Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

القوة الذرية الميكروسكوب من الضوء الأحمر الخلايا المستقبلة عن طريق رسم الخرائط PeakForce الكمية النانوميكانيكية الملكية

Published: October 24, 2014 doi: 10.3791/52164
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 2
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Chemistry, Northeastern Illinois University

Abstract

مجهر القوة الذرية (AFM) يستخدم تلميح هرمي تعلق على ناتئ للتحقيق في استجابة قوة من السطح. والانحرافات من طرف يمكن قياسها إلى ~ 10 السندات الإذنية بواسطة الليزر وكاشف قطاعية، والتي يمكن تحويلها إلى صورة طبوغرافية. تعديل السعة أو "واسطة التنصت" AFM يتضمن التحقيق إجراء اتصالات متقطعة مع السطح بينما تتأرجح في ترددها الرنانة لإنتاج صورة. تستخدم جنبا إلى جنب مع خلية السوائل، والتنصت على وضع AFM تمكن من التصوير من الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات في ظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. يتطلب التنصت AFM ضبط الوضع اليدوي لجنة التحقيق وتعديلات متكررة من العديد من المعلمات المسح التي يمكن تحدي للمستخدمين عديمي الخبرة. للحصول على صور عالية الجودة، وهذه التعديلات هي الأكثر استهلاكا للوقت.

PeakForce الكمية النانوميكانيكية الملكية لرسم الخرائط (PF-QNM) تنتج صورة عن طريق قياس قوة responمنحنى حد ذاتها لكل نقطة اتصال مع العينة. مع برنامج ScanAsyst، PF-QNM يمكن الآلي. هذا البرنامج بضبط مجموعة نقطة، تردد محرك، معدل المسح، المكاسب، وغيرها من المعايير الهامة تلقائيا مسح لعينة معينة. ليس فقط هذه العملية تحمي كلا تحقيقات الهشة والعينات، فإنه يقلل بشكل كبير من الوقت اللازم للحصول على صور عالية الدقة. PF-QNM غير متوافقة لAFM التصوير في السوائل. لذا، فقد التطبيق الواسع النطاق لتصوير المواد ذات الصلة من الناحية البيولوجية.

الطريقة المعروضة في هذه الورقة يصف تطبيق PF-QNM للحصول على صور من مبصرة الضوء الأحمر البكتيرية، RpBphP3 (P3)، من الضوئي R. palustris في دولة تكييفها ضوئها. باستخدام هذه الطريقة، وقد لوحظت dimers البروتين الفردية P3 والركام من dimers على سطح الميكا في وجود مخزن مؤقت التصوير. مع التعديلات المناسبة على السطح و / أو تركيز المحلول، وهذه الطريقةيمكن تطبيقها بشكل عام مع غيرها من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا ومواد لينة.

Introduction

أصبحت قوة المجهر الذري (AFM) أداة مهمة جدا عن التحقيق في الخصائص الهيكلية والميكانيكية للأسطح، الأغشية الرقيقة، والجزيئات واحدة منذ اختراع في عام 1986 (الشكل 1). 1-3 استخدام خلايا السائل، والأسلوب له تصبح مفيدة بشكل خاص في دراسات الجزيئات البيولوجية والخلايا حتى الذين يعيشون في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. 4-10 التنصت على الوضع وقد جرت العادة على استخدامها AFM لتصوير مواد لينة أو جزيئات ملزمة فضفاضة إلى السطح، منذ وضع الاتصال AFM غير مناسب عادة بسبب إلى الأضرار الناجمة عن القوى الجانبية التي مورست على عينة من ناتئ 11 التنصت على وضع AFM يقلل إلى حد كبير من خلال وجود هذه القوات غيض تلمس بشكل متقطع السطح بدلا من أن تكون على اتصال دائم. في هذا الوضع، وتأرجحت ناتئ في أو بالقرب من تردد الرنين العادي إلى السطح. وبالمثل في الاتصال وضع AFM، والطوبوغرافيا هو الشرجyzed من قبل المتهم بالتآمر في حركة ض بيزو بوصفها وظيفة من س ص (المسافة).

