Summary
Detta protokoll visar hur Proximity Ligation Assay kan användas för att upptäcka in situ protein-proteininteraktioner på Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen. Med denna teknik är Skivor stora och Hu-li tai shao visat att bilda ett komplex vid postsynaptiska regionen, en sammanslutning som tidigare identifierats genom co-immunoprecipitation.
Introduction
Drosophila Skivor stora (Dlg) är en konserverad medlem av membranassocierat guanylat kinasfamiljen av byggnadsställningar proteiner som hjälper iscensätta montering av stora proteinkomplex vid specifika ställen i plasmamembranet. Ursprungligen identifieras som ett tumörsuppressorprotein, tjänar Dlg som en viktig faktor för epitelial apicobasal polaritet 1,2,3. Dlg fungerar också som en viktig byggnadsställningar modul vid den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) av glutamaterga motoriska nervceller under larvutveckling 4. Dlg spelar olika roller på larv NMJ, och dess pleiotropism förlitar sig på sin förmåga att associera med flera proteiner 5,6. Ett sådant protein är Hu-li tai shao (HTS), en homolog till de däggdjurs adducins som främst har beskrivits i fråga om att deras roller i regleringen av aktin-spek cytoskelettet 7. Det har tidigare visats att Dlg och Hts kan bilda ett komplex med varandra som bygger på in vitro 8. En brist av dessa resultat, är emellertid att de inte anger där denna komplexa former. Med användning av immunohistokemi, är fördelningarna av Dlg och Hts observerats att överlappa på det postsynaptiska membranet av larv NMJs, men är de i ett komplex i denna region 8? Som nyligen visat och beskrivs ytterligare här, är Proximity Ligation Assay (PLA) används för att leta efter en in situ samband mellan Dlg och Hts specifikt på larver NMJ 27.
PLA är en relativt ny teknik som används mestadels i cell- och vävnadskultur som kan detektera protein-proteininteraktioner in situ 9. I denna analys är primära antikroppar mot de två proteiner av intresse detekteras med ett par av artspecifika sekundära antikroppar, benämnda PLA prober, vilka är konjugerade till oligonukleotider (Figur 1A, B). Om två-proteinets är i nära anslutning till varandra (dvs inom några tiotal nanometer), avståndet mellan de bifogade PLA sonder kan överbryggas genom hybridisering av ytterligare två oligonukleotider anslutnings (Figur 1C). I denna konformation, de fria ändarna av oligonukleotider kontaktdons är tillräckligt nära för att få kontakt med varandra, och en sluten cirkulär DNA-molekyl kan bildas vid in situ ligering (figur 1D). Den cirkulära DNA-molekylen tjänar som en mall för in situ rullande cirkel-amplifiering, som laddas genom att en av de oligonukleotider som är konjugerade till PLA prober (figur 1E). Sekvenser inom den erhållna amplifierade, concatemeric DNA-produkt kan sedan visualiseras med fluorescensmärkta, komplementära oligonukleotidsonder (figur 1F). Eftersom det förstärkta DNA förblir fäst till ett av PLA sonder, subcellulära lokalisering av protein-proteininteraktion withina vävnad kan lätt fastställas.
Flera metoder används allmänt för att detektera protein-proteininteraktioner, inklusive in vitro-tekniker såsom sam-immunutfällning, pull-down-analyser och jäst två-hybridscreening, och in vivo-tekniker såsom Förster resonansenergiöverföring (FRET) och Bimolecular Fluorescens Komplettering ( BiFC). En fallgrop av de tekniker in vitro är att de inte identifiera var interaktionen endogent förekommande, medan den tidigare nämnda in vivo tekniker innebär den konstgjorda uttryck av fusionsproteiner som inte kan återspegla det nativa beteendet hos sina endogena motsvarigheter. En stor fördel med PLA är att det är i stånd att bestämma i en vävnad subcellulära lokalisering av endogena protein Interactmedlemmar som är i omedelbar närhet till varandra och sannolikt bildar ett komplex, med graden av närhet krävs för att generera en signal som är jämförbar till FRET och BiFC. PLA kan detektera interaktioner med hög specificitet och känslighet på grund av koppling av antikropps-igenkänning och DNA-amplifiering. Således kan analysen generera diskreta, ljusa signaler i form av puncta som avslöjar den exakta positionen för interaktionen. Dessutom kan knappast synliga antigener detekteras. Slutligen är PLA en relativt enkel teknik för att utföra, och det tar längre tid än en vanlig immunhistokemisk förfarande för att slutföra. Därför ger PLA en teknisk fördel jämfört med andra protein-proteininteraktioner analyser som ofta plågas med långa förberedelsetider och omfattande felsökning.
