खमीर दो संकर स्क्रीनिंग में विपरीत, प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के बीच भेद नहीं करता। इसके अलावा, अंतर्जात प्रोटीन के बीच पीएलए बातचीत के लिए जिम्मेदार हैं, जो डोमेन के पहचान नहीं होगा। इस प्रकार, अन्य प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत assays के अभी भी पूरी तरह से बातचीत चिह्नित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा molecularlवाई।

शोधकर्ताओं नैनोमीटर के दसियों 26 से हासिल किया जा रहा है के संकल्प के साथ, ड्रोसोफिला लार्वा NMJ के स्थानिक वास्तुकला नक्शा करने के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग शुरू कर दिया है। पीएलए, इसके तुलनीय आणविक संकल्प के साथ, एक कम लागत, NMJ में कई प्रोटीन के संगठन का एक विस्तृत विवरण के निर्माण में सहायता करेगा कि इन अध्ययनों के लिए तकनीकी रूप से सरल पूरक प्रदान करना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उड़ शेयरों प्रदान करने के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र धन्यवाद। हम यह भी एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक और डॉ लिन कूली (येल विश्वविद्यालय) धन्यवाद। एक विशेष धन्यवाद पांडुलिपि पर उसकी मदद के लिए AhHyun हम आ गए करने के लिए चला जाता है। इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल (क्रीगर), विलियम और एडीए इसाबेल स्टील फंड (क्रीगर), और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (कठोर) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps (fine #5) Almedic A10-704
Sylgard Disc World Precision Instruments SYLG184 Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) Fine Science Tools 26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine) Fine Science Tools 15200-00
Platform Slides Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting.
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 3605
hts01103 Bloomington Drosophila Stock Center 10989 Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
Name Company Catalog Number Comments
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large) Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless) Developmental Studies Hybridoma Bank 4D4 Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) Jackson              ImmunoResearch 123-065-021 Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat Jackson             ImmunoResearch 705-095-003 Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red Sigma-Aldrich DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040

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References

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Wang, S., Yoo, S., Kim, H. y., Wang, M., Zheng, C., Parkhouse, W., Krieger, C., Harden, N. Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (95), e52139, doi:10.3791/52139 (2015).

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