Summary
Denne protokollen demonstrerer hvordan Proximity Ligation analysen kan brukes til å oppdage in situ protein-protein interaksjoner på Drosophila larvenevromuskulære krysset. Med denne teknikken, er plater store og Hu-li tai Shao vist seg å danne et kompleks på den postsynaptiske region, en forening tidligere identifisert gjennom ko-immunoutfelling.
Introduction
Drosophila plater store (DLG) er en konservert medlem av membran-assosiert guanylat-kinase familien av stillaser proteiner som bidrar til å organisere montering av store proteinkomplekser på bestemte steder av plasmamembranen. Opprinnelig identifisert som en tumor suppressor protein, DLG tjener som en viktig determinant for epitelisk apicobasal polaritet 1,2,3. DLG fungerer også som et stort stillas modul ved nevromuskulære krysset (NMJ) av glutamaterge motoriske nerveceller i løpet av larveutvikling fire. DLG spiller ulike roller på larve NMJ, og dens pleiotropism avhengig av sin evne til å assosiere med flere proteiner 5,6. Et slikt protein er Hu-li tai Shao (HTS), en homolog til de pattedyr adducins som i hovedsak har vært beskrevet i forhold til sine roller i regulering av aktin-spektrin cytoskjelettet 7. Det har tidligere blitt vist at DLG og Hts kan danne et kompleks med hverandre basert på in vitro 8. En brist av disse resultatene, er imidlertid at de ikke indikere hvor dette komplekse former. Med bruk av immunhistokjemi, blir fordelingen av DLG og Hts observert å overlappe på den postsynaptiske membran av larve NMJs, men de er i et kompleks i denne regionen 8? Som nylig vist og beskrevet nærmere her, er Proximity Ligation analysen (PLA) som brukes til å lete etter en in situ sammenheng mellom DLG og Hts spesielt på larve NMJ 27.
PLA er en relativt ny teknikk som brukes for det meste i celler og vev kultur som kan oppdage protein-protein interaksjoner in situ 9. I denne analyse, er primære antistoffer mot de to proteiner av interesse påvises med et par av artsspesifikk sekundære antistoffer, betegnet PLA prober, som er konjugert til oligonukleotider (figur 1 A, B). Hvis de to proteins er i umiddelbar nærhet til hverandre (dvs. i løpet av få titalls nanometer), idet avstanden mellom de vedlagte PLA prober kan slås bro over ved hybridisering av to ytterligere forbindelses oligonukleotider (figur 1C). I denne konformasjon, de frie ender av kontakt oligonukleotider er nær nok til å gjøre kontakt med hverandre, og et lukket, sirkulært DNA-molekyl kan dannes ved in situ-ligering (figur 1D). Den sirkulære DNA-molekyl som virker som et templat for in situ rullende sirkel forsterkning, som er fylt av en av de oligonukleotider som er konjugert til PLA-prober (figur 1E). Sekvenser i de resulterende amplifiserte, concatemeric DNA-produkt kan deretter bli visualisert med fluoresceinmerkede, komplementære oligonukleotid-prober (figur 1F). Siden det amplifiserte DNA forblir festet til en av PLA-sonder, den subcellulære lokalisering av protein-protein interaksjon withina vevet lett kan fastslås.