Detta protokoll visar hur PLA kan appliceras på Drosophila larv NMJ i syfte att detektera endogena protein-proteininteraktioner in situ. Här är PLA utförs på larvkroppen vägg muskelpreparat där Dlg och Hts visar sig faktiskt existera i en komplex på den postsynaptiska regionen av NMJs. PLA har inte tidigare använts för att studera larver NMJ, och det finns i dagsläget bara en handfull publicerade artiklar som har använt denna analys i Drosophila vävnad. Förhoppningen är att ytterligare exponering av PLA till Drosophila samfundet kommer att leda till att en ökad användning som ett kompletterande verktyg för att komplettera andra, mer allmänt använda protein-proteininteraktioner analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Body Wall Förberedelse
OBS: Beredning av tredje stadiet larver kroppsväggar (för studier av de NMJs som innerverar kroppen väggen muskler) utfördes som tidigare beskrivits i Brent et al 10, eller Ramachandran och Budnik 11,12, men med vissa modifieringar..
- Dissektion
- Höj gylflager och korsningar vid 25 ° C under 5-6 dagar under användning av standardförfaranden 13.
- Plocka krypa tredje stadiet larver från ampuller eller flaskor som använder fin pincett.
- Tvätta larver i en liten petriskål innehållande fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna eventuella matrester.
- Placera en enda larv på en sylgard skiva och doppa den i ett par droppar iskall PBS. Använda iskall PBS hjälper bedöva larven vilket gör det lättare att manipulera. Under hela dissektion, se till att preparatet alltid är nedsänkt i PBS för att hindra den från att torka.
- Placera larva med sin ryggsidan vänd uppåt, så att de båda trakeala skrifter är synliga under ett dissektionsmikroskop (Figur 2A). Använda pincett för att förstå en minutien stift, stift larven ner i den bakre änden nära spiracles (Figur 2B). Med ett annat stift, tränga igenom nagelbanden vid den främre änden nära munnen krokar. Sträcka försiktigt larven ut på längden, sedan fästa det ner (Figur 2B).
- Använda microdissection sax, nypa den bakre änden nära stiftet för att skapa en liten öppning. Snittet bör vara ytlig nog att bara passera genom nagelbanden.
- Placering av spetsen på den nedre bladet på saxen i snittet, skär längs hela längden av den dorsala mittlinjen mellan de båda trakeala vägarna (figur 2C). Rikta skärbladen något uppåt när du skär för att undvika att skada de ventrala kroppsvägg muskler.
- Gör ett litet horisontellt snitt något främre till posteneriorly placerade stift (figur 2C). Gör en annan liknande snitt något posteriort om anteriorly placerade stift (figur 2C). Snitten ska bara passera genom nagelbanden.
OBS: De tre snitt från steg 1.1.7 och 1.1.8 i kombination bör likna en "
"När den är klar, dvs en vänster- och högerklaff på ryggsidan av larvkroppen ska produceras. - Försiktigt rensa ut de inre organen med pincett. Lägga några kraftfulla droppar PBS hjälper förskjuta organ ur larvkroppen, vilket gör det lättare att ta bort dem. Undvik att peta larvkroppen eftersom det kommer att orsaka skador på kroppen väggen muskler.
- Rulla larvkroppen öppen och nåla hörnen ner (figur 2D). När pinning, sträcka kroppen väggen både horisontellt och vertikalt för att bilda en jämnt spända rektangel (see Figur 2G för formen), se till att inte riva kroppen väggen muskler i processen.
- Avsluta ta bort eventuella återstående inre organ (Figur 2E).
- Fixering och Permeabilization
- Doppa de fästs kroppsväggarna i flera droppar Bouins lösning. Inkubera i 15 minuter på is. Alternativt kan du använda 4% paraformaldehyd (PFA) som ett alternativ fixerings; inkubera i 30 minuter.
- Skölj tre gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning med Triton (PBT).