يمكن ديناميات ناتئ تكون غير مستقرة تماما في أو بالقرب من صدى. وبالتالي، فهي صعبة للغاية لأتمتة خارج حالة "حالة مستقرة". على وجه التحديد، هذه الديناميات تعتمد على كل من خصائص عينة المسح والبيئة. لجزيء لينة كثف إلى الثابت (إيه) السطح، حلقة ردود الفعل ضبطها جيدا لهذا الجزيء قد يؤدي إلى ردود الفعل التذبذب للسطح. العملية في السائل يزيد من تعقيد ضبط للناتئ. التغيرات في درجة الحرارة أو السوائل مستويات تتطلب التعديل المستمر من نقطة التحديد، المكاسب، والمعلمات التصوير الأخرى. هذه التعديلات تميل إلى أن تكون غاية تستغرق وقتا طويلا وتحديا للمستخدمين.

ذروة القوة الكمي النانوميكانيكية الملكية لرسم الخرائط (PF-QNM)، مثل التنصت وضع AFM، يتجنب التفاعلات الجانبية عن طريق الاتصال متقطع العينة (الشكل 2). 12-15 </ سوب> ومع ذلك، PF-QNM تعمل في وضع غير الرنانة وترددات أقل بكثير من التنصت وضع فؤاد. هذا يلغي التحديات من ضبط التنصت وضع AFM، ولا سيما تلك التي تفاقمت بسبب وجود السائل. مع PF-QNM، يتم جمع الصور من خلال اتخاذ منحنى استجابة القوة في كل نقطة اتصال. مع إضافة برامج ScanAsyst، 15 تعديل المعلمات المسح يمكن الآلي وصورة عالية الدقة الحصول في غضون دقائق من قبل المستخدمين حتى عديم الخبرة. بمجرد أن يصبح المستخدم أكثر دراية AFM، أي من المعلمات الآلي أو كل قد يتم تعطيل في أي وقت الذي يسمح التجريبي لضبط جودة الصورة يدويا. منذ نشأتها، وقد طبقت PF-QNM إلى الخريطة رودوبسين جرثومي، وهو بروتين الغشاء، والبروتينات الأصلية الأخرى على مستوى submolecular 16-18 لرودوبسين جرثومي، هناك علاقة مباشرة بين المرونة البروتين والأشعة السينية هياكل البلورات 12 PF -QNوقد استخدمت M للتحقيق في الخلايا الحية مع ارتفاع القرار. 19،20 الروابط المهمة علاوة على ذلك، أوضحت البيانات PF-QNM بين هيكل والميكانيكا داخل غشاء كرات الدم الحمراء التي تعتبر بالغة الأهمية لسلامة الخلية وظيفة 21

لقد استخدمنا المسح المجهري التحقيق (SPM) الأساليب، بما في ذلك AFM 22، 23 إلى دراسة بنية المستقبلات الضوئية الحمراء ضوء يسمى bacteriophytochromes (BphPs). 24،25 فهي تتألف من وحدة الاستشعار الخفيفة مرتبطة تساهميا إلى وحدة نمطية إشارات-المستجيب هذه كما كيناز الحامض الاميني (هونج كونج) 26 وحدة استشعار للضوء يحتوي عادة على حامل اللون بلعين التي يخضع التحول الهيكلي على امتصاص الفوتون، مع سلسلة من التغييرات الهيكلية الوصول إلى وحدة إشارات-المستجيب ويؤدي إلى التحول العالمي من البروتين بأكمله . 24،27-29 بناء على هذا التحول، وهناك نوعان ضوء متميزة استيعاب قتيتس من BphPs، ضوء استيعاب الدولة الحمراء وتحت الحمراء بعيدة، كما تدل العلاقات العامة وPFR. العلاقات العامة مستقرة حراريا الدولة، وتكييفها داكنة لمعظم BphPs 28 لم يتم فهم الأساس الجزيئي من العلاقات العامة / PFR photoconversion تماما بسبب المعرفة الهيكلية محدودة من هذه البروتينات. باستثناء مبنى واحد من D. radiodurans، 30 جميع الهياكل البلورات نشرت الأشعة السينية من هذه البروتينات في الدولة تتكيف الداكنة وتفتقر نطاق المستجيب. وBphPs سليمة تكون كبيرة جدا لدراستها بشكل فعال بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ويصعب المعروف أن تتبلور في شكلها سليمة (وخاصة في ولاية تكييفها ضوئية) لالبلورات بالأشعة السينية. وقد تم مؤخرا المهندسة BphPs كعلامات بروتين فلوري تحت الحمراء (IFP ل) 31 التوصيف الهيكلي من هذه البروتينات يمكن أن المزيد من المساعدات في تصميم إف بي فعال. 32-36

