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Engineering

PeakForce मात्रात्मक Nanomechanical गुण मैपिंग का उपयोग रेड लाइट photoreceptors की परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी

Published: October 24, 2014 doi: 10.3791/52164
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 2
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Chemistry, Northeastern Illinois University

Abstract

परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) एक सतह के बल प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक ब्रैकट से जुड़ी एक पिरामिड टिप का उपयोग करता है. टिप की deflections छवि स्थलाकृति में बदला जा सकता है जो एक लेजर और सेक्टर डिटेक्टर, द्वारा करने के लिए ~ 10 पी.एन. मापा जा सकता है. आयाम मॉड्यूलन या "दोहन मोड" AFM एक छवि का निर्माण करने के लिए अपने गुंजयमान आवृत्ति पर oscillating जबकि सतह के साथ आंतरायिक संपर्क बनाने जांच शामिल है. एक द्रव सेल के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, दोहन मोड AFM ऐसे physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों में प्रोटीन के रूप में जैविक अणुओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है. दोहन ​​मोड AFM जांच और अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है जो स्कैनिंग मापदंडों के एक भीड़ के लगातार समायोजन का मार्गदर्शन सुधार आवश्यक है. उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए, इन समायोजन सबसे अधिक समय लगता है.

PeakForce मात्रात्मक Nanomechanical गुण मैपिंग (पीएफ-QNM) एक बल जिम्मेदारी को मापने के द्वारा एक छवि का उत्पादननमूने के साथ संपर्क की हर बात के लिए एसई वक्र. ScanAsyst सॉफ्टवेयर के साथ, पीएफ-QNM स्वचालित किया जा सकता. यह सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से किसी नमूने के लिए सेट सूत्री, ड्राइव आवृत्ति, दर स्कैन, लाभ, और अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर स्कैन समायोजित करता है. इतना ही नहीं इस प्रक्रिया कमजोर जांच और नमूने दोनों की रक्षा करता है, यह काफी उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है. पीएफ-QNM द्रव में AFM इमेजिंग के लिए संगत है; इसलिए, यह जैविक रूप से प्रासंगिक सामग्री इमेजिंग के लिए व्यापक आवेदन किया है.

इस पत्र में प्रस्तुत विधि संश्लेषक आर से एक जीवाणु लाल बत्ती फोटोरिसेप्टर, RpBphP3 (पी 3) की छवियों को प्राप्त करने के लिए पीएफ-QNM के आवेदन का वर्णन इसके प्रकाश अनुकूलित राज्य में palustris. इस विधि का प्रयोग, व्यक्तिगत प्रोटीन पी 3 के dimers और dimers का समुच्चय एक इमेजिंग बफर की उपस्थिति में एक अभ्रक सतह पर मनाया गया है. उचित सतह समायोजन और / या समाधान एकाग्रता, इस विधि के साथआम तौर पर अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं और नरम सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 1986 में अपने आविष्कार (चित्रा 1) के बाद से सतहों, पतली फिल्मों, और एकल अणुओं की संरचनात्मक और यांत्रिक गुणों की जांच के लिए एक बहुत महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. 1-3 एक तरल सेल का प्रयोग, विधि है एक physiologically प्रासंगिक वातावरण में जैविक अणुओं के अध्ययन और भी जीवित कोशिकाओं में विशेष रूप से उपयोगी हो गया है. AFM परंपरागत संपर्क मोड AFM के बाद से, नरम सामग्री या सतह को शिथिल बाध्य अणु इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है 4-10 दोहन मोड के कारण आम तौर पर अनुपयुक्त है पार्श्व बलों की वजह से नुकसान के लिए ब्रैकट द्वारा नमूना पर लगाए गए. 11 दोहन मोड AFM काफी नोक रहकर सतह को छूने होने के बजाय लगातार संपर्क में होने से इन बलों को कम करता है. इस मोड में, ब्रैकट पर या सतह के लिए सामान्य इसकी गुंजयमान आवृत्ति के पास डोलती है. इसी प्रकार AFM मोड संपर्क करने के लिए, स्थलाकृति गुदा हैXY (दूरी) के एक समारोह के रूप में जेड piezo के आंदोलन की साजिश रचने के द्वारा yzed.

ब्रैकट गतिशीलता पर या गूंज के पास काफी अस्थिर हो सकता है; इसलिए, वे एक "स्थिर राज्य" स्थिति के बाहर स्वचालित करने के लिए बहुत चुनौती दे रहे हैं. विशेष रूप से, इन गतिशीलता नमूना गुण और स्कैनिंग पर्यावरण दोनों पर निर्भर करते हैं. एक कठिन (ईआर) सतह पर adsorbed एक नरम अणु, अणु के लिए एक अच्छी तरह से देखते प्रतिक्रिया पाश सतह के लिए प्रतिक्रिया दोलन को जन्म दे सकती है. आगे द्रव में ऑपरेशन ब्रैकट की ट्यूनिंग पेचीदा हो. तापमान या तरल पदार्थ के स्तर में परिवर्तन सेट बिंदु, लाभ, और अन्य इमेजिंग मापदंडों की लगातार पुनः समायोजन की आवश्यकता होती है. ये समायोजन बहुत समय लेने वाली और उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो जाते हैं.

पीक सेना मात्रात्मक Nanomechanical गुण मैपिंग (पीएफ-QNM), मोड AFM दोहन की तरह, रहकर नमूना (चित्रा 2) से संपर्क करके पार्श्व बातचीत से बचा जाता है. 12-15 </ Sup> हालांकि, पीएफ-QNM न सुनाई देती मोड और दोहन मोड AFM की तुलना में बहुत कम आवृत्तियों में चल रही है. इस दोहन मोड AFM, तरल पदार्थ की उपस्थिति द्वारा exacerbated विशेष रूप से उन लोगों की ट्यूनिंग चुनौतियों समाप्त. पीएफ-QNM के साथ, छवियों संपर्क के हर बिंदु पर एक बल प्रतिक्रिया वक्र लेने से एकत्र कर रहे हैं. ScanAsyst सॉफ्टवेयर के अलावा के साथ, स्कैनिंग मापदंडों के 15 समायोजन स्वचालित किया जा सकता है और एक उच्च संकल्प छवि भी अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं द्वारा मिनट के एक मामले में प्राप्त की. उपयोगकर्ता AFM से अधिक परिचित हो जाता है एक बार, स्वचालित मापदंडों में से किसी एक या सभी छवि गुणवत्ता मैन्युअल ठीक धुन करने experimentalist परमिट जो किसी भी समय निष्क्रिय किया जा सकता है. अपनी स्थापना के बाद, पीएफ-QNM. Submolecular स्तर पर bacteriorhodopsin, एक झिल्ली प्रोटीन, और अन्य देशी प्रोटीन नक्शा करने के लिए लागू किया गया है bacteriorhodopsin के लिए 16-18, प्रोटीन लचीलापन और एक्सरे crystallographic संरचनाओं के बीच सीधा संबंध है. 12 पीएफ -QNएम उच्च संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है. सेल अखंडता और समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं कि एरिथ्रोसाइट झिल्ली के भीतर की संरचना और यांत्रिकी के बीच 19,20 इसके अलावा, पीएफ-QNM डेटा elucidated किया है महत्वपूर्ण कनेक्शन. 21

हम 22 bacteriophytochromes (BphPs) नामक लाल बत्ती फोटोरिसेप्टर की संरचना का अध्ययन करने के AFM, 23 सहित स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी (एसपीएम) के तरीकों कार्यरत है. 24,25 वे covalently एक संकेतन-प्रेरक मॉड्यूल ऐसे से जुड़ा हुआ एक प्रकाश संवेदन मॉड्यूल से मिलकर बनता है हिस्टडीन kinase (एच) के रूप में. 26 प्रकाश संवेदी मॉड्यूल आमतौर पर संरचनात्मक परिवर्तन संकेतन-प्रेरक मॉड्यूल पहुंचने और पूरे प्रोटीन की एक वैश्विक परिवर्तन के लिए अग्रणी की एक श्रृंखला के साथ, एक फोटान का अवशोषण पर संरचनात्मक परिवर्तन आए जो एक bilin क्रोमोफोर शामिल . इस परिवर्तन के आधार पर 24,27-29, दो अलग प्रकाश को अवशोषित है वहाँBphPs, एक लाल और दूर की लाल बत्ती को अवशोषित राज्य के tates, पीआर और पीएफआर के रूप में चिह्नित. पीआर सबसे BphPs के लिए thermally स्थिर, काले अनुकूलित राज्य है. पीआर / PFR photoconversion के आणविक आधार पूरी तरह कारण इन प्रोटीनों की सीमित संरचनात्मक ज्ञान को समझ नहीं है 28. डी से एक संरचना के अपवाद के साथ radiodurans, ये प्रोटीन के 30 सब प्रकाशित एक्स रे crystallographic संरचनाओं काले अनुकूलित राज्य में हैं और प्रेरक डोमेन की कमी है. बरकरार BphPs प्रभावी ढंग से परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) द्वारा अध्ययन किया जाना बहुत बड़ी हैं और एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए (विशेष रूप से प्रकाश अनुकूलित राज्य में) उनके अक्षुण्ण रूप में मणिभ को बेहद मुश्किल हैं. BphPs हाल ही में अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के रूप में इंजीनियर किया गया है (आईपीएफ के). इन प्रोटीनों की 31 संरचनात्मक लक्षण वर्णन प्रभावी IFP डिजाइन में सहायता को आगे कर सकते हैं. 32-36

इस लेख का ध्यान केंद्रित करने के लिए एक प्रक्रिया मौजूद हैपीएफ-QNM के माध्यम से तरल सेल AFM का उपयोग BphPs की इमेजिंग. विधि संश्लेषक जीवाणु आर से bacteriophytochrome RpBphP3 (पी 3) के प्रकाश अनुकूलित राज्य के अध्ययन के द्वारा प्रदर्शन किया है palustris. यहाँ प्रस्तुत AFM प्रक्रिया प्रोटीन की इमेजिंग के लिए सुविधाजनक और सरल दृष्टिकोण के साथ ही अन्य जैविक अणुओं है. इस विधि के साथ, व्यक्तिगत अणुओं की संरचनात्मक विवरण एक उच्च स्तर के विज्ञान पाठ्यक्रम प्रयोगशाला सत्र के लिए इसी तरह समय की एक छोटी अवधि में एकत्र किया जा सकता है. पार वर्गों को मापने और आगे आयामी विश्लेषण पूरा करने के माध्यम से, प्रयोगात्मक डेटा उपयोगी कम्प्यूटेशनल मॉडल की तुलना में किया जा सकता है. 37-42

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Protocol

1 कंप्यूटर और माइक्रोस्कोप सेट

  1. एन 2 सिलेंडर के वाल्व खोलने और हवा मेज चल और स्तर सुनिश्चित करने के लिए knobs समायोजित.
  2. इस क्रम में कंप्यूटर, नियंत्रक, और फाइबर ऑप्टिक प्रकाश पर मुड़ें.
  3. AFM / LFM मोड के लिए स्कैनर सेट और AFM सिर पर कैमरे केंद्र.
  4. ओपन सॉफ्टवेयर. चयन प्रयोग श्रेणी "Nanomechanical गुण", प्रयोग समूह के तहत "मात्रात्मक Nanomechanical मानचित्रण", और प्रयोग के तहत "द्रव में PeakForce QNM". लोड प्रयोग और फिर सेटअप क्लिक करें.
  5. मंच की सतह को देखने के लिए जेड उद्देश्य का उपयोग कैमरे का फोकस. / नीचे मोटे अप का उपयोग piezos लगभग 1 मिमी AFM सिर एपर्चर की सतह के नीचे मंच चाल है.

मीका भूतल के 2. तैयारी

  1. एक साफ नमूना समर्थन डिस्क (15 मिमी व्यास, 0.8 मिमी मोटी) के चेहरे पर एक चिपकने वाला स्टीकर दबाएँ. एक अभ्रक वी -4 पुशचिपकने वाला पर ग्रेड डिस्क (25 x 25 x 26 मिमी) मजबूती से जुड़ी जब तक.
  2. यह पूरी तरह से कोई हवाई बुलबुले के साथ पालन किया है सुनिश्चित करने मीका पर स्पष्ट टेप का एक टुकड़ा रगड़ो. समान रूप से यह फोड़ना को एक तरफ से अभ्रक बंद टेप खींचो. मीका फ्लैट है बीमा करने के लिए यदि आवश्यक हो दोहराएँ.
  3. पकड़ समर्थन डिस्क, परिपत्र चिमटी (डिस्क grippers) की एक जोड़ी के साथ स्वच्छ मीका की ओर, और स्कैनर पर जगह है. मीका AFM सिर एपर्चर के स्तर से नीचे होना चाहिए.

3 द्रव सेल विधानसभा और मीका भूतल की इमेजिंग

  1. द्रव सेल, हे अंगूठी, सिरिंज एडाप्टर, नली अनुकूलक, और 100% इथेनॉल में इंजेक्शन नली कुल्ला. डि पानी में तरल पदार्थ सेल कुल्ला. सभी भागों हवा पूरी तरह से सूखी.
  2. साफ तरल पदार्थ सेल पर पोर्ट में नली अनुकूलक पुश. धीरे फ्लैट अध्यक्षता चिमटी का उपयोग द्रव सेल के केंद्र खरोज में O-अंगूठी दबाएँ.
  3. जांच अनुचर क्लिप पर हल्के से वसंत प्रेस और groov से दूर बारीटिप के लिए ई.
  4. फ्लैट अध्यक्षता चिमटी से दूर सिरे से लंबी अंत पर जांच मुट्ठी. सेल के केंद्र का सामना करना पड़ टिप के साथ नाली में जांच रखें. में वसंत पुश और यह (चित्रा 1 बी) को सुरक्षित करने के लिए जांच खत्म अनुचर क्लिप को समायोजित.
  5. यह पूरी तरह से (चित्रा 1C) से मुकर रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए AFM पर दबाना की जाँच करें.
  6. द्रव सेल, हे अंगूठी प्लेस और मीका नमूना के शीर्ष पर, नीचे की ओर का सामना करना पड़ जांच. द्रव सेल AFM के स्टड पर आराम करने के लिए अनुमति दें. मंच पर द्रव सेल को स्थिर करने के लिए बंद करना कम करें. एक दृश्य निरीक्षण मजबूती से समर्थन डिस्क और द्रव सेल के बीच संकुचित हे अंगूठी से पता चलता है जब तक माइक्रोस्कोप पर नीचे स्विच दबाते.
  7. निगरानी देखते समय, स्क्रीन पर द्रव सेल के शीर्ष कल्पना करने के लिए मोटे समायोजन घुंडी ध्यान केंद्रित.
  8. एक्स / वाई समायोजन knobs और जेड उद्देश्य का उपयोग टिप की एक साफ छवि है जब तक माइक्रोस्कोप ले जाएँ. टिप app जाएगाएक धातु, स्वर्ण त्रिभुज की तरह कान. माइक्रोस्कोप पर नीचे piezo लीवर का उपयोग नमूना की सतह के करीब टिप ले जाएँ. टिप के प्रतिबिंब पर ध्यान दें. अपने प्रतिबिंब के संबंध में वास्तविक ब्रैकट का ट्रैक रखें. इस स्तर पर, वे निकट गठबंधन, लेकिन पूरी तरह से अतिव्यापी नहीं किया जाना चाहिए.
  9. एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज सिरिंज एडाप्टर संलग्न. सिरिंज एडाप्टर के लिए इजेक्शन नली के एक छोर देते हैं और बफर समाधान के कंटेनर में नली के दूसरे छोर जगह है. पूरी तरह से सिरिंज के सवार हूं.
  10. द्रव सेल पर नली एडाप्टर के लिए नली संलग्न. तरल पदार्थ पूरी तरह से केंद्र चैम्बर भरता है जब तक धीरे सवार दबाएँ. कोई हवाई बुलबुले हैं बीमा करने के लिए सेल की जाँच करें. माइक्रोस्कोप पर द्रव सेल से बाहर spilling कोई तरल पदार्थ है देखने के लिए जाँच करें. एक उठाया ठोस समर्थन पर सिरिंज रखें.
  11. स्क्रीन पर लेजर (एक फैलाना लाल डॉट) का पता लगाने के लिए कैमरा फ़ीड और एक्स / वाई अनुवाद knobs का प्रयोग करें. लेजर movem का उपयोगईएनटी नियंत्रण knobs, टिप पर लेजर चाल है.
  12. (- 6 मूल्य = 4) खुर्दबीन पर प्रदर्शित राशि संकेत अधिकतम है जब तक पतले लेजर और दर्पण नियंत्रण समायोजित.
  13. (0.1 ±) संभव के रूप में शून्य के करीब माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शित ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज deflections कम करने के लिए छोड़ दिया पीछे की ओर पर knobs और स्कैन सिर के ऊपर बाईं ओर का उपयोग वृत्त का चतुर्थ भाग डायोड के कोण समायोजित करें.
  14. सॉफ्टवेयर में अधिग्रहण के विकल्प का चयन करें. एक न्यूनतम, का चयन ऊंचाई (ट्रेस और खोजना), शिखर बल त्रुटि, और विरूपण की. अन्य विकल्पों निर्भर उपयोगकर्ता हैं और experimentalist द्वारा वांछित विशिष्ट जानकारी के आधार पर तैयार किया जा सकता है.
  15. प्रत्येक अधिग्रहण खिड़की में आर टी विमान फ़िट के लिए "रेखा" का चयन करें. ऊंचाई खिड़कियों में ओ.टी. विमान फ़िट के लिए "कोई नहीं" का चयन करें. पहले से ऐसा नहीं अगर एक्स और वाई, शून्य करने के लिए ऑफसेट और स्कैन कोण सेट करें.
  16. 1 हर्ट्ज, 256 प्रति पंक्ति नमूना, ScanAsyst ऑटो नियंत्रण के लिए स्कैन दर निर्धारितव्यक्तिगत, और बंद करने के लिए ScanAsyst ऑटो जेड सीमा तक. 500 एनएम जेड सीमा बदलें. 1 माइक्रोन के लिए स्कैन आकार सेट करें.
  17. संलग्न क्लिक करें. इस बिंदु पर, टिप सतह दृष्टिकोण. टिप आ रहा है, स्क्रीन के निचले बाएँ हाथ कोने में जेड piezo वोल्टेज परिवर्तन निरीक्षण करते हैं. टिप सीमा के बाहर चला जाता है, तो टिप और पुनः दृष्टिकोण वापस ले लें. इस असफल हो, तो टिप एक सफल दृष्टिकोण के क्रम में परिवर्तित करने की आवश्यकता हो सकती है. टिप लगी हुई है एक बार, लाइनों एक छवि रचना होगा कि अधिग्रहण खिड़कियों में से प्रत्येक पर प्रदर्शित होने के लिए शुरू कर देंगे.
  18. 1 एक्स 1 माइक्रोन में मीका के चित्र ले लो और अभ्रक सतह को साफ और सपाट है कि यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे धीरे में ज़ूम. वे दिखाई देते हैं के रूप में छवियों को बचाने के लिए निरंतर कब्जा क्लिक करें. में ज़ूम और वांछित के रूप में सतह के आसपास चाल है.

4 प्रोटीन बयान और इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करना

  1. शुद्ध प्रोटीन नमूना 38 प्राप्त करें और बर्फ पर रहते हैं. एक फ्रीजर में संग्रहीत हैं, पर नमूना पिघलना5 मिनट के लिए बर्फ.
  2. / एमएल प्रशीतित का उपयोग इमेजिंग बफर समाधान 0.0010 मिलीग्राम प्रोटीन पतला. यहां इस्तेमाल किया इमेजिंग बफर 15 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच = 8.0), 150 मिमी NaCl, और 15 मिमी 2 MgCl है.
  3. 4 चैम्बर (100 x 15 मिमी) प्रशीतित इमेजिंग बफर समाधान के साथ पेट्री डिश भरें. समाधान के कम से कम 5 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक कक्ष भरें. धीरे micropipettor से जुड़ी टिप के साथ पतला प्रोटीन समाधान मिश्रण.
  4. पहले से ही तैयार मीका की सतह को पतला प्रोटीन समाधान के 200 μl लागू करें. 30 सेकंड के बाद, परिपत्र चिमटी (डिस्क grippers) के साथ प्रोटीन / अभ्रक सतह उठा. प्रयोगशाला बेंच के लिए नमूना समानांतर पकड़ो.
  5. नमूना धारण करते हुए नमूना पेट्री डिश के बेसिन के समानांतर है कि सुनिश्चित करते हुए, तुरंत पेट्री डिश (4.2 कदम) के पहले चक्र में निहित बफर समाधान में नमूना विसर्जित कर दिया. 1 सेकंड के बाद, नमूना हटा दें.
  6. बेसिन के लिए नमूना समानांतर पकड़ करने के लिए जारीपेट्री डिश की, शेष तीन quadrants के लिए 4.5 कदम दोहराएँ.
  7. अधिक नमी सोख और माइक्रोस्कोप के मंच पर डिस्क स्थानांतरित करने के लिए एक सूखी धूल मुक्त कपड़े पर डिस्क रखें. कपड़े से वास्तविक सतह को छुआ तक नहीं. नमूना शुष्क करने की अनुमति न दें.
  8. 3.16 - दोहराएँ 3.6 कदम.

मीका पर 5 इमेजिंग प्रोटीन

  1. स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर की जांच मापदंडों बॉक्स पर क्लिक करें. स्प्रिंग आकार और टिप त्रिज्या टिप का इस्तेमाल किया जा रहा है के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए.
  2. संलग्न क्लिक करें. इसी प्रकार अभ्रक इमेजिंग प्रक्रिया (कदम 3.17) के लिए, टिप दृष्टिकोण के रूप में जेड piezo विंडो निरीक्षण करते हैं.
  3. कम से कम लगातार दो गुजरता के लिए छवि को स्कैनर एक ही क्षेत्र की अनुमति दें. एकत्र प्रत्येक छवि को बचाने के लिए निरंतर कब्जा क्लिक करें.
  4. एक नए क्षेत्र के लिए स्कैनर ले जाएँ और / या वांछित के रूप में छवि का आकार बदलने के.
  5. स्वचालित सॉफ्टवेयर का समायोजन समाप्त हो जाने के बादस्कैनिंग मापदंडों एक विशेष छवि आकार के लिए, सॉफ्टवेयर बंद कर देते हैं.
  6. मैन्युअल ठीक धुन करने के क्रम में छवि का ध्यान केंद्रित दर स्कैन, Z सीमा, लाइनों की संख्या, और वोल्टेज समायोजित. छवि बहुत दूर ध्यान से बाहर हो जाता है, मूल शुरू करने की स्थिति लौटने के लिए पीठ पर सॉफ्टवेयर बारी. एक प्रोटीन पर zooming जबकि एक छवि के संकल्प को बढ़ाने के लिए, स्कैन दर में कमी और आनुपातिक लाइनों की संख्या में वृद्धि.
  7. प्रयोग के बाद, 100% इथेनॉल के साथ तरल सेल साफ और डि एच 2 ओ से कुल्ला तरल सेल को पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें.
  8. कच्चे डेटा छवियों को संसाधित करने में डेटा सॉफ्टवेयर खोलें. सबसे पहले, समतल आइकन पर क्लिक करके छवि समतल. आदेश वें शून्य चुने और अमल क्लिक करें. छवि पर निर्भर करता है, एक विमान फिट एक उचित फ्लैट छवि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इस मामले में, विमान फिट चिह्न का चयन करें और कर्सर का उपयोग कर छवि के एक फ्लैट क्षेत्र के एक विमान को आकर्षित. निष्पादित क्लिक करें. आवश्यक के रूप में दोहराएँ
  9. एसईएलect के पार अनुभाग टैब प्रोटीन के आयाम को मापने के लिए. कर्सर के साथ एक लाइन विश्लेषण किया जा अणु या क्षेत्र पर यह कदम ड्रा. कई क्षेत्रों के लिए दोहराएँ और सॉफ्टवेयर एक ओवरले उत्पन्न होगा. चित्र या अन्य सॉफ्टवेयर और ड्राइंग कार्यक्रमों के लिए संगत प्रारूप में चित्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया डेटा निर्यात करें.

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Representative Results

इसके प्रकाश अनुकूलित राज्य में एक फोटोरिसेप्टर प्रोटीन, पी 3, के प्रतिनिधि AFM छवियों आंकड़े 3 और 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं. एक ताजा cleaved अभ्रक सब्सट्रेट (चित्रा 3 ए) प्रोटीन सोखना के लिए एक उपयुक्त, फ्लैट सतह है. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में साफ अभ्रक की एक छवि का संग्रह कई कारणों से महत्वपूर्ण है. सबसे पहले, यह तरल सेल साफ है सुनिश्चित करता है और पिछले प्रयोगों से कोई अवशिष्ट सामग्री सतह दूषित होगा. दूसरा, यह जांच की गुणवत्ता परीक्षण. जांच गंदा या विकृत है, तो इस धारियाँ के रूप में छवि में दिखाई देते हैं या शोर के रूप में खुद को पेश करेंगे. अंत में, एक साफ मीका छवि जांच उचित भविष्य प्रयोगों के लिए देखते जा सकता है की पुष्टि करता है.

एकल फोटोरिसेप्टर प्रोटीन dimers सतह कवरेज (चित्रा 3 बी, सी) उपयुक्त है अगर PeakForce QNM का उपयोग कर देखा जा सकता है. तीर व्यक्ति dimers संकेत; तारांकन एक प्रोटीन कुल अर्थ.प्रोटीन नमूना, बयान समय, और इमेजिंग बफर के ईओण ताकत की एकाग्रता सतह कवरेज प्रभाव. 23 एकल अणुओं के एक उच्च वितरण के लिए, बहुत कम बयान बार जरूरी हैं समाधान जलमिश्रित. उदाहरण के लिए, बयान दुगनी होने का समय भी बड़ा समुच्चय के एक उच्च वितरण पैदावार. प्रोटीन एकाग्रता 0.100 मिलीग्राम तक बढ़ जाती है / एमएल, फोटोरिसेप्टर की एक पतली फिल्म बयान समय संशोधित या ईओण ताकत बफर के बिना मनाया जाता है.

छवि (चित्रा 4) चपटा होने के बाद छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, प्रोटीन के पार वर्गों मापा जा सकता है. पार वर्गों की समान ऊंचाई माप के साथ XY-डेटा प्रदान करते हैं. इन माप आदि संरचनात्मक विवरण, प्रोटीन / सतह बातचीत, यांत्रिक शक्ति, XY-डेटा AFM जांच से जटिल हो सकता है प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, इस आशय एक तेज जांच का उपयोग करके कम किया जा सकता है. वास्तव में, चोजांच की बर्फ कनवल्शनफ़िल्टर्स का एक स्वीकार्य राशि और एक तेज जांच से क्षति के लिए imaged सामग्री के प्रतिरोध के बीच एक नाजुक संतुलन है. यदि आवश्यक हो तो टिप कनवल्शनफ़िल्टर्स भी उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, छवि से घटाया जा सकता है.

इन चित्रों को सीधे दोहन मोड AFM का उपयोग कर एकत्र पहले प्रकाशित छवियों की तुलना की जा सकती है. PeakForce QNM का उपयोग मीका पर पी 3 के 20 मापा आयाम दोहन मोड AFM से प्राप्त मूल्यों के 5% के भीतर हैं.

चित्रा 1
1 तरल सेल परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी चित्रा. (ए) लेजर, ब्रैकट, जांच, और सतह संरेखण. जांच और ब्रैकट तरल सेल के अंदर चिपका रहे हैं. (बी) तरल सेल. जांच, ब्रैकट, और नमूना पूरी तरह से तरल पदार्थ में डूब रहे हैं. (सी) ComplETE विधानसभा. तरल सेल एक माइक्रोमीटर से जुड़ा हुआ है. तस्वीर तरल सेल के संबंध में ऑप्टिकल सिर और स्कैनर से पता चलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2:. PeakForce मात्रात्मक Nanomechanical गुण मैपिंग यह एक छोटी सी चोटी बल के लिए एक उदाहरण है (ए) दृष्टिकोण (बी) जंप (सी) पीक बल (डी) आसंजन (ई) वापस लेना संपर्क करने के लिए.. आंकड़ा reproduced और अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था. 15

चित्रा 3 मीका पर पी 3 के 3 चित्र परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी. साफ अभ्रक (1 एक्स 1 माइक्रोन) (ए) छवि. (बी) छवि (1 माइक्रोन एक्स 1 माइक्रोन) पी 3 के अभ्रक के लिए आवेदन किया. तीर एकल प्रोटीन dimers के उदाहरण से संकेत मिलता है. तारांकन प्रोटीन dimers की कुल अर्थ. दो प्रोटीन dimers (सी) छवि (170 x 170 एनएम) एक एकल डिमर का एक तीन आयामी इनसेट साथ. कैरट इनसेट में मौजूद है जो प्रोटीन डिमर designates. सभी छवियों इमेजिंग बफर की उपस्थिति (बयान के लिए प्रोटीन एकाग्रता = 0.0010 मिलीग्राम / एमएल) में ले जाया गया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
मीका पर पी 3 के 4 चित्र पार के अनुभागीय विश्लेषण. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

AFM physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों में प्रोटीन और अन्य जैविक अणुओं इमेजिंग की पूरी तरह से सक्षम एक स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी विधि है. एक्स रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर की तुलना में, AFM की एक सीमा में एक ही संकल्प, विशेष रूप से पार्श्व संकल्प को प्राप्त करने में असमर्थता है. किसी भी सतह पर एक अणु का विश्लेषण करने के लिए AFM का उपयोग करते समय डेटा का विश्लेषण कर रहे हैं, अणु की छवि पर सतह के प्रभाव और जांच भी विचार किया जाना चाहिए. अधिग्रहीत छवि पर जांच के प्रभाव का Deconvoluting उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ पूरा किया जा सकता है. प्रयोगात्मक परिणाम के लिए तुलना करने के लिए सैद्धांतिक मॉडल का विकास भी काफी उपयोगी साबित हो सकता है.

इस पत्र में, एक जीवाणु लाल बत्ती फोटोरिसेप्टर, RpBphP3 (पी 3) की AFM छवियों, (चित्रा 3) प्रस्तुत कर रहे हैं. माइक्रोस्कोप विधानसभा और सॉफ्टवेयर आपरेशन का वर्णन कार्यरत विशेष साधन मॉडल के लिए विशिष्ट हैं, अभ्रकऔर प्रोटीन नमूना तैयार करने की प्रक्रियाओं सामान्य हैं और किसी भी AFM प्रयोग करने के लिए लागू किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण कदम अभ्रक सतह पर वांछित प्रोटीन कवरेज प्राप्त करने के क्रम में पालन किया जाना चाहिए. यह अभ्रक सतह (4.3 चरण) को लागू करने से पहले सबसे पहले, पतला प्रोटीन समाधान धीरे मिश्रित किया जाना चाहिए. कारण पी 3 के उच्च आणविक वजन करने के लिए, जमा समाधान काफी कोलाइडयन है; इसलिए, पी 3 समाधान गैर सजातीय बनाने में समय के साथ ट्यूब के नीचे करने के लिए मिलता है. एक सज्जन हलचल उपचार इस मुद्दे. प्रोटीन लागू किया जाता है एक बार दूसरे, सतह किसी भी शिथिल बाध्य अणुओं (- 4.6 4.5 कदम) को हटाने के लिए rinsed होना चाहिए. शिथिल बाध्य पी 3 सतह पर रहता है तरल सेल बफर समाधान के साथ भरा और / या प्रयोग के दौरान AFM जांच द्वारा उठाया जाता है, अणु या तो समाधान में जारी किया जाएगा. इन घटनाओं से दोनों एक सफल इमेजिंग प्रयोग में बाधा. यदितरल सेल पी 3 के साथ दूषित हो जाता है, यह disassembled किया जाना चाहिए और अच्छी तरह से साफ कर दिया. AFM जांच एक अणु को चुनता है, यह आम तौर पर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए या छवि गुणवत्ता बलिदान है. अंत में, प्रोटीन नमूना rinsing की विधि उत्कृष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. मीका पी 3 के लिए एक गैर चयनात्मक सतह है; इसलिए, अणुओं बेतरतीब ढंग से उन्मुख हो पाया जाना चाहिए. प्रोटोकॉल में वर्णित rinsing की विधि एक ही अभिविन्यास में सतह पर अणुओं उलटफेर से बचने के लिए एक ही रास्ता है. चाबी हमेशा गीला नमूना रखने के लिए और कोण पर सतह पकड़े और सचमुच बफर के साथ सतह छिड़काव से बचने के लिए है. नमूना यह एक पेट्री डिश के बेसिन के समानांतर पकड़े, सूई से rinsed है, तो बफर समाधान के बल धाराओं से सतह पर पी 3 के विरूपण कम से कम है.

तरल सेल, जांच, स्कैनर, और ऑप्टिकल सिर के कुछ हिस्सों की सभी बहुत नाजुक हैं और सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए. Sprinस्कैनर और ऑप्टिकल सिर पकड़ कि जीएस एक साथ बहुत मजबूत हैं. यह कोडांतरण या टुकड़े के किसी भी dissembling जब स्कैनर पर हाथ रखने के लिए आवश्यक है. प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में मूल स्कैन आकार 1 माइक्रोन (कदम 3.16) अगर ScanAsyst सॉफ्टवेयर के साथ पीएफ-QNM के लिए, यह जेड सीमा के स्वचालित सॉफ्टवेयर नियंत्रण बंद कर देते हैं और कम से कम 500 एनएम के लिए इस मूल्य निर्धारित करने के लिए आवश्यक है . यह सतह अप्रत्याशित रूप से किसी न किसी तरह हो गया है या दूषित हो गया है अगर स्कैनर की सुरक्षा करता है. एक एकल छवि एकत्र किया गया है और यह imaged क्षेत्र चिकनी है कि पुष्टि होती है, जेड सीमा उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए नीचे मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है. यह स्कैनर सतह के एक नए क्षेत्र के लिए ले जाया जाता है जब या टिप किसी भी कारण से मुकर जाता है तो कम से कम 500 एनएम वापस जेड सीमा मरम्मत करने के लिए महत्वपूर्ण है.

इस पत्र उच्च गुणवत्ता स्थलाकृतिक छवियों को प्राप्त करने के लिए पीएफ-QNM के प्रयोग पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जबकि विधि अपने आप में एक प्रदान कर सकते हैंयांत्रिक शक्ति और सतह संरचनाओं के लचीलेपन के बारे में अतिरिक्त जानकारी के पुस्तकालय. यह सुविधा केवल प्रयोग के दौरान उचित चैनलों का चयन करके कार्यक्षमता के बारे में आगे अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. 16,18 जमा समाधान और / या सतह की एकाग्रता के लिए उपयुक्त परिवर्तन के साथ, इस विधि की जांच के लिए पीएफ-QNM प्रयोग करने के लिए सामान्य हो सकता है तरल सेल AFM द्वारा जैविक अणुओं. सॉफ्टवेयर के स्वचालित मदद से, AFM के साथ कोई पूर्व अनुभव के साथ उच्च स्तर के विज्ञान के पाठ्यक्रमों में छात्रों को पारंपरिक दोहन मोड AFM के साथ की तुलना में अधिक तेजी से एक तरल सेल AFM प्रयोग पूरा कर सकते हैं. छात्रों AFM की बुनियादी बातों का अनुभव और एक ठेठ 3 के भीतर इस शक्तिशाली तकनीक द्वारा संभव बनाया अंतःविषय अनुसंधान का स्वाद ले सकते हैं - 4 घंटा प्रयोगशाला खंड समय की कमी.

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Acknowledgments

NSF-एमआरआई कार्यक्रम (चे: 1229103) नई नियंत्रण इलेक्ट्रॉनिक्स, सॉफ्टवेयर, तरल कोशिकाओं, और एक दोहरी AFM / एसटीएम इकट्ठा करने के लिए आवश्यक अन्य उपकरणों की खरीद के वित्तपोषण के लिए स्वीकार किया है. हम AFM उपकरण, प्रशिक्षण, और इमेजिंग के साथ सहायता के लिए शिकागो NSF-MRSEC कार्यक्रम के विश्वविद्यालय (DMR-0820054) पर साझा सुविधाओं को स्वीकार करते हैं, और साधन समय के लिए सामग्री अनुसंधान सुविधाएं नेटवर्क (DMR-0820054) द्वारा उपलब्ध कराया. हम विशेष रूप से हमारे परिसर में आवश्यक इंस्ट्रूमेंटेशन लाया कि NSF-एमआरआई प्रस्ताव के वित्त पोषण से पहले हमारे छात्रों के स्वागत के लिए डॉ Qiti गुओ, डॉ जस्टिन Jureller, और प्रो का यी ली को धन्यवाद. उपभोज्य आपूर्ति के लिए गर्मियों में शोध छात्रों और संकाय के लिए छात्रवृत्ति के रूप में भी सहायता प्रदान की है कि पूर्वोत्तर इलिनोइस विश्वविद्यालय के लिए सम्मानित किया: (P031C110157 आईडी) हम एक शीर्षक III स्टेम अनुदान से धन स्वीकार करते हैं. अंत में, हम जारी रखा वाद्य समर्थन के लिए और अनुसंधान करने की अनुमति के लिए Bruker नैनो, इंक स्वीकार करते हैंPeakForce QNM के तंत्र दिखा एक साजिश eproduce और स्वचालित सॉफ्टवेयर का वर्णन करने के लिए शब्द ScanAsyst उपयोग करने के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl Fisher Scientific O4997-100
NaCl Acros Organics 7647-14-5
MgCl2 Acros Organics 7791-18-6
Multimode 8 AFM Bruker-Nano 492-008-011 equipped with Nanoscope V controller and J scanner
Probe Bruker-Nano SNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Tapping Mode Fluid Cell Bruker-Nano MTFML
Mica V-4 Grade SPI supplies 1150503 25 x 25 x .26 mm
Sample support disk nanoSurf BT02236
Petri dish Plasta-Medic, Inc. 100 mm x 15 mm 
micropipettors Denville Scientific XL 3000i
RpBphP3 Prepared according to cited references
Nanoscope software Bruker-Nano
Fiber Optic Light Digital Instruments Inc. F0-50
Pelco AFM Disc Gripper Ted Pella Inc 1668 12 mm
1 ml syringe McKesson 102-ST1C
Eppendorf tubes Denville Scientific C2171
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 Schrodinger, LLC

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References

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Kroeger, M. E., Sorenson, B. A., Thomas, J. S., Stojković, E. A., Tsonchev, S., Nicholson, K. T. Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping. J. Vis. Exp. (92), e52164, doi:10.3791/52164 (2014).

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