- Med fin pincett, försiktigt bort stiften och överföra kroppsväggarna med sina hörn i en silikoniserad 0,65 ml mikrocentrifugrör.
- Förvara kropps väggar i PBT vid 4 ° C tills redo för PLA. För bästa resultat, börja immunfärgning kroppsväggarna inom en dag eller två av dissektion.
OBS: För att spara på reagenser och se till att alla kropps väggar behandlas lika under analysen, kan olika genotyper placeras i en endarör. Genotyper kan särskiljas genom att skära hörnen på kroppsväggarna olika sätt (se figur 2F för exempel).
"När den är klar, dvs en vänster- och högerklaff på ryggsidan av larvkroppen ska produceras. 2. Immunohistokemi
OBS: immunfärgning av tredje instar larver kroppsväggarna utfördes såsom tidigare beskrivits i m.fl. Brent 14 och Ramachandran och Budnik 11, men med vissa modifieringar 11,14..
OBS: Utför alla steg i rumstemperatur och under försiktig omrörning om inte annat anges.
- Blockering
- Tvätta de kroppsväggarna med PBT tre gånger i 10 min vardera.
- Blockera med en% bovint serumalbumin (BSA) under 1 h.
- Immunfärgning
- Inkubera kropps väggar med mus- och kanin primära antikroppar mot de två proteiner av intresse (spädd i 1% BSA) under 2 h vid rumstemperatur, eller över natten vid 4 ° C. I det här fallet, använd 1:10 mus anti-Dlg och 1: 250 kanin aNTI-HtsM 15,16. Antikroppar mot markörer som inte är gjorda i mus eller kanin kan också ingå - t.ex. använd 1: 200 get anti-HRP att avgränsa de neuronala membran.
- Tvätta med PBT tre gånger i 10 min vardera.
- Inkubera med fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar för att detektera markörerna (utspädda i 1% BSA) under 2 h vid rumstemperatur, eller över natten vid 4 ° C. Som PLA signalen senare visualiseras med en röd fluorofor måste en annan fluorofor användas för att detektera markör - t.ex., använd 1: 200 FITC-konjugerat anti-get att detektera get-anti-HRP-antikropp. På grund av användningen av ljuskänsliga reagenser, hålla rören i mörkret från denna punkt och framåt.
OBS: I satsen som används medger PLA som skall utföras mellan primära antikroppar framkallade i mus och kanin, med signalen visualiseras på den röda kanalen under konfokalmikroskopi. Om så önskas kan andra kit finns tillgängliga som gör det möjligt för analysen att göras med primary antikroppar upp i andra arter, och signalen visualiseras på andra kanaler.
3. Närhets Ligering Assay
OBS: Utför alla steg i rumstemperatur och under försiktig omrörning om inte annat anges.
- PLA Probes
- Tvätta de kroppsväggarna med PBT tre gånger i 10 min vardera.
- Inkubera med PLA prober (1: 5 spädning vardera i 1% BSA) under 2 h vid 37 ° C. I det här fallet använder 40 pl PLA sond anti-mus MINUS, 40 pl PLA sond anti-kanin PLUS och 120 pl 1% BSA för att säkerställa en korrekt nedsänkning och blandning av 5-10 kroppsväggar. Upp till en 1:25 utspädning av PLA sonder kan fortfarande resultera i en tillräcklig signal-till-brusförhållande (dvs., för detta experiment).
- Ligering
- Tvätta de kropps väggar med tvättbuffert A två gånger för 5 min vardera.
- Inkubera med Tion lösning (1:40 utspädning av ligas i ligeringsbuffert) under 1 timme at 37 ° C. I det här fallet, använd 5 pl ligas, 40 pl av 5 ligeringsbuffert och 155 pl högrent vatten för att säkerställa en korrekt nedsänkning och blandning av 5-10 kroppsväggar.
- Amplifiering
- Tvätta kroppen väggar med tvättbuffert A två gånger för 2 minuter vardera.
- Inkubera med Amplification-lösning (1:80 utspädning av polymeras i amplifieringsbuffert) under 2 h vid 37 ° C. I det här fallet, använd 2,5 pl polymeras, 40 pl av 5 Amplification buffert och 157,5 pl högrent vatten för att säkerställa en korrekt nedsänkning och blandning av 5-10 kroppsväggar.