التركيز في هذه المقالة هو تقديم إجراءات لتصوير BphPs باستخدام AFM خلايا السائل عبر PF-QNM. وأظهرت دراسات الأسلوب الدولة تكييفها الخفيفة للRpBphP3 bacteriophytochrome (P3) من بكتيريا التمثيل الضوئي R. palustris. الإجراء AFM المقدمة هنا هو نهج مناسب ومباشر للتصوير من البروتينات وكذلك الجزيئات البيولوجية الأخرى. مع هذا الأسلوب، التفاصيل الهيكلية للجزيئات الفردية يمكن جمعها في فترة قصيرة من الزمن، على غرار جلسة مختبر مادة العلوم على مستوى العلوي. من خلال قياس عبر الأقسام واستكمال إجراء المزيد من التحليلات الأبعاد، البيانات التجريبية يمكن مقارنة النماذج الحسابية مفيدة. 37-42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحاسوب ومجموعة مجهر أعلى

  1. فتح صمام الاسطوانة N 2 وضبط المقابض لضمان الجدول الهواء يتحرك والمستوى.
  2. قم بتشغيل الكمبيوتر، وحدة تحكم، والألياف البصرية ضوء في هذا النظام.
  3. تعيين الماسح الضوئي إلى AFM / وضع LFM وتركز الكاميرا على رأسه فؤاد.
  4. البرمجيات مفتوحة. اختر فئة التجربة "خصائص ميكانيكية نانوية"، "الكمية النانوميكانيكية رسم الخرائط" في إطار مجموعة التجربة، و"PeakForce QNM في السائل" تحت التجربة. انقر تجربة تحميل وثم الإعداد.
  5. تركيز الكاميرا باستخدام الهدف Z لرؤية سطح المرحلة. باستخدام الخشنة أعلى / أسفل piezos تتحرك المرحلة حوالي 1 ملم تحت سطح AFM رئيس الفتحة.

2. إعداد ميكا السطحية

  1. اضغط لاصق لاصق على وجه نظيف القرص دعم العينة (15 مم، 0.8 مم). دفع الميكا V-4القرص الصف (25 × 25 × 26 ملم) على لاصق حتى تعلق بحزم.
  2. فرك قطعة من الشريط واضح على الميكا وضمان الالتزام بشكل كامل مع عدم وجود فقاعات الهواء. سحب الشريط قبالة الميكا من جانب واحد لأنه يلتصق بشكل متساو. كرر إذا لزم الأمر لضمان الميكا مسطح.
  3. قبضة القرص الدعم، نظيفة الجانب الميكا تصل، مع زوج من ملاقط دائرية (القابضون القرص)، ومكان على الماسح الضوئي. يجب أن يكون الميكا تحت مستوى AFM رئيس الفتحة.