Flere metoder blir ofte brukt for å påvise protein-protein interaksjoner inkludert in vitro teknikker som co-immunoprecipitation, pull-down-analyser og gjær to-hybrid screening, og in vivo teknikker som Förster Resonance Energy Transfer (FRET) og bimolecular Fluorescens Komplemente ( BiFC). En fallgruve av in vitro teknikker er at de ikke identifisere hvor samspillet er endogent forekommende, mens den tidligere nevnte in vivo teknikker involvere kunstig uttrykk for fusjonsproteiner som viser ikke nødvendigvis den opprinnelige atferden til sine endogene kolleger. En stor fordel med PLA er at den er i stand til å bestemme i en vev av subcellulære lokalisering av endogene protein interactors som er i umiddelbar nærhet til hverandre, og sannsynligvis danner et kompleks, med graden av nærhet nødvendig for å generere et signal som kan sammenlignes med FRET og BiFC. PLA kan detektere interaksjoner med høy spesifisitet og sensitivitet som følge av koplingen av antistoffgjenkjenning og DNA-amplifisering. Således kan analysen generere diskrete, lyse signaler i form av puncta som viser den nøyaktige plasseringen av interaksjonen. I tillegg kan knapt synlige antigener påvises. Til slutt, er PLA en relativt enkel teknikk for å utføre, og det tar ikke noe lenger tid enn en standard immunhistokjemisk fremgangsmåte for å fullføre. Derfor gir PLA en teknisk fordel over andre protein-protein interaksjons analyser som ofte plaget med lange forberedelser ganger og omfattende feilsøking.
Denne protokollen viser hvordan PLA kan anvendes til Drosophila larve NMJ for det formål å detektere endogene protein-proteininteraksjoner in situ. Her er PLA utført på larvekroppen veggmuskel preparater der DLG og Hts er vist å faktisk eksistere i et kompleks på den postsynaptiske regionen NMJs. PLA har ikke tidligere blitt brukt til å studere larve NMJ, og det er i dag bare en håndfull av publiserte artikler som har brukt denne analysen i Drosophila vev. Det er å håpe at ytterligere eksponering av PLA til Drosophila samfunnet vil resultere i sin økt bruk som et ekstra verktøy for å utfylle andre, mer vanlig brukte protein-protein interaksjons analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Body Wall Forberedelse
MERK: Utarbeidelse av tredje stadium larve kroppens vegger (for studiet av NMJs som innerverer kroppen veggen muskler) ble utført som tidligere beskrevet i Brent et al 10, eller Ramachandran og Budnik 11,12, men med noen endringer..
- Disseksjon
- Heve flue aksjer og kors ved 25 ° C i fem til seks dager ved hjelp av standard prosedyrer 13.
- Plukk kryp tredje stadium larver fra ampuller eller flasker med lekkert tang.
- Vask larvene i en liten petriskål inneholdende fosfatbuffer saltvann (PBS) for å fjerne alle matrester.
- Plasser ett enkelt larve på en Sylgard plate og dyppe den i et par dråper iskald PBS. Ved hjelp av iskald PBS vil hjelpe svimeslå larven som gjør det lettere å manipulere. Gjennom disseksjon, sørge for at preparatet er alltid nedsenket i PBS for å hindre at den tørker.
- Plasser laRVA med ryggsiden vendt opp, slik at de to luftrørs traktene er synlige under et disseksjonsmikroskop (figur 2A). Ved hjelp av pinsett til å gripe en minutien pin, pin larven ned på bakre enden nær spiracles (figur 2B). Med en annen pinne, pierce gjennom hårstråene på fremre enden nær munningen kroker. Forsiktig strekke larven ut på langs, deretter pin det ned (figur 2B).
- Ved hjelp mikrodisseksjon saks, klype den bakre enden nær pin for å lage en liten åpning. Snittet bør være overfladisk nok å bare passere gjennom hårstråene.
- Å plassere spissen av den nedre blad av saksen i snittet, skåret langs hele lengden av dorsal midtlinjen mellom de to luftrørs traktene (figur 2C). Peke saksebladene litt oppover når du skjærer for å unngå å skade ventral kroppen veggen muskler.
- Lag en liten horisontal innsnitt litt anterior til innleggeteriorly plassert pin (Figur 2C). Lag en annen lignende snitt litt posterior til anteriorly plassert pin (Figur 2C). Snittene skal bare passere gjennom hårstråene.
MERK: De tre snittene fra trinn 1.1.7 og 1.1.8 kombinert skal ligne en "
"Når fullført, det vil si, en venstre- og høyre klaff på ryggsiden av larve kroppen skal bli produsert. - Rengjør nøye ut de indre organer med pinsett. Tilsetning av noen få dråper av kraftige PBS vil bidra til å fortrenge organene ut av larve legemet, og dermed gjør det lettere å fjerne dem. Unngå poking larvekroppen som det vil forårsake skade på kroppen veggen muskler.