- Förberedelse för Imaging
- Tvätta de kropps väggar med tvättbuffert B två gånger under 10 min vardera.
- Tvätta med 0.01x Wash Buffer B en gång i 1 min.
- Jämvikta i några droppar av lösning för montering av åtminstone 30 min före montering, eller förvara över natten vid 4 ° C.
- Med fin pincett, försiktigt överföra kroppsväggarna på en plattform slide wed sina nagelband nedåt. Placera kroppen väggarna i rader och i samma riktning inom en droppe eller två av monterings. Placera en 22 mm x 40 mm täck över beredningen noga med att inte skapa luftbubblor, sedan försegla bilden med genomskinligt nagellack.
- Förvara objektglasen i mörker vid -20 ° C tills redo för konfokal avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vildtyp tredje stadiet larver NMJs är Dlg övervägande finns på postsynaptiska membran av typ I glutamaterga boutons, med Dlg Immunoreaktivitet nivåer är mer uttalad i typ IB boutons än typ Är boutons (Figur 3A) 4. Hts är närvarande under hela muskeln utan koncentrerar vid postsynaptiska regionen med Hts immunreaktivitet nivåer som förekommer lika i både typ I boutons, och finns även presynaptiskt (Figur 3A ') 8,17. Observera att fördelning av DLG och Hts lappar till stor del på den postsynaptiska regionen (Figur 3A '') 8.
För att avgöra om Dlg och Hts existerar i ett komplex på NMJ, PLA mellan de två proteinerna utfördes på larvkroppen väggen muskel preparat. För denna analys en mus-anti-Dlg antikropp som detekterar den andra PDZ-domänen vid N-terminalen och en kanin-anti-HtsM antikroppsom detekterar den MARCKS-homologidomänen vid C-terminalen användes 15,16. I vildtypen, var PLA signal mellan Dlg och Hts observeras specifikt på NMJ (Figur 3C-C ''). Signalen mestadels lokaliserad i omkretsled till det presynaptiska membranet hos typ I boutons, vilket demarked av HRP, vilket således indikerar att Dlg och Hts finns i omedelbar närhet till varandra och sannolikt bilda ett komplex på den postsynaptiska regionen. Resultatet bedömdes vara specifik som vår negativa kontroll, som omfattar HTS 01103 muterade NMJs som saknar Hts immunreaktivitet (Figur 3B-B ''), visade ingen observerbar PLA-signal (Figur 3D) 8,17,18. Dessutom utförde PLA utan tillsats av kanin-anti-HtsM antikropp producerad någon signal (data ej visade). Hög förstoring utsikt över boutons avslöjade att Dlg och Hts immunreaktivitet grovt överlappade på postsynaptiska regionen (figur 3E), Medan PLA mellan de båda proteinerna gav diskret puncta indikerar att endast en delmängd av de totala Dlg och Hts proteinerna är i komplex (Figur 3F).
För att ytterligare testa tillförlitligheten av PLA som ett verktyg för att studera larver NMJ, utvärderade vi även växelverkan mellan serin / treonin p21-aktiverat kinas, Pak, och andra synaptiska proteiner 19. Tidigare samarbete immunoprecipitation experiment har visat att Pak är en medlem av Klotter komplex, varav Dlg är medlem 20. I vildtyp NMJs, lokaliserar Pak till postsynaptiska densitet (Figur 4A, C), där det krävs för Dlg lokalisering 15,21. De immunoreaktiva distributioner av Pak och Dlg lappar vid postsynaptiska regionen (Figur 4A ''), och PLA mellan de två proteinerna resulterade i en positiv signal specifikt på NMJ (Figur 4B). Dessa resultat indikerar att de två proteinerna är i c förlorar närhet till varandra och är troligen bildar ett komplex i denna region. En annan synaptiska protein vi testade för Pak komplex bindning var Vinglösa (Wg), Drosophila Wnt ligand, som spelar många roller på NMJ 22. I vildtypen är Wg berikad vid presynaptiska och postsynaptiska sidor av typ I boutons, men är också närvarande som puncta hela muskeln cytoplasman (Figur 4C ') 23. Intressant, även om de immunoreaktiva distributioner av Pak och Wg delvis överlappade vid den postsynaptiska regionen (Figur 4C ''), PLA mellan de två proteinerna producerade ingen observerbar signal (Figur 4D). Därför Pak och Wg inte är i närheten av varandra på NMJ. Detta resultat visar att inte alla proteiner som visar överlapp immunoreaktiviteter genom traditionella samlokalisering experiment kommer att generera en PLA-signal, och fungerar som en extra negativ kontroll.