3. السائل الجمعية الخليوي والتصوير من ميكا السطحية

  1. شطف الخلية السوائل، يا الدائري، حقنة محول، محول خرطوم، وخرطوم طرد في الإيثانول بنسبة 100٪. شطف الخلية السوائل في الماء DI. السماح لجميع أجزاء الهواء يجف تماما.
  2. دفع محول خرطوم في منفذ على الخلية السوائل النظيفة. اضغط بلطف يا الدائري في المسافة البادئة مركز الخلية السوائل باستخدام الملقط برئاسة شقة.
  3. اضغط على الربيع طفيفة على مقطع التجنيب التحقيق وتحويله بعيدا عن groovه لأجل الطرف.
  4. فهم التحقيق في نهاية فترة طويلة بعيدا عن الحافة مع ملاقط برئاسة مسطحة. وضع التحقيق في أخدود مع طرف التي تواجه مركز الخلية. دفع الربيع في وضبط مقطع التجنيب خلال التحقيق لضمان الحصول عليها (الشكل 1B).
  5. تحقق المشبك على AFM للتأكد من أنه تراجع تماما (الشكل 1C).
  6. وضع الخلية السوائل، يا الدائري والتحقيق التي تواجه أسفل، على رأس العينة الميكا. السماح للخلية السوائل للراحة على دبابيس من AFM. خفض المشبك لتحقيق الاستقرار في خلية السوائل على المسرح. اضغط على مفتاح لأسفل على المجهر حتى يظهر الفحص البصري يا الدائري المضغوط بقوة بين القرص الدعم والخلية السوائل.
  7. أثناء مشاهدة الشاشة، والتركيز على مقبض التعديل الخشنة لتصور الجزء العلوي من الخلية السوائل على الشاشة.
  8. نقل المجهر حتى يكون هناك صورة واضحة من طرف باستخدام X / Y والمقابض تعديل الهدف Z. سوف غيض التطبيقالأذن مثل المعدني، والمثلث الذهبي. نقل معلومات سرية أقرب إلى سطح العينة باستخدام رافعة بيزو أسفل على المجهر. التركيز على انعكاس الحافة. تتبع ناتئ الفعلي في العلاقة انعكاسه. في هذه المرحلة، ينبغي أن تتماشى بشكل وثيق، ولكن ليس تداخل تماما.
  9. إرفاق محول حقنة معقمة إلى 1 مل حقنة. إرفاق واحدة من نهاية خرطوم طرد إلى محول حقنة ووضع الطرف الآخر للخرطوم في حاوية من حل العازلة. تمديد بالكامل المكبس من حقنة.
  10. نعلق خرطوم إلى محول خرطوم على الخلية السوائل. اضغط بلطف على المكبس حتى السوائل تملأ بالكامل غرفة المركز. تحقق الخلية لضمان عدم وجود فقاعات الهواء. تحقق لمعرفة عدم وجود السائل امتدت من الخلية السوائل على المجهر. وضع الحقنة على دعم قوي المطروحة.
  11. استخدام الأعلاف الكاميرا وX / Y المقابض الترجمة لتحديد الليزر على الشاشة (نقطة حمراء منتشر). باستخدام الليزر movemالسيطرة على المقابض الأنف والحنجرة، تحريك الليزر على طرف.
  12. ناعما ضبط الضوابط الليزر ومرآة حتى يتم تكبير الإشارة مبلغ ظهور المجهر (القيمة = 4-6).
  13. ضبط زاوية من الصمام الثنائي رباعي باستخدام المقابض على الجانب الخلفي الأيسر والجانب الأيسر العلوي من الرأس المسح الضوئي لخفض الانحرافات الأفقية والعمودية ظهور المجهر أقرب إلى الصفر قدر الإمكان (± 0.1).
  14. في البرنامج، حدد خيارات الاستحواذ. كحد أدنى، حدد ارتفاع (تتبع وتقفي)، خطأ ذروة القوة، وتشوه. الخيارات الأخرى هي المستخدم يعتمد ويمكن تكييفها على أساس المعلومات المحددة المطلوبة من قبل التجريبي.
  15. حدد "الخط" لRT طائرة صالح في كل نافذة الاستحواذ. حدد "لا شيء" لOT طائرة صالح في النوافذ الارتفاع. تعيين X و Y تعويض وزاوية المسح الضوئي إلى الصفر، إن لم تكن قد فعلت.
  16. تعيين معدل المسح إلى 1 هرتز، العينة في كل سطر إلى 256، ومراقبة السيارات ScanAsystللفرد، وScanAsyst السيارات Z حد لإيقاف تشغيله. تغيير حد Z إلى 500 نانومتر. تحديد حجم المسح الضوئي إلى 1 ميكرون.
  17. انقر المشاركة. عند هذه النقطة، وغيض النهج السطح. بينما يقترب طرف، ومراقبة Z التغيير بيزو الجهد في الزاوية السفلى اليسرى من الشاشة. إذا يذهب غيض خارج النطاق، سحب طرف وإعادة النهج. إذا كان هذا غير ناجحة، قد تحتاج إلى تغيير غيض من أجل أن يكون نهجا ناجحا. مرة واحدة وتشارك طرف، فإن خطوط تبدأ في الظهور في كل من النوافذ الاستحواذ التي من شأنها أن يؤلف صورة.
  18. التقاط صور من الميكا في 1 × 1 ميكرومتر وتكبير ببطء للتأكد من أن سطح الميكا نظيف ومستو. انقر التقاط متواصل لحفظ الصور لأنها تظهر. تكبير والتحرك في جميع أنحاء سطح النحو المرغوب فيه.