- Unfurl larvekroppen åpen og pin hjørnene ned (figur 2D). Ved pinning, strekke kroppsveggen både horisontalt og vertikalt for å danne en jevnt pent rektangel (see Figur 2G for formen), tar seg ikke å rive kroppen veggen muskler i prosessen.
- Ferdig med å fjerne eventuelle gjenværende indre organer (Figur 2E).
- Fiksering og Permeabilization
- Fordype de festede kroppen vegger i flere dråper Bouins Solution. Inkuber i 15 min på is. Alternativt kan du bruke 4% Paraformaldehyde (PFA) som et alternativ fiksativ; Inkuber i 30 min.
- Skyll tre ganger med fosfatbuffer saltvann med Triton (PBT).
- Ved hjelp av fine tang, nøye fjerne pinnene og overføre kroppen vegger av sine hjørner i en silikonisert 0.65 ml mikro tube.
- Lagre kroppen vegger i PBT ved 4 ° C til de er klare for PLA. For optimale resultater, begynn farging kroppen vegger innen en dag eller to av disseksjon.
MERK: For å spare på reagenser og sørge for at alle kroppens vegger behandles likt under analysen, kan forskjellige genotyper plasseres i en enkeltrør. Genotyper kan skilles ved å kutte hjørnene av kroppen vegger annerledes (se Figur 2F for eksempler).
"Når fullført, det vil si, en venstre- og høyre klaff på ryggsiden av larve kroppen skal bli produsert. 2. Immunhistokjemi
MERK: Farging av tredje stadium larve kroppens vegger ble utført som tidligere beskrevet i Brent et al 14 og Ramachandran og Budnik 11, men med noen endringer 11,14..
MERK: Utfør alle trinn ved romtemperatur og med forsiktig omrøring, med mindre annet er angitt.
- Blokkering
- Vask de kroppsveggene med PBT tre ganger i 10 minutter hver.
- Blokk med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time.
- Immunofarging
- Inkuber kropps vegger med mus og kanin primære antistoffer mot de to proteiner av interesse (fortynnet i 1% BSA) i 2 timer ved romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C. I dette tilfellet bruker 01:10 mus anti-DLG og 1: 250 kanin etNTI-HtsM 15,16. Antistoffer mot markører som ikke er laget i mus eller kanin kan også være inkludert - bruk for eksempel 1: 200 geit anti-HRP å avgrense neuronmembraner.
- Vask med PBT tre ganger i 10 minutter hver.
- Inkuber med fluoroforen-konjugerte sekundære antistoffer for å detektere markørene (fortynnet i 1% BSA) i 2 timer ved romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C. Som PLA signalet senere visualisert med en rød fluorofor, må en annen fluoroforen brukes for å påvise markøren - bruk for eksempel 1: 200 FITC-konjugert anti-geite å detektere geit anti-HRP-antistoff. På grunn av bruken av lys-følsomme reagenser, holde rørene i mørket fra dette punkt og fremover.
MERK: kit som brukes åpner for PLA som skal utføres mellom primære antistoffer oppvokst i mus og kanin, med signalet visualisert på den røde kanalen under konfokalmikroskopi. Dersom det er ønskelig, andre kits er tilgjengelig som tillater analysen gjøres med primary antistoffer oppvokst i andre arter, og signalet visualisert på andre kanaler.
3. Nærhet hemorroider analysen
MERK: Utfør alle trinn ved romtemperatur og med forsiktig omrøring, med mindre annet er angitt.
- PLA prober
- Vask de kroppsveggene med PBT tre ganger i 10 minutter hver.