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1: Skiss av Proximity Ligation Assay. (A) Primära antikroppar binder till de två proteiner av intresse med hjälp av vanliga immunhistokemiska förfaranden. (B) De primära antikropparna detekteras sedan med ett par artspecifika sekundära antikroppar, kallas PLA sonder, som konjugerade till oligonukleotider. (C) Om de två proteinerna är i nära anslutning till varandra, kan avståndet mellan de bifogade PLA sonder överbryggas genom hybridisering av två ytterligare anslutnings oligonukleotider. (D) I denna konformation, kan oligonukleotider anslutnings bilda en sluten cirkulär DNA-molekyl vid in situ-ligering . (E) Den cirkulära DNA-molekylen tjänar som en mall för in situ rullande cirkel-amplifiering, som laddas genom att en av de oligonucleotides konjugerade till PLA prober. (F) Sekvenser inom den amplifierade DNA-produkt detekteras sedan med fluorescensmärkta, komplementära oligonukleotidsonder. Notera att siffran byggde på et al. Weibrecht 24. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 2: Beredning av tredje stadiet larver kroppsväggar. (AF) Schemat ritningar som representerar en kroppsvägg dissektion. (A) Placera en enda larv på en sylgard skiva med ryggsidan uppåt så att de två luftrör trakter är synliga. (B) Pin larven ner vid de främre och bakre ändar med minutien stift, som sträcker larven ut på längden i processen. (C) (D) Rulla larvkroppen öppet och stift hörnen ner, stretching kroppen väggen både horisontellt och vertikalt i processen att bilda en jämnt spända rektangel. (E) Ren ut eventuella återstående inre organ. (F) som visas är exempel på de olika sätten att minska hörnet av kroppens väggar för att skilja olika genotyper. (G) Vy över en sträckt kroppsvägg förberedelse när den är klar. Bilden togs med en digital kamera monterad på en dissekera mikroskop. Skala bar i Panel F representerar 1 mm. Notera att siffran var baserad på Ramachandran och Budnik 2010 12. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 3: Dlg och Hts existerar i ett komplex på den postsynaptiska regionen av larv NMJs (AB '') Överföring av Dlg (röd) och Hts (grön) i vildtyp och hts muterade NMJs (AA. '') I vilt. -typ NMJs är Dlg övervägande finns på postsynaptiska membran av typ I boutons, med Dlg nivåer är mer uttalad i typ Ib än Är boutons. Hts är närvarande under hela muskeln utan även koncentrat runt postsynaptiska regionen, med Hts nivåer är lika i både typ I boutons. Fördelning av DLG och Hts lappar vid postsynaptiska regionen. (BB '') NMJs mutant för HTS saknar Hts immunreaktivitet. Observera att hts 01103 mutationseffekterna NMJ förgrening 8. (CD '') PLA mellan Dlg och Hts (röd) Utförs på vildtyp och hts muterade NMJs. HRP används för att markera det neuronala membran (grön). Visas är höga förstoring vyer av ett fåtal boutons. (CC '') I vildtyp, är PLA signalen observeras specifikt på NMJ. Signalen mestadels lokaliserad i omkretsled till det presynaptiska membranet hos typ I boutons, vilket indikerar att Dlg och Hts finns i omedelbar närhet till varandra och existera i ett komplex vid den postsynaptiska regionen. (D) NMJs mutanten för HTS visade ingen observerbar PLA signalen. (EF) Visade är Hög förstoring vyer av enstaka boutons. (E) Hts och Dlg immunoreaktivitet grovt överlappning vid postsynaptiska regionen. (F) PLA mellan Dlg och Hts resultat i distinkta puncta indikerar att endast en deluppsättning av proteinerna är i en komplex . Skalstreck i Panel B '' representerar 40 | im (ab ''); skala bar i panel D '' representerar 10 mikrometer (CD ''); scale bar i Panel F representerar 5 um (EF). Alla NMJs visas är från muskler 6/7 i buken segmentet 4. Bilder togs som fusione staplar med en Nikon A1R laserskanning konfokalmikroskop med NIS-Elements, och bearbetas med Adobe Photoshop. Klicka här för att se en större version av figur.