4. ترسب البروتين وإعداد نموذج للتصوير

  1. الحصول على عينة البروتين المنقى 38 والحفاظ على الجليد. إذا تخزينها في الثلاجة، ذوبان الجليد العينة علىالجليد لمدة 5 دقائق.
  2. تمييع البروتين إلى 0.0010 ملغ / مل باستخدام المبردة حل العازلة التصوير. المخزن المؤقت التصوير المستخدمة هنا هو 15 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8.0)، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 15 ملم MgCl 2.
  3. ملء غرفة 4 (100 × 15 ملم) طبق بيتري مع المبردة حل العازلة التصوير. ملء كل غرفة مع لا يقل عن 5 مل من محلول. المزيج بلطف الحل البروتين المخفف مع طرف تعلق على micropipettor.
  4. تطبيق 200 ميكرولتر من محلول البروتين المخفف على سطح الميكا أعدت بالفعل. بعد 30 ثانية، والتقاط سطح البروتين / الميكا مع ملاقط دائرية (القابضون القرص). عقد العينة موازية لمقاعد البدلاء المختبر.
  5. في حين عقد العينة، تزج فورا العينة في حل العازلة الواردة في الربع الأول من طبق بتري (الخطوة 4.2) مع ضمان أن العينة هي موازية لحوض طبق بيتري. بعد 1 ثانية، وإزالة العينة.
  6. الاستمرار في عقد العينة موازية للحوضمن طبق بيتري، كرر الخطوة 4.5 لالأرباع الثلاثة المتبقية.
  7. ضع القرص على الجاف قطعة قماش خالية الغبار لامتصاص الرطوبة الزائدة ونقل القرص على خشبة المسرح المجهر. لا تلمس السطح الفعلي مع قطعة قماش. لا تسمح للعينة لتجف.
  8. كرر الخطوات 3،6 حتي 3،16.

5. التصوير البروتينات على ميكا

  1. انقر فوق خانة الاختيار المعلمات على على الجانب الأيسر من الشاشة. يجب تعيين حجم الربيع ونصف قطرها طرف بناء على معلومات سرية المستخدمة.
  2. انقر المشاركة. وعلى غرار عملية التصوير الميكا (الخطوة 3.17)، ومراقبة نافذة ض بيزو مع اقتراب الحافة.
  3. سماح الماسح الضوئي لصورة نفس المنطقة لمدة لا تقل يمر متتالية. انقر التقاط المستمر لتوفير كل صورة تم جمعها.
  4. تحرك الماسح الضوئي إلى منطقة جديدة و / أو تغيير حجم الصورة على النحو المرغوب فيه.
  5. بعد انتهاء البرنامج الآلي تعديلالمعلمات المسح عن معين حجم الصورة، وتحويل البرمجيات قبالة.
  6. ضبط يدويا معدل المسح، Z الحد، وعدد من الخطوط، والجهد من أجل ضبط تركيز الصورة. إذا تصبح الصورة بعيدة جدا من التركيز، وتحويل البرمجيات العودة مرة أخرى إلى نقطة الانطلاق الأصلي. لزيادة دقة الصورة أثناء التكبير على البروتين، وانخفاض معدل المسح وزيادة عدد خطوط نسبيا.
  7. بعد التجربة، وتنظيف الخلية السائلة مع الإيثانول بنسبة 100٪ وشطف مع DI H 2 O. السماح الخلية السائلة لتجف تماما.
  8. افتح البرنامج بيانات لمعالجة الصور البيانات الخام. أولا، تتسطح الصورة عن طريق النقر على أيقونة تسطيح. حدد صفر عشر النظام وانقر فوق تنفيذ. اعتمادا على الصورة، قد يكون مناسبا الطائرة من الضروري الحصول على صورة كاملة بشكل مناسب. في هذه الحالة، حدد تناسب رمز الطائرة ورسم الطائرة من منطقة مسطحة من الصورة باستخدام المؤشر. انقر فوق تنفيذ. كرر حسب الضرورة
  9. SELإلخ علامة التبويب المقطع العرضي لقياس الأبعاد للبروتين. رسم خط مع تحرك المؤشر على مدى جزيء أو المنطقة المراد تحليلها. تكرار للمناطق متعددة ويقوم البرنامج بإنشاء تراكب. تصدير صورة أو البيانات المستخدمة لتوليد الصورة في تنسيق متوافق مع برامج الرسم وغيرها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتعرض الصور AFM تمثيلية من بروتين مبصرة، P3، في دولة تكييفها ضوئها في أرقام 3 و 4. والركيزة الميكا المشقوق طازجة (الشكل 3A) هي، سطح مستو مناسب للبروتين الامتزاز. جمع الصورة من الميكا نظيفة كعنصر تحكم السلبية المهم لعدة أسباب. أولا، فإنه يؤمن الخلية السائلة ونظيفة وسوف أي مواد متبقية من التجارب السابقة تلوث السطح. الثانية، وهي تختبر جودة التحقيق. إذا كان التحقيق هو قذر أو مشوه، وهذا سوف تظهر في الصورة كما الشرائط أو تقديم نفسها باعتبارها الضوضاء. أخيرا، صورة الميكا نظيفة تؤكد التحقيق يمكن ضبطها بشكل مناسب للتجارب المستقبلية.