- Inkuber med PLA sonder (1: 5 fortynning hver i 1% BSA) i 2 timer ved 37 ° C. I dette tilfellet kan 40 ul av PLA probe anti-mus-minus, 40 ul av PLA probe anti-kanin-PLUS og 120 ul av 1% BSA for å sikre riktig nedsenking og blanding av 5-10 kroppsveggene. Opp til en 1:25 fortynning av PLA-prober kan likevel resultere i en tilfredsstillende signal-til-støy-forhold (dvs. for dette eksperimentet).
- Ligation
- Vask kroppen vegger med vaskebuffer A to ganger for 5 minutter hver.
- Inkuber med Ligering løsning (1:40 fortynning av Ligase i ligeringsbuffer) i 1 time ent 37 ° C. I dette tilfellet kan 5 pl ligase 40 ul av 5 ligeringsbuffer og 155 pl vann av høy renhet for å sikre riktig nedsenking og blanding av 5-10 kroppsveggene.
- Forsterkning
- Vask kroppen vegger med vaskebuffer A to ganger for to minutter hver.
- Inkuber med Amplification-løsning (1:80 fortynning av Polymerase i Amplification buffer) i 2 timer ved 37 ° C. I dette tilfelle benytte 2,5 mL av polymerase, 40 ul av 5 Amplification buffer og 157,5 ul av vann av høy renhet for å sikre riktig nedsenking og blanding av 5-10 kroppsveggene.
- Forberedelse for Imaging
- Vask kroppen vegger med Wash Buffer B to ganger i 10 minutter hver.
- Vask med 0.01x Wash Buffer B en gang i 1 min.
- Likevekt i noen dråper monteringsløsning i minst 30 min før montering, eller lagre natten ved 4 ° C.
- Ved hjelp av fine tang, nøye overføre kroppen veggene på en plattform lysbilde with sine neglebåndene ned. Plasser kroppen veggene i rader og i samme retning innenfor en dråpe eller to av mountant. Plasser en 22 mm x 40 mm dekkglass over forberedelse tar seg ikke å generere luftbobler, og deretter forsegle lysbilde med klar neglelakk.
- Lagre lysbildene i mørke ved -20 ° C til de er klare for konfokal bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I villtype tredje stadium larve NMJs, er DLG hovedsakelig funnet på den postsynaptiske membran av type I glutamaterge boutons, med DLG immunoreaktivitets nivåer være mer uttalt hos type IB boutons enn type Er boutons (figur 3A) 4. Hts er til stede i hele muskelen, men konsentrerer seg på den postsynaptiske region med Hts immunoreaktivitets nivåer vises lik i både type I boutons, og er også funnet presynaptisk (figur 3A ') 8,17. Legg merke til at fordelingen av DLG og Hts i stor grad overlapper hverandre på den postsynaptiske regionen (figur 3A '') 8.
Å avgjøre om DLG og Hts eksistere i et kompleks på NMJ, PLA mellom de to proteinene ble utført på larvekroppsveggen muskel forberedelser. For denne analyse, et mus anti-DLG-antistoff som gjenkjenner den andre PDZ domenet ved N-terminus, og et kanin-anti-antistoff HtsMsom detekterer MARCKS-homologi domene i C-enden ble det brukt 15,16. I vill-type, ble PLA signal mellom DLG og Hts observert spesielt på NMJ (Figur 3C-C ''). Signalet hovedsakelig lokalisert i omkretsretningen til den presynaptiske membran av type I boutons, som ble markerte av HRP, og indikerer således at DLG og Hts er i umiddelbar nærhet til hverandre, og sannsynligvis danne et kompleks på den postsynaptiske regionen. Resultatet ble bestemt å være spesifikk da vår negativ kontroll, som involverer HTS 01.103 muterte NMJs som mangler Hts immunoreaktivitet ('' Fig-B 3B), viste ingen observerbar PLA-signalet (figur 3D) 8,17,18. I tillegg utføres PLA uten tilsetning av kanin-anti-HtsM antistoff produsert noe signal (data ikke vist). Høy forstørrelse utsikt over boutons avdekket at DLG og Hts immunoreaktivitets grovt overlappes på den postsynaptiske regionen (Figur 3E), Mens PLA mellom de to proteinene resulterte i diskret puncta indikerer at bare en delmengde av de totale DLG og Hts proteiner er i kompleks (figur 3F).