Figur 4: Pak finns i ett komplex med Dlg, men inte Wg, vid postsynaptiska regionen av larv NMJs (AD) Visas är höga förstoring vyer av några boutons (AA '') Överföring av Pak (grön) och Dlg (.. rött) i vildtyp NMJs. Pak lokaliserar till den postsynaptiska densitet. Observera att immunreaktiva distributioner av Pak och Dlg lappar vid postsynaptiska regionen. (B) PLA bÅren Pak och Dlg (röd) utförs på vildtyp NMJs. PLA-signal observeras speciellt på NMJ, vilket tyder på att de två proteinerna är i nära anslutning till varandra i denna region. (CC '') Överföring av Pak (grön) och WG (röd) i vildtyp NMJs. Wg är berikad på både de presynaptiska och postsynaptiska sidor av NMJ, men är också närvarande som puncta hela muskeln. Observera att immunreaktiva fördelningen av Pak också observeras att delvis överlappa med Wg vid postsynaptiska regionen. (D) PLA mellan Pak och WG (röd) utförs på vildtyp NMJs. Ingen specifik PLA signalen observeras, vilket indikerar att de två proteinerna inte är i närheten av varandra på NMJ trots deras överlapp distributioner. Skala bar i Panel D representerar 5 um (AD). Alla NMJs innerverar muskler 6/7 i buken segmentet 4. Bilder togs som fusione staplar med en Nikon A1R laserskanning konfokalmikroskop med NIS-Elements, och probearbetas med Adobe Photoshop. Klicka här för att se en större version av bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport visar hur PLA kan tillämpas på Drosophila larv NMJ. Analysen utförs på larvkroppen vägg muskelpreparat i syfte att upptäcka endogena protein-proteininteraktioner närvarande vid NMJ. Med denna teknik är Dlg och Hts visat sig vara i nära anslutning till varandra, och därmed existera i en komplex, speciellt på den postsynaptiska regionen 27. Till stöd för detta resultat, har en tidigare studie bevisat att de tillsammans med följande uppgifter: 1) de immunreaktiva distributioner av DLG och Hts lappar vid postsynaptiska regionen av larv NMJs, 2) Dlg och Hts bildar ett komplex baserat på samarbete Immunutfällningsexperiment involverar hela den vuxna flyga lysat, och 3) Dlg och Hts samverkar både epitel och synaptiska korsningar 8. PLA signalen vid den postsynaptiska regionen observerades också mellan Dlg och Pak, en interaktion som tidigare identifierats i andra studier, vilket ger ytterligare CredeIOU av att använda denna analys på NMJ 15,20,21. Intressant PLA mellan Pak och Wg gav ingen observerbar signal, trots att deras immunoreaktiva fördellappade på NMJ. Detta resultat visar att inte alla proteiner som visar överlappande immunoreaktiva distributioner kommer att generera en PLA-signal, därför indikerar att PLA ger en högre upplösning i att upptäcka protein-proteininteraktioner än traditionella samarbetslokaliseringsstudier.
Flera ändringar gjordes till den ursprungliga PLA-protokollet för att optimera analysen för larv NMJ (data visas ej) 9,25. Först bestämdes det att 1% BSA är en bättre blockerande medel för kroppsväggarna istället för den medföljande blockeringslösning. För det andra, för att producera en stark signal-till-brusförhållande, ordentlig nedsänkning och blandning av kroppsväggarna i reaktionslösningarna är kritisk. Minst 200 l för 09:55 kroppsväggar i en 0,65 ml mikrocentrifugrör ansågs suitable när inkubering med PLA sonder, ligas eller polymeras, även om volymerna kan ökas i motsvarande vid bearbetning fler kroppsväggar. Signalstyrkan var också förbättras genom ökning av reaktionstiden med 30 minuter över de rekommenderade tider. För det tredje var ett serieutspädningstest av PLA prober utfördes för att optimera balansen mellan reagens bevarande och signalstyrka. För experimenten utförs i denna rapport, upp till en 1:25 späd - från den rekommenderade 1: 5 utspädning - kan ändå ge en rimlig signal-till-brus-förhållande. Observera att optimering av ligeringsprodukterna och amplifieringsreaktionerna har inte utförts. Slutligen, som PLA kan vara känsliga för små förändringar, är det starkt rekommenderat att de olika genotyper av ett enda experiment placeras i ett enda rör, så att kontrollerna och experiment behandlas lika under analysen. Genotyper kan särskiljas genom att skära hörnen på kroppsväggarna på olika sätt.