ويمكن ملاحظة dimers البروتين مبصرة واحد باستخدام PeakForce QNM إذا التغطية السطحية مناسبة (الشكل 3B، C). السهام تشير dimers الفردية؛ النجمة ترمز الى مجموع البروتين. وتركيز العينة البروتين، والوقت ترسب، وقوة الأيونية المخزن المؤقت التصوير تؤثر على تغطية السطح. 23 لتوزيع عالية من جزيئات واحدة، تمييع للغاية مع الحلول المطلوبة مرة ترسب قصيرة. على سبيل المثال، مضاعفة الوقت ترسب تعطي التوزيع عال من الركام أكبر. إذا زاد تركيز البروتين إلى 0.100 ملغ / مل، ويلاحظ طبقة رقيقة من المستقبلات الضوئية دون تعديل الوقت ترسب أو المخزن المؤقت القوة الأيونية.

باستخدام برنامج تحليل الصور، قد يكون قياس المقاطع العرضية من البروتينات بعد تسطيح الصورة (الشكل 4). توفر المقاطع العرضية البيانات س ص مع قياسات الارتفاع المقابلة. هذه القياسات يمكن استخدامها لتقديم تفاصيل الهيكلية، تفاعلات البروتين / سطح، والقوة الميكانيكية، الخ يمكن الملتوية والبيانات س ص بواسطة المسبار AFM. ولكن هذا التأثير يمكن التقليل باستخدام مسبار أكثر وضوحا. في الواقع، فإن تشوالجليد من التحقيق هو توازن دقيق بين مبلغ مقبول من الالتواء والمقاومة للمواد المصورة للتلف بواسطة مسبار حاد. ويمكن أيضا أن تطرح طرف الإلتواء من الصورة، إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام البرمجيات المناسبة.

هذه الصور يمكن مقارنة مباشرة إلى الصور المنشورة سابقا جمعها باستخدام التنصت وضع AFM 20 أبعاد قياس من P3 على الميكا باستخدام PeakForce QNM هي في حدود 5٪ من القيم التي تم الحصول عليها مع وضع التنصت AFM.

الشكل 1
الرقم 1. السائل خلية المجهري القوة الذرية. (A) ليزر، ناتئ، التحقيق، والمواءمة السطح. تلصق التحقيق وناتئ داخل الخلية السائلة. الخلية (B) السائل. مغمورة تماما التحقيق، ناتئ، والعينة في السائل. (C) مجمعاتجمعية ومؤسسة التدريب الأوروبية. ويرد الخلية السائلة إلى ميكرون. يظهر في الصورة رئيس البصري والماسح الضوئي في العلاقة إلى الخلية السائلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: PeakForce الكمية النانوميكانيكية الملكية رسم الخرائط هذا هو التوضيح للقوة ذروة صغيرة (A) نهج (B) الانتقال إلى الاتصال (C) ذروة القوة (D) التصاق (E) تتراجع. تم تكرار الرقم وتكييفها مع إذن. 15

الرقم 3 الرقم 3. الذرية قوة الميكروسكوب من P3 على ميكا. (A) صورة من الميكا نظيفة (1 × 1 ميكرومتر). (B) صورة (1 × 1 ميكرومتر ميكرومتر) من P3 تطبق على الميكا. الأسهم تشير إلى أمثلة من dimers البروتين واحدة. النجمة يدل على مجموع dimers البروتين. (C) صورة (170 × 170 نانومتر) اثنين dimers البروتين مع أقحم ثلاثي الأبعاد من ديمر واحد. والإقحام الذي يعين ديمر البروتين موجود في أقحم. وقد تم نقل كل الصور في وجود المخزن المؤقت التصوير (تركيز البروتين = 0.0010 ملغ / مل لترسب). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. مستعرضة تحليل P3 على ميكا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFM هو طريقة المسح المجهري التحقيق قادرة تماما على التصوير البروتينات والجزيئات البيولوجية الأخرى في ظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. بالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي والحد من AFM واحد هو عدم قدرتها على تحقيق نفس القرار، ولا سيما قرار الجانبي. عند استخدام AFM لتحليل جزيء على أي سطح، يجب أيضا النظر في تأثير السطح والتحقيق على صورة جزيء عندما يتم تحليل البيانات. Deconvoluting من تأثير المسبار على الصورة المكتسبة قد يكتمل مع البرمجيات المناسبة. يمكن تطوير نماذج نظرية مقارنة لنتائج تجريبية أيضا يثبت أنه مفيد جدا.