For å teste ytterligere påliteligheten av PLA som et verktøy for å studere larve NMJ, vi også vurdert interaksjoner mellom serin / treonin p21-aktivert kinase, Pak, og andre synaptiske proteiner 19. Tidligere co-immunoutfellingsstudier forsøk har vist at Pak er et medlem av Scribble kompleks, hvorav DLG er også medlem 20. I villtype NMJs, lokaliserer Pak til den postsynaptiske tetthet (figur 4A, C), hvor det er nødvendig for DLG lokalisering 15,21. De immunoreaktive fordelinger av Pak og DLG overlapper hverandre på den postsynaptiske region (Figur 4A ''), og PLA mellom de to proteiner resulterte i et positivt signal spesifikt på NMJ (figur 4B). Disse resultatene indikerer at de to proteinene er i c mister nærhet til hverandre og er sannsynlig å danne et kompleks i denne regionen. En annen synaptisk protein vi testet for Pak kompleks binding var Vingeløse (Wg), Drosophila Wnt ligand, som spiller en rekke roller på NMJ 22. I vill-type, er Wg anriket på de presynaptiske og postsynaptiske sider av type I BOUTONS, men er også til stede som puncta hele muskelen cytoplasma (figur 4C ') 23. Interessant nok, skjønt de immunreaktive fordelinger av Pak og Wg delvis overlappet på den postsynaptiske region (Figur 4C ''), PLA mellom de to proteiner fremstilt ingen observerbar signal (figur 4D). Derfor Pak og Wg ikke er i umiddelbar nærhet til hverandre på NMJ. Dette resultatet viser at ikke alle proteiner som viser overlapp immunoreaktiviteter gjennom tradisjonelle co-lokalisering eksperimenter vil generere en PLA-signal, og tjener som en ytterligere negativ kontroll.
ent "fo: keep-together.within-side =" always ">
Figur 1: Skisse av Proximity Ligation analysen. (A) Primære antistoffer bindes til de to proteiner av interesse ved å bruke standard immunhistokjemiske prosedyrer. (B) De primære antistoff blir så påvist med et par av artsspesifikk sekundære antistoffer, betegnet PLA prober, som er konjugert til oligonukleotider. (C) Ved de to proteinene er i umiddelbar nærhet av hverandre, kan avstanden mellom de vedlagte PLA prober slås bro over ved hybridisering av to ytterligere forbindelses oligonukleotider. (D) I dette konformasjon, kan koblings oligonukleotider danne et lukket, sirkulært DNA-molekyl ved ligering in situ . (E) Den sirkulære DNA-molekyl som virker som et templat for in situ rullende sirkel forsterkning, som er fylt av en av de oligonucleotides konjugert til PLA-prober. (F) Sekvenser innenfor det amplifiserte DNA-produkt blir deretter påvist med fluoresceinmerkede, komplementære oligonukleotid-prober. Legg merke til at tallet var basert på Weibrecht et al. 24. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 2: Utarbeidelse av tredje stadium larve kroppens vegger. (AF) skjemategninger som representerer en kroppsveggen disseksjon. (A) Plasser en enkelt larve på en Sylgard plate med sin ryggsiden opp slik at de to tracheal traktene er synlige. (B) Pin larven ned på fremre og bakre ender med minutien pins, strekker larven ut på langs i prosessen. (C) (D) folde den larvekroppen åpen og pin hjørnene ned, strekke kroppen veggen både horisontalt og vertikalt i prosessen for å danne et jevnt strammet rektangel. (E) Clean ut eventuelle gjenværende indre organer. (F) Vist er eksempler på forskjellige måter å kutte hjørnet av kroppen vegger for å skille ulike genotyper. (G) Utsikt over en strukket kroppen vegg forberedelse når fullført. Bildet er tatt med et digitalt kamera montert på en disseksjonsmikroskop. Skala bar i Panel F representerer en mm. Legg merke til at tallet var basert på Ramachandran og Budnik 2010 12. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 3: DLG og Hts foreligger i et kompleks på den postsynaptiske region av larver NMJs (AB '') Fordelingen av DLG (rød) og Hts (grønt) i villtype og mutant hts NMJs (AA. '') I naturen. -type NMJs, er DLG hovedsakelig funnet på den postsynaptiske membran av type I boutons, med DLG nivåene blir mer uttalt i type Ib enn Er boutons. HTS er til stede i hele muskelen, men også konsentrerer seg rundt den postsynaptiske regionen, med Hts nivåer å være lik i både type I boutons. Fordelinger av DLG og Hts lapper på den postsynaptiske regionen. (BB '') NMJs mutant for hts mangler Hts immunoreaktivitets. Merk at hts 01103 mutasjons effekter NMJ forgrening 8. (CD '') PLA mellom DLG og Hts (rød) Utført på villtype og hts mutant NMJs. HRP blir brukt til å markere neuronal membran (grønn). Vist er høye utsikt over et par boutons. (CC '') I vill-type forstørrelse, er PLA signal observert spesielt på NMJ. Signalet er hovedsakelig lokalisert i omkretsretningen til den presynaptiske membran av type I boutons, noe som indikerer at DLG og Hts er i umiddelbar nærhet til hverandre og foreligger i et kompleks på den postsynaptiske regionen. (D) NMJs mutant for HTS viste ingen observerbar PLA signal. (EF) Vist er høye utsikt over enkelt boutons forstørrelse. (E) Hts og DLG immunoreaktivitets grovt overlapping på den postsynaptiske regionen. (F) PLA mellom DLG og Hts resulterer i tydelig puncta indikerer at bare et delsett av proteiner er i et komplekst . Skala bar i Panel B '' representerer 40 mikrometer (AB ''); skala bar i Panel D '' representerer 10 mikrometer (CD ''); scale bar i Panel F representerer fem mikrometer (EF). Alle NMJs vises er fra muskler 6/7 i mage segment 4. Bilder ble tatt som fusjonert stabler ved hjelp av et Nikon A1R laserskanning konfokal mikroskop med NIS-Elements programvare, og behandlet med Adobe Photoshop. Klikk her for å se en større versjon av figur.
Figur 4: Pak eksisterer i et kompleks med DLG, men ikke Wg, på den postsynaptiske regionen larve NMJs (AD) Vist er høye utsikt over noen boutons forstørrelse (AA '') Utdeling av Pak (grønn) og DLG (.. rød) i villtype NMJs. Pak lokaliserer til den postsynaptiske tetthet. Merk at immunoreaktive distribusjoner av Pak og DLG lapper på den postsynaptiske regionen. (B) PLA between Pak og DLG (rød) utført på villtype NMJs. PLA-signal observeres spesielt ved NMJ, noe som indikerer at de to proteinene er i umiddelbar nærhet til hverandre i dette område. (CC '') Fordelingen av Pak (grønn) og Wg (rød) i villtype NMJs. Wg er anriket på begge de presynaptiske og postsynaptiske sider av NMJ, men er også til stede som puncta hele muskelen. Merk at immunoreaktiv distribusjon av Pak er også observert å delvis overlapper med Wg på den postsynaptiske regionen. (D) PLA mellom Pak og Wg (rød) utført på villtype NMJs. Ingen bestemt PLA signalet observert, noe som indikerer at de to proteinene ikke er i umiddelbar nærhet til hverandre på NMJ tross for deres overlappende fordelinger. Skala bar i Panel D representerer fem mikrometer (AD). Alle NMJs innerverer muskler 6/7 i mage segment 4. Bilder ble tatt som fusjonert stabler ved hjelp av et Nikon A1R laserskanning konfokal mikroskop med NIS-Elements programvare, og probehandles med skrive Adobe Photoshop. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rapporten viser hvordan PLA kan anvendes til Drosophila larve NMJ. Analysen utføres på larvekroppsveggmuskelpreparater i den hensikt å detektere endogene protein-protein interaksjoner tilstede på NMJ. Med denne teknikk blir DLG og Hts vist seg å være i umiddelbar nærhet til hverandre, og således foreligge i en kompleks, spesielt på den postsynaptiske region 27. Til støtte for dette resultatet, har en tidligere studie gitt bevis for sin forening med følgende data: 1) de immunoreaktive distribusjoner av DLG og Hts lapper på den postsynaptiske regionen larve NMJs, 2) DLG og Hts danne et kompleks basert på samarbeid immunoutfellingsstudier eksperimenter som involverer hele den voksne fly lysatene, og 3) DLG og Hts samhandle på både epitel og synaptiske veikryss 8. PLA-signal på den postsynaptiske regionen ble også observert mellom DLG og Pak, en interaksjon som tidligere er identifisert i andre studier, og gir dermed ytterligere credence for å bruke denne analysen på NMJ 15,20,21. Interessant, PLA mellom Pak og Wg resulterte i ingen observerbar signal, selv om deres immunreaktive fordelinger overlappet ved NMJ. Dette resultatet viser at ikke alle proteiner som viser overlapp immunoreaktive distribusjoner vil generere en PLA signal, derfor indikerer at PLA gir en høyere oppløsning i å oppdage protein-protein interaksjoner enn tradisjonelle co-lokalisering studier.
Flere endringer ble gjort i den opprinnelige PLA-protokollen for å optimalisere analysen for larve NMJ (data ikke vist) 9,25. Først ble det fastslått at 1% BSA er en bedre blokkeringsmiddel for kroppsveggene i stedet for den angitte Blocking Solution. Sekund, for å produsere et sterkt signal-til-støy-forhold, riktig nedsenking og blanding av kroppsveggene i reaksjonsløsninger er kritisk. Et minimum av 200 ul i fem til ti kroppens vegger i en 0,65 ml mikrosentrifugerør ble ansett egnet påle når inkubasjon med PLA sonder, ligase eller polymerase, om volumene kan økes tilsvarende ved behandling av flere kropps vegger. Signalstyrken ble også forbedret ved å øke reaksjonstiden med 30 minutter over den anbefalte ganger. For det tredje ble en seriefortynning test av PLA prober utføres for å optimere balansen mellom reagens bevaring og signalstyrke. For de eksperimenter som er utført i denne rapporten, opp til en 1:25 fortynning - fra den anbefalte 1: 5 fortynning - fortsatt kan produsere en rimelig signal-til-støy-forholdet. Merk at optimalisering av ligation og amplifikasjonsreaksjoner ble ikke utført. Til slutt, som PLA kan være følsomme overfor små forandringer, er det sterkt anbefalt at de forskjellige genotyper av et enkelt eksperiment er plassert i et enkelt rør, slik at kontrollene og eksperimenter blir behandlet likt under analysen. Genotyper kan skilles ved å kutte hjørnene av kroppen vegger annerledes.