Several metoder används för att detektera Drosophila protein-proteininteraktioner, inklusive jäst två-hybrid-screening, sam-immunutfällning och FRET. Men hur dessa metoder jämföra mot PLA och dess förmåga att visualisera protein-proteininteraktioner in situ? Jäst två-hybrid kan detektera direkt bindning mellan Drosophila proteiner uttryckta i jäst, och den har använts i hög genomströmning genomvida skärmar. Även om många av de identifierade interaktioner är biologiskt relevant, producerar analysen ofta falskt positiva. Dessutom kan falska negativa inträffa av flera skäl: proteinerna är fuserade till transkriptionsfaktordomäner som kan interferera med bindning, många interaktioner kräver posttranslationella modifieringar som inte förekommer i jäst, och kärnan (där analysen sker) kan inte vara en lämplig miljö för vissa interaktioner att korrekt bilda. Sådana frågor är inte stött med PLA som det handlar om endogena proteiner i sitt eget Envirjön. En metod som kan användas för att upptäcka interaktioner mellan endogena proteiner samar immunoprecipitation. Experiment med Drosophila lysat kan avslöja vävnaden och stadium i livscykeln där en interaktion sker. Men eftersom lysat bildning innebär att störa cellerna för att extrahera proteinerna, cellerna i vävnad i vilken interaktionen sker i, liksom dess subcellulära lokalisering, inte kan bedömas - till skillnad från i PLA. Vidare detekterar samtidig immunutfällning proteinkomplex bindande och kan inte skilja på vilka proteiner inom komplexet är i omedelbar närhet till varandra. Det finns metoder såsom FRET tillgängliga för Drosophilists som tillåter visualisering av protein-proteininteraktioner inom cellen. Men FRET involverar överuttryck av transgena proteiner smält till fluorescerande taggar och kanske därför inte speglar endogena protein beteende som i PLA.
Trots sina fördelar, det finns några limitatjoner vid användning PLA. En sådan begränsning är tillgången av primära antikroppar mot proteiner av intresse som är gjorda i olika arter. Detta problem kan lätt kringgås med hjälp av taggade transgena proteiner, även om de kanske inte är riktigt representativ för den endogena interaktionen. En annan fråga är att PLA kan ge falska negativa, till exempel när de två primära antikroppar steriskt hindrar varandra eller när epitop för en av de primära antikroppar involverar protein-proteininteraktion site. Även om PLA upptäcker proteiner som är i nära anslutning till varandra, det skiljer inte mellan direkta och indirekta protein-proteininteraktioner, till skillnad från i pull-down-analyser och jäst två-hybrid screening. Dessutom PLA mellan endogena proteiner inte kommer att identifiera vilka domäner är ansvariga för interaktionen. Således kommer andra protein-proteininteraktioner analyser fortfarande att behövas för att helt karaktärisera interaktionen molecularly.
Forskare har börjat använda superupplösning mikroskopi att kart den rumsliga arkitektur Drosophila larv NMJ, med en upplösning på tiotals nanometer uppnås 26. PLA, med sin jämförbara molekylär upplösning, bör ge en låg kostnad, tekniskt enkel komplement till dessa studier som kommer att hjälpa till att bygga upp en detaljerad vy av organisationen av de många proteiner på NMJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Vi tackar Bloomington Drosophila Stock Center för att ge flugan bestånd. Vi tackar också utvecklingsstudier Hybridoma Bank och Dr Lynn Cooley (Yale University) för att tillhandahålla antikroppar. Ett särskilt tack går till AhHyun Yoo för hennes hjälp på manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (Krieger), William och Ada Isabelle Steel Fund (Krieger), och den kanadensiska Institutes of Health Research (Harden).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
- Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
- Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
- Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
- Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
- Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
- Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
- Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D.
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
- Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
- Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
- Bokoch, G. M.
- Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
- Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
- Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
- Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).