في هذه الورقة، صور AFM من الضوء الأحمر مبصرة البكتيرية، RpBphP3 (P3)، وتعرض (الشكل 3). بينما أوصاف الجمعية المجهر وتشغيل البرمجيات هي محددة لنموذج صك معين العاملين، والميكاوإجراءات إعداد العينات البروتين هي عامة ويمكن تطبيقها على أي تجربة AFM.

يجب اتباع بضع خطوات حاسمة من هذا البروتوكول من أجل الحصول على التغطية البروتين المطلوب على سطح الميكا. أولا، يجب أن يكون الحل البروتين المخفف مختلطة بلطف قبل أن يتم تطبيقه على سطح الميكا (الخطوة 4.3). نظرا لوزن جزيئي عال من P3، والحل هو إيداع الغروية جدا؛ لذا، P3 يستقر على الجزء السفلي من الأنبوب مع مرور الوقت مما يجعل الحل غير متجانسة. والعلاجات ضجة لطيف هذه المسألة. ثانيا، متى تطبق البروتين، يجب أن تشطف السطح لإزالة أي جزيئات ملزمة فضفاضة (الخطوة 4،5-4،6). إذا ظلت P3 ملزمة فضفاضة على السطح، وسوف يتم الافراج عن جزيئات إما في الحل عندما يتم تعبئة الخلية السائلة مع حل العازلة و / أو التقطت بواسطة المسبار AFM أثناء التجربة. كل من هذه الأحداث تعيق تجربة التصوير ناجحة. إذاوخلايا السائل تصبح ملوثة P3، لا بد من تفكيكها وتنظيفها جيدا. إذا كان التحقيق AFM يختار جزيء تصل، فإنه عادة يجب استبدال أو التضحية جودة الصورة. أخيرا، طريقة الشطف العينة البروتين ضروري لحصول على صور ممتازة. الميكا هو السطح غير انتقائي لP3. لذا، ينبغي إيجاد جزيئات لتكون موجهة بشكل عشوائي. طريقة الشطف موضح في البروتوكول هو طريقة واحدة لتجنب إعادة ترتيب الجزيئات على السطح في اتجاه واحد واحد. المفتاح هو الحفاظ دائما على عينة رطبة وتجنب الضغط على السطح في زاوية وحرفيا رش السطح مع العازلة. إذا تم تشطف العينة بواسطة غمس، في حين الضغط عليه موازية لحوض طبق بتري، والتقليل من تشويه P3 على السطح تيارات القوة من الحل العازلة.

جميع الأجزاء إلى الخلية السائلة، التحقيق، الماسح الضوئي، ورئيس الضوئية هي حساسة جدا ويجب التعامل معها بحذر. وsprinع التي تحمل الماسح الضوئي ورئيس البصرية هي قوية جدا معا. فمن الضروري للحفاظ على اليد على الماسح الضوئي عند تجميع أو تخفي أي من القطع. لPF-QNM مع برنامج ScanAsyst، كما هو موضح في البروتوكول، فمن الضروري لإيقاف سيطرة البرمجيات الآلي لZ-الحد وتعيين هذه القيمة إلى 500 نانومتر على الأقل إذا كان حجم المسح الضوئي الأصلي هو 1 ميكرون (الخطوة 3.16) . هذا يحمي الماسح الضوئي إذا أصبح سطح خشن بشكل غير متوقع أو قد تصبح ملوثة. مرة واحدة تم جمعها في صورة واحدة وأكد أن منطقة المصورة على نحو سلس، وZ-حد يمكن تعديلها نزولا يدويا لتحقيق الصور عالية الدقة. لا بد من إعادة ضبط Z-إلى حد لا يقل عن 500 نانومتر عند نقل الماسح الضوئي إلى منطقة جديدة من السطح أو إذا تم سحب طرف لأي سبب من الأسباب.