Several metoder brukes for å påvise Drosophila protein-protein interaksjoner inkludert gjær to-hybrid screening, co-immunopresipitering og gnage. Men hvordan disse metodene sammenligne mot PLA og dens evne til å visualisere protein-protein interaksjoner in situ? Gjær to-hybrid kan oppdage direkte binding mellom Drosophila proteiner uttrykt i gjær, og det har vært brukt i high-throughput genom-wide skjermer. Selv om mange av de identifiserte interaksjoner er biologisk relevant, analysen gir ofte falske positiver. I tillegg kan det oppstå falske negativer av flere grunner: de proteiner er fusjonert til transkripsjonsfaktordomener som kan interferere med binding, mange interaksjoner krever post-translasjonelle modifikasjoner som ikke forekommer i gjær, og kjernen (hvor analysen finner sted) kan ikke være et egnet miljø for noen interaksjoner til riktig form. Slike saker blir ikke møtt med PLA som det avtaler med endogene proteiner i sitt opprinnelige envirtes inn. En metode som kan brukes for å påvise interaksjon mellom endogene proteiner er co-immunoutfelling. Forsøk med Drosophila -lysater kan avsløre vev og stadium i livssyklusen der det skjer et samspill. Men som lysat dannelse involverer oppbrytning av cellene for å ekstrahere proteiner, cellene i vevet hvor interaksjon forekommer i, så vel som dens subcellulære lokalisering, kan ikke vurderes - i motsetning til i PLA. Videre registrerer co-immunoutfelling proteinkompleks binding og kan ikke skille mellom hvilke proteiner i komplekset er i umiddelbar nærhet til hverandre. Det finnes metoder som er tilgjengelige for FRET Drosophilists som tillater visualisering av protein-protein interaksjoner i cellen. Imidlertid innebærer FRET overekspresjon av transgene proteiner smeltet til fluorescerende koder og viser ikke nødvendigvis endogent protein oppførsel som i PLA.
Til tross for sine fordeler, er det noen limitationer ved bruk av PLA. En slik begrensning er tilgjengeligheten av primære antistoffer mot proteiner av interesse som er laget i forskjellige arter. Dette problem kan lett bli omgått ved anvendelse av merket transgene proteiner, selv om de kanskje ikke være virkelig representativ for den endogene interaksjon. Et annet problem er at PLA kan produsere falske negativer, for eksempel når de to primære antistoffer sterisk hinder hverandre eller når epitop av en av de primære antistoffene omfatter protein-protein interaksjon området. I tillegg, selv om PLA detekterer proteiner som er i umiddelbar nærhet til hverandre, at det ikke skille mellom direkte og indirekte protein-protein interaksjoner, i motsetning til i pull-down-analyser og gjær to-hybrid screening. Videre vil PLA mellom endogene proteiner ikke identifisere hvilke domener er ansvarlig for interaksjon. Således vil andre protein-protein interaksjon assays fremdeles være nødvendig for å fullt ut å karakterisere interaksjonen molecularly.
Forskere har begynt å bruke super-oppløsning mikroskop for å kartlegge romlig arkitektur av Drosophila larve NMJ, med en oppløsning på titalls nanometer oppnådd 26. PLA, med sin sammenlign molekylær oppløsning, bør gi en lav pris, teknisk enkel supplement til disse studiene som vil hjelpe til med å bygge opp en detaljert oversikt over organiseringen av de mange proteiner på NMJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Bloomington Drosophila Stock Center for å gi flue aksjer. Vi takker også utviklingsstudier Hybridoma Bank og Dr. Lynn Cooley (Yale University) for å gi antistoffer. En spesiell takk går til AhHyun Yoo for hennes hjelp på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra de naturvitenskapelige og Engineering Research Council of Canada (Krieger), William og Ada Isabelle Steel Fund (Krieger), og den kanadiske Institutes of Health Research (Harden).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps (fine #5) | Almedic | A10-704 | |
| Sylgard Disc | World Precision Instruments | SYLG184 | Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting. |
| Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection Scissors (ultra fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Platform Slides | Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting. | ||
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | |
| hts01103 | Bloomington Drosophila Stock Center | 10989 | Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal. |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 | NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1) | ||
| Bouin's Solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | |
| 4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS | PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton | Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787) | ||
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT | BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C. | ||
| mouse anti-Dlg (Discs large) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Use at a 1:10 dilution in 1% BSA. |
| rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) | Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA. | ||
| rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) | Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA. | ||
| mouse anti-Wg (Wingless) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4D4 | Use at a 1:5 dilution in 1% BSA. |
| goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| FITC-conjugated donkey anti-goat | Jackson ImmunoResearch | 705-095-003 | Use at a 1:200 dilution in 1% BSA. |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337) |
| 1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| 0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1) |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
References
- Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
- Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
- Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
- Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
- Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
- Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
- Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D.
- Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
- Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
- Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
- Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
- Bokoch, G. M.
- Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
- Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
- Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
- Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).