بينما تركزت هذه الدراسة على استخدام PF-QNM للحصول على صور عالية الجودة الطوبوغرافية، ويمكن للطريقة نفسها توفرمكتبة معلومات إضافية حول القوة الميكانيكية ومرونة الهياكل السطح. هذه الميزة يمكن أن يؤدي إلى مزيد من الأفكار حول وظيفة ببساطة عن طريق اختيار القنوات المناسبة أثناء التجربة. 16،18 مع التغييرات المناسبة للتركيز المحلول إيداع و / أو السطح، ويمكن أن يكون هذا الأسلوب العام لاستخدام PF-QNM للتحقيق الجزيئات البيولوجية بواسطة AFM خلايا السائل. مع مساعدة من البرمجيات الآلي، يمكن للطلاب في الدورات العلمية ذات المستوى العلوي مع أي خبرة سابقة مع AFM إكمال التجربة AFM خلايا السائل بسرعة أكبر بكثير من التنصت مع الوضع التقليدي AFM. يمكن للطلاب تجربة أساسيات AFM والحصول على طعم البحوث المتعددة التخصصات التي تحققت بفضل هذه التقنية قوية داخل نموذجي 3-4 ساعة قسم المختبر ضيق الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

واعترف لتمويل شراء الالكترونيات جديدة تحكم، والبرمجيات، وخلايا السائل، وغيرها من المعدات اللازمة لتجميع AFM المزدوج / STM: برنامج NSF-MRI (1229103 CHE). نعترف المرافق المشتركة في جامعة شيكاغو برنامج NSF-MRSEC (DMR-0820054) للحصول على المساعدة مع AFM الأجهزة، والتدريب، والتصوير، والوقت أداة التي أتاحتها شبكة المرافق أبحاث المواد (DMR-0820054). نشكر بشكل خاص الدكتور Qiti قوه، والدكتور جوستين Jureller، والأستاذ كا يي لي لاستقبال طلابنا قبل تمويل الاقتراح NSF-MRI التي جلبت الأجهزة الضروري الحرم الجامعي. ونحن نعترف تمويل من الباب الثالث منحة STEM (ID: P031C110157) منحت لجامعة نورث إيسترن إلينوي التي تقدم رواتب الأبحاث الصيف للطلاب وأعضاء هيئة التدريس وكذلك دعم الإمدادات من المواد الاستهلاكية. وأخيرا، فإننا نعترف بروكر نانو، وشركة لاستمرار دعم دور فعال وللحصول على إذن لصeproduce مؤامرة تبين آلية PeakForce QNM واستخدام ScanAsyst كلمة لوصف البرنامج الآلي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl Fisher Scientific O4997-100
NaCl Acros Organics 7647-14-5
MgCl2 Acros Organics 7791-18-6
Multimode 8 AFM Bruker-Nano 492-008-011 equipped with Nanoscope V controller and J scanner
Probe Bruker-Nano SNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Tapping Mode Fluid Cell Bruker-Nano MTFML
Mica V-4 Grade SPI supplies 1150503 25 x 25 x .26 mm
Sample support disk nanoSurf BT02236
Petri dish Plasta-Medic, Inc. 100 mm x 15 mm 
micropipettors Denville Scientific XL 3000i
RpBphP3 Prepared according to cited references
Nanoscope software Bruker-Nano
Fiber Optic Light Digital Instruments Inc. F0-50
Pelco AFM Disc Gripper Ted Pella Inc 1668 12 mm
1 ml syringe McKesson 102-ST1C
Eppendorf tubes Denville Scientific C2171
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 Schrodinger, LLC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
  2. Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
  3. Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
  4. Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
  5. Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
  6. Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
  7. Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
  8. Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
  9. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
  10. Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
  11. Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
  12. Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
  13. Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
  14. Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
  15. Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
  16. Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  17. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
  18. Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
  19. Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
  20. Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
  21. Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
  22. Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
  23. Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
  24. Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
  25. Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
  26. Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
  27. Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
  28. Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
  29. Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
  30. Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
  31. Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
  32. Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
  33. Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
  34. Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
  35. Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
  36. Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
  37. The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
  38. Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
  39. Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
  40. Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
  41. Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
  42. Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).

Tags

الفيزياء، العدد 92، مجهر القوة الذرية، والبروتين، مبصرة، والكيمياء السطحية، علم النانو والمواد الناعمة، الجزيئات، AFM
القوة الذرية الميكروسكوب من الضوء الأحمر الخلايا المستقبلة عن طريق رسم الخرائط PeakForce الكمية النانوميكانيكية الملكية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kroeger, M. E., Sorenson, B. A.,… More

Kroeger, M. E., Sorenson, B. A., Thomas, J. S., Stojković, E. A., Tsonchev, S., Nicholson, K. T. Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping. J. Vis. Exp. (92), e52164, doi:10.3791/52164 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter