Abstract
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) משתמש בקצה פירמידה צמוד לשלוחה כדי לחקור את תגובת הכוח של פני השטח. הסטיות של הקצה ניתן למדוד ל~ 10 PN על ידי לייזר וגלאים סקטוריאלית, הניתן להמרה לטופוגרפית תמונה. אפנון משרעת או AFM "מצב קשה" כרוך הבדיקה ביצירת קשר רציפה עם פני השטח בעת נדנוד בתדר התהודה שלה כדי לייצר תמונה. הפועל בשיתוף עם תא נוזל, הקשה מצב AFM מאפשר ההדמיה של מקרומולקולות ביולוגיות כגון חלבונים בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. הקשה במצב AFM דורש כוונון ידני של הבדיקה והתאמות תכופות של מספר רב של פרמטרים סריקה שיכולה להיות מאתגר עבור משתמשים לא מנוסים. כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה, התאמות אלה הן לצרוך הזמן ביותר.
PeakForce כמותי nanomechanical נכס המיפוי (PF-QNM) מייצר תמונה על ידי מדידת respon כוחעקומת se לכל נקודת מגע עם המדגם. עם תוכנת ScanAsyst, יכול להיות אוטומטי PF-QNM. תוכנה זו מתאימה את תדירות כונן הגדרת נקודה,, קצב סריקה, רווחים, ופרמטרי סריקה חשובים אחרים באופן אוטומטי למדגם נתון. לא רק שתהליך זה להגן על שני בדיקות ודגימות שבירות, זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהות. PF-QNM תואם להדמית AFM בנוזל; לכן, יש לה יישום נרחב הדמיה חומרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית.
השיטה המוצגת במאמר זה מתארת את היישום של PF-QNM כדי להשיג תמונות של קולטי אור אורות אדומים בקטריאלי, RpBphP3 (P3), מר 'הפוטוסינתזה palustris במדינה מותאם האור שלה. באמצעות שיטה זו, הדימרים בודדים חלבון של P3 ואגרגטים של הדימרים נצפו על משטח נציץ בנוכחות חיץ הדמיה. עם התאמות מתאימות למשטח ו / או ריכוז פתרון, שיטה זועשוי בדרך כלל להיות מיושם על מקרומולקולות הרלוונטית מבחינה ביולוגית אחרת וחומרים רכים.
Introduction
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הפך לכלי חשוב מאוד עבור חוקר את התכונות המבניות ומכאניות של משטחים, דקים סרטים, ומולקולות בודדות מאז המצאתו בשנת 1986 (איור 1). 1-3 שימוש בנוזל תא, יש לו את השיטה להיות שימושי במיוחד במחקרים של מקרומולקולות ביולוגיות ותאים גם חיים בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. 4-10 מצב הקשה AFM באופן מסורתי משמש להדמית חומרים רכים או מולקולות קשורות באופן רופף למשטח, מאז AFM קשר מצב הוא בדרך כלל לא מתאים בשל לנזק שנגרם על ידי הכוחות לרוחב המופעל על המדגם על ידי שלוחה. 11 AFM טאפינג מצב מפחית באופן משמעותי את הכוחות האלה על ידי כך את הקצה לסירוגין לגעת במשטח ולא להיות בקשר הרציף. במצב זה, השלוחה נעה ליד או תדר התהודה שלה רגיל אל פני השטח. באופן דומה ליצור קשר עם מצב AFM, טופוגרפיה היא אנאליyzed על ידי התוויית התנועה של z-piezo כפונקציה של XY (מרחק).
דינמיקת שלוחה יכולה להיות די יציבה ליד או תהודה; לכן, הם מאוד מאתגרים כדי להפוך מחוץ למצב "מצב יציב". באופן ספציפי, דינמיקה אלה תלויים בשני מאפייני המדגם וסביבת סריקה. למולקולה רכה שנספחה למשטח קשה (ER), לולאת משוב מכוונת היטב למולקולה עשויה להוביל לתנודת משוב למשטח. מבצע בנוזל מסבך עוד יותר את הכוונון של שלוחה. שינויים ברמות טמפרטורה או הנוזל דורשים הסתגלות מתמדת של נקודת סט, רווחים, ופרמטרי הדמיה אחרים. התאמות אלו נוטות להיות זמן רב ומאתגר עבור משתמשים מאוד.
שיא הכוח כמותי nanomechanical נכס מיפוי (PF-QNM), כמו ההקשה AFM מצב, נמנע מאינטראקציות לרוחב על ידי לסירוגין פנייה המדגם (איור 2). 12-15 </ Sup> עם זאת, PF-QNM פועל במצב ותדרים נמוכים בהרבה מAFM הקשה במצב שאינו מהדהדים. זו מבטלת את אתגרי הכוונון של הקשה במצב AFM, במיוחד אלה החריפו על ידי הנוכחות של נוזל. עם PF-QNM, תמונות נאספות על ידי לקיחת עקומת כוח תגובה בכל נקודת המגע. עם התוספת של תוכנת ScanAsyst, 15 התאמה של הפרמטרים הסריקה יכולה להיות אוטומטית ותמונה ברזולוציה גבוהה שהושגה בעניין של דקות על ידי אפילו משתמשים לא מנוסים. ברגע שהמשתמש הופך להיות מוכר יותר עם AFM, את כל הפרמטרים האוטומטיים או כל עשוי להתבטל בכל עת שמתירה בניסויים כדי לכוונן את איכות התמונה באופן ידני. מאז הקמתה, PF-QNM הוחל על מפת bacteriorhodopsin, חלבון קרום, וחלבוני ילידים אחרים ברמת submolecular. 16-18 לbacteriorhodopsin, קיים מתאם ישיר בין גמישות החלבון ורנטגן מבנים קריסטלוגרפיים. PF 12 -QNM נוצל כדי לחקור תאי חיים עם רזולוציה גבוהה. 19,20 קשרים חשובים יתר על כן, נתוני PF-QNM יש הובהרו בין המבנה ומכניקה בתוך הקרום כדורית אדומה שהם קריטיים לשלמות תא ותפקודו. 21
יש לנו עובדי מיקרוסקופיית שיטות (SPM), 22 כוללים AFM, 23 כדי לחקור את המבנה של האורות האדום קולטני אור הנקרא bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 הם מורכבים של מודול חישת אור קוולנטית קשור למודול איתות-מפעיל כזה כקינאז היסטידין (HK). 26 מודול אור החישה בדרך כלל מכיל chromophore בלעין, שעובר שינוי מבני על קליטה של פוטון, עם שורה של שינויים מבניים שהגיעו למודול איתות-מפעיל ומוביל לשינוי גלובלי של כל החלבון . 24,27-29 בהתבסס על השינוי הזה, יש שני של אור מובחן קליטהtates של BphPs, מדינת אור קליטה אדומה ומרחיקה אדומה, מסומן כPr וPFR. Pr הוא מדינה יציבה תרמית, כהה מותאם עבור רוב BphPs. 28 הבסיס המולקולרי של photoconversion Pr / PFR אינו מובן לחלוטין בשל ידע מבני מוגבל של החלבונים האלה. למעט מבנה אחד מד radiodurans, 30 כל המבנים קריסטלוגרפיים רנטגן שפורסם של חלבונים אלה נמצאים במצב הכהה מותאמת וחסרי תחום מפעיל. BphPs שלם הם גדול מדי כדי להיחקר ביעילות על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וקשה לשמצה להתגבש בצורה שלמה שלהם (במיוחד במדינה מותאמת האור) לקריסטלוגרפיה רנטגן. לאחרונה BphPs כבר מהונדס כסמני חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום (של IFP). ביום 31 באפיון מבני של חלבונים אלה יכול לקדם את הסיוע בעיצוב IFP יעיל. 32-36
המוקד של מאמר זה הוא להציג הליךהדמיה של BphPs באמצעות AFM נוזל תאים באמצעות PF-QNM. השיטה באה לידי ביטוי במחקרים של המדינה מותאמת אור RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) מחיידק הפוטוסינתזה ר ' palustris. הליך AFM מוצג כאן הוא גישה נוחה וישירה להדמיה של חלבונים, כמו גם מקרומולקולות ביולוגיות אחרות. בשיטה זו, פרטים מבניים של מולקולות בודדות יכולים להיות שנאספו בפרק זמן קצר, בדומה למפגש מעבדה קורס במדע ברמה עליונה. דרך מדידת חתכים והשלמת ניתוחים ממדיים נוספים, ניתן להשוות נתונים ניסיוניים למודלים חישוביים שימושיים. 37-42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 מחשב ומיקרוסקופ הגדרה
- פתח את השסתום של גליל N 2 ולהתאים את הידיות על מנת להבטיח את שולחן האוויר הוא צף ורמה.
- הפעל את המחשב, בקר, ואור סיבים האופטי בצו זה.
- הגדר את הסורק למצב / LFM AFM ולמרכז את המצלמה על ראש AFM.
- תוכנה פתוחה. קטגוריה בחר ניסוי "nanomechanical מאפיינים", "כמותי nanomechanical מיפוי" תחת קבוצת ניסוי, ו" PeakForce QNM בנוזל "תחת ניסוי. לחץ ניסוי טען ולאחר מכן התקנה.
- מקד את המצלמה באמצעות אובייקטיבי Z כדי לראות את פני השטח של השלב. Piezos בשימוש הגס למעלה / למטה לעבור השלב כ 1 מ"מ מתחת לפני השטח של צמצם ראש AFM.
2 הכנת משטח נציץ
- לחץ מדבקה הדבקה על הפנים של דיסק נקי תמיכת מדגם (קוטר 15 מ"מ, 0.8 מ"מ עובי). לדחוף V-4 נציץדיסק כיתה (25 x 25 x 26 מ"מ) על גבי הדבק עד מחובר היטב.
- לשפשף את חתיכת סרט ברור על נציץ להבטיח שהוא דבק באופן מלא עם אין בועות אוויר. משוך את הקלטת מיציץ מצד אחד וללהעיף אותו באופן שווה. חזור במידת צורך כדי להבטיח נציץ הוא שטוח.
- גריפ דיסק התמיכה, צד נקי נציץ למעלה, עם פינצטה העגולה (grippers דיסק), ואת המקום על גבי הסורק. נציץ צריך להיות מתחת לרמה של צמצם ראש AFM.
עצרת תא .3 נוזלים והדמיה של משטח נציץ
- יש לשטוף את תא הנוזל, O-טבעת, מתאם מזרק, מתאם צינור, ואת צינור הפליטה ב100% אתנול. יש לשטוף את תא הנוזל במים די. בואו כל אוויר החלקים להתייבש לחלוטין.
- דחוף את מתאם הצינור ליציאה בתא הנוזל הנקי. לחץ בעדינות על O-הטבעת לתוך מגרעת מרכז תא הנוזל באמצעות פינצטה בראשות שטוחה.
- לחץ על האביב בקלילות על קליפ המקדמה בדיקה ולהפוך אותה מgroovדואר על הטיפ.
- לתפוס את החללית בסוף הארוך מהקצה עם פינצטה בראשות שטוחה. מניחים את החללית לתוך החריץ עם הקצה מול מרכז התא. לדחוף את האביב ובלהתאים את סרטון המקדמה על הבדיקה כדי לאבטח אותו (איור 1).
- בדוק את המהדק על AFM כדי לוודא שהוא חזר בו באופן מלא (איור 1 ג).
- הנח את תא נוזל, O-הטבעת ולחקור פונה כלפי מטה, על גבי המדגם נציץ. לאפשר תא הנוזל לנוח על החתיכים של AFM. מנמיכים את המהדק כדי לייצב את תא הנוזל על הבמה. לחץ למטה המתג על המיקרוסקופ עד בדיקה ויזואלית מציגה את O-הטבעת הדחוסה בחוזקה בין דיסק התמיכה ותא הנוזל.
- בעת הצפייה בצג, להתמקד כפתור הכוונון הגס כדי להמחיש את חלקו העליון של תא הנוזל על המסך.
- הזז את מיקרוסקופ עד שיהיו תמונה ברורה של הקצה באמצעות X / כפתורי התאמת Y ואובייקטיבי Z. טיפ יהיה appאוזן כמו משולש מתכתי, זהב. להזיז את הקצה קרוב יותר אל פני השטח המדגם באמצעות מנוף piezo על מיקרוסקופ. להתמקד בהשתקפות של הקצה. עקוב אחר שלוחה בפועל ביחס להשתקפות שלה. בשלב זה, הם צריכים להיות מתואמים באופן הדוק, אך לא חופף לחלוטין.
- חבר את מתאם המזרק למזרק 1 מ"ל סטרילי. חבר קצה אחד של צינור הפליטה למתאם המזרק ומניח את הקצה השני של הצינור במכל של תמיסת חיץ. באופן מלא להאריך את הבוכנה של המזרק.
- צרף את הצינור למתאם הצינור בתא הנוזל. לחץ בעדינות את הבוכנה עד נוזל ממלא את התא במרכז באופן מלא. בדוק את התא על מנת להבטיח שאין בועות אוויר. בדוק שאין נוזל נשפך החוצה מתא הנוזל על מיקרוסקופ. הנח את המזרק על תמיכה מוצקה שהועלתה.
- השתמש בהזנת המצלמה וX / ידיות תרגום Y כדי לאתר את הלייזר על המסך (נקודה אדומה מפוזרת). שימוש בmovem הלייזרכפתורי בקרת ent, להעביר את הלייזר על הקצה.
- דק להתאים את בקרות לייזר ומראה עד אות הסכום מוצג במיקרוסקופ מוגדלת (ערך = 4 - 6).
- התאם את הזווית של דיודה רבע באמצעות הכפתורים בצד האחורי השמאלי והצד השמאלי העליון של ראש הסריקה כדי להוריד את הסטיות אנכיות ואופקיות המוצגות במיקרוסקופ הקרוב לאפס ככל האפשר (± 0.1).
- בתוכנה, לבחור אפשרויות רכישה. לכל הפחות, גובה בחר (בוחן הלוך ושוב), שגיאת שיא כוח, ועיוות. אפשרויות האחרות הן שימוש תלוי ויכולות להיות מותאמות אישית המבוססות על המידע הספציפי הרצוי על ידי בניסויים.
- בחר באפשרות "קו" לRT מטוס Fit בכל חלון רכישה. בחר באפשרות "אף אחד" לOT מטוס Fit בחלונות הגובה. הגדר את X ו Y לקזז וזווית סריקה לאפס, אם לא עשו.
- הגדר את קצב הסריקה להרץ 1, המדגם בכל שורה ל256, השליטה האוטומטית ScanAsystלאדם, וגבול Z האוטומטי ScanAsyst לכבוי. לשנות את גבול Z 500 ננומטר. הגדר את גודל סריקה עד 1 מיקרומטר.
- לחץ לעסוק. בשלב זה, את הקצה מתקרב למשטח. בעוד הקצה מתקרב, להתבונן שינוי מתח piezo Z בפינה השמאלית התחתונה של המסך. אם הקצה הולך מחוץ לטווח, למשוך את הקצה ומחדש את הגישה. אם זה לא מוצלח, טיפ ייתכן שיהיה הצורך לשנות כדי שתהיה לי גישה מוצלחת. ברגע שהקצה עוסק, הקווים יתחילו להופיע בכל אחד מחלונות הרכישה שמרכיבים תמונה.
- קח את התמונות של נציץ ב1 x 1 מיקרומטר ולהתקרב לאט כדי להבטיח שהמשטח נציץ נקי ושטוח. לחץ לכידה רציפה כדי לשמור תמונות כפי שהם מופיעים. להתקרב ולנוע על פני השטח כרצונכם.
.4 חלבון הפקדת והכנת הדוגמה להדמיה
- להשיג מדגם חלבון מטוהר 38 ולשמור על קרח. אם מאוחסן במקפיא, להפשיר מדגם עלקרח למשך 5 דקות.
- לדלל את החלבון ל0.0010 מ"ג / פתרון חיץ ההדמיה מ"ל באמצעות קירור. חיץ ההדמיה המשמש כאן הוא 15 מ"מ טריס-HCl (pH = 8.0), 150 mM NaCl, ו15 מ"מ MgCl 2.
- מלא קאמרי 4 (100 x 15 מ"מ) צלחת פטרי עם פתרון חיץ הדמיה בקירור. ממלא כל תא עם לפחות 5 מ"ל של תמיסה. בעדינות מערבב את פתרון חלבון המדולל בקצה המחובר לmicropipettor.
- החל 200 μl של פתרון החלבון המדולל אל פני השטח של נציץ כבר מוכנים. לאחר 30 שניות, להרים את פני השטח חלבון / נציץ עם פינצטה העגולה (grippers דיסק). החזק מקביל מדגם לספסל המעבדה.
- בעוד מחזיק את המדגם, לטבול מייד המדגם בפתרון החיץ כלול ברבע הראשון של צלחת פטרי (צעד 4.2), תוך הבטחה כי המדגם מקביל לאגן של צלחת פטרי. לאחר 1 שניות, להסיר את המדגם.
- ממשיך להחזיק במקביל המדגם לאגןשל צלחת פטרי, חזור על שלב 4.5 במשך שלושת רבעים הנותרים.
- מניחים את הדיסק על בד נטול אבק יבש כדי לספוג את הלחות עודפת ולהעביר את הדיסק על הבמה של מיקרוסקופ. אל תיגע במשטח בפועל עם המטלית. אל תאפשר המדגם לייבוש.
- חזור על שלבים 3.6-3.16.
.5 הדמיה חלבונים על מיכה
- לחץ על תיבת סימון פרמטרים בצד שמאל של המסך. גודל באביב וברדיוס קצה צריכים להיות מוגדר המבוססים על שימוש הקצה.
- לחץ לעסוק. באופן דומה לתהליך ההדמיה נציץ (שלב 3.17), לקיים את חלון z-piezo כגישות קצה.
- לאפשר לסורק תמונה באותו האזור לפחות שני מעברים רצופים. לחץ לכידה רציפה כדי לשמור כל תמונה שנאסף.
- הזז את הסורק לאזור חדש ו / או לשנות את גודל התמונה בהתאם לצורך.
- לאחר שהתוכנה האוטומטית סיימה התאמהפרמטרים סריקה לגודל תמונה מסוים, להפוך את התוכנה משם.
- באופן ידני להתאים את קצב סריקה, גבול z, מספר הקווים, ומתח על מנת לכוונן את המיקוד של התמונה. אם התמונה הופכת להיות יותר מדי מחוץ לפוקוס, פונה תוכנה שוב על להחזיר את המצב ההתחלתי המקורי. כדי להגדיל את הרזולוציה של תמונה, תוך התקרבות על חלבון, להקטין את קצב הסריקה ולהגדיל את מספר הקווים באופן יחסי.
- לאחר הניסוי, לנקות את נוזל התא עם 100% אתנול ולשטוף עם DI H 2 O. לאפשר נוזל התא לייבוש מלא.
- פתח את תוכנת נתונים לעיבוד תמונות נתונים גולמיים. ראשית, לשטח את התמונה על ידי לחיצה על הסמל לשטח. בחר אפס ה סדר ולחץ על ביצוע. בהתאם לתמונה, מטוס בכושר עשוי להיות נחוץ כדי להשיג תמונה כראוי שטוחה. במקרה זה, בחר את הסמל בכושר מטוס ולצייר מטוס של אזור שטוח של התמונה באמצעות הסמן. לחץ לבצע. חזור על פי צורך
- Select כרטיסיית החתך כדי למדוד את הממדים של החלבון. צייר קו עם הסמן להזיז אותו על פני המולקולה או האזור כדי להיות מנותח. חזור על פעולה עבור מספר אזורים והתוכנה תפיק כיסוי. לייצא את התמונה או את הנתונים המשמשים ליצירת תמונה בפורמט תואם לתוכניות תוכנה וציור אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות AFM נציג של חלבון קולטי אור, P3, במצב מותאם האור שלה מוצגות בתרשימים 3 ו -4. מצע טרי ביקע נציץ (איור 3 א) הוא משטח מתאים, שטוח לחלבון ספיחה. איסוף תמונה של מיקה נקייה כביקורת שלילית הוא חשוב מכמה סיבות. ראשית, הוא מבטח את תא הנוזל נקי ולא חומרים שיורית מניסויים קודמים יזהמו את פני השטח. שנית, הוא בודק את איכות הבדיקה. אם הבדיקה היא מלוכלכת או מעוות, זה יופיע בתמונה כפסים או להציג את עצמה כרעש. לבסוף, תמונה נציץ נקייה מאשרת את הבדיקה יכולה להיות מכוונת כראוי לניסויים עתידיים.
ניתן לצפות הדימרים חלבון קולטי אור יחיד באמצעות PeakForce QNM אם כיסוי פני השטח הוא מתאים (איור 3 ב, ג). חיצים לאותת הדימרים פרט; הכוכבית מציינת המצרפי חלבון.ריכוז של מדגם החלבון, זמן בתצהיר, והחוזק היוני של חיץ ההדמיה להשפיע כיסוי פני השטח. 23 להפצה גבוהה של מולקולות בודדות, מאוד לדלל פתרונות עם פעמים בתצהיר קצרות נדרשות. לדוגמא, הכפלת הזמן בתצהיר מניבה הפצה גבוהה של אגרגטים גדולים עוד יותר. אם ריכוז החלבון מוגבר ל0.100 מ"ג / מ"ל, סרט דק של קולטני אור הוא ציין מבלי לשנות את הזמן בתצהיר או חיץ כוח יוני.
שימוש בתוכנת ניתוח תמונה, החתכים של החלבונים ניתן למדוד לאחר התמונה היא שטוחה (איור 4). החתכים לספק XY-נתונים עם מדידות גובה מקבילה. מדידות אלה יכולים לשמש כדי לספק פרטים מבניים, אינטראקציות חלבון / משטח, חוזק מכאני, וכו 'xy-נתונים עשויים להיות מפותלים על ידי חללית AFM; עם זאת, השפעה זו ניתן למזער על ידי שימוש בבדיקה חדה יותר. למעשה, choקרח של בדיקה הוא איזון עדין בין כמות מקובלת של פיתול וההתנגדות של חומר הדמיה לנזק על ידי בדיקה חדה. פיתול עצה גם עשוי להיות מופחת מהתמונה, במידת צורך, על ידי שימוש בתוכנה מתאימה.
תמונות אלו ניתן להשוות באופן ישיר לתמונות שפורסמו בעבר שנאסף באמצעות AFM הקשה מצב. 20 ממדים הנמדדים של P3 על נציץ באמצעות PeakForce QNM הם בתוך 5% מהערכים שהושגו עם AFM הקשה במצב.
איור 1 Liquid-Cell מיקרוסקופית כוח אטומי. (א) בלייזר, שלוחה, בדיקה, ופני שטח יישור. הבדיקה והשלוחה הם מודבקים בתוך התא הנוזלי. תא נוזלי (B). הבדיקה, שלוחה, והמדגם שקוע לחלוטין בנוזל. (C) Complההרכבה ete. נוזל התא מחובר למיקרומטר. התמונה מראה את הראש האופטי וסורק במערכת יחסים לנוזל התא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. PeakForce כמותי nanomechanical נכס מיפוי זה הוא איור לשיא כוח קטן (א) קפיצת גישה (ב ') לפנות הידבקות (C) שיא כוח (ד) (ה) לחזור בו.. הדמות שוחזר והותאמה באישור. 15
איור 3 מיקרוסקופית כוח אטומי של P3 על מיכה. תמונה () נציץ נקי (1 x 1 מיקרומטר). (ב ') תמונה (מיקרומטר 1 x 1 מיקרומטר) של P3 להחיל נציץ. החיצים מצביעים על דוגמאות של הדימרים חלבון יחידים. הכוכבית מציינת כוללת של הדימרים חלבון. תמונה (C) (170 x 170 ננומטר) של שני הדימרים חלבון עם הבלעה תלת ממדית של דימר יחיד. תו מציין שהחלבון דימר קיים בהבלעה. כל התמונות צולמו בנוכחות חיץ ההדמיה (ריכוז חלבון = 0.0010 מ"ג / מ"ל לתצהיר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 חתך ניתוח של P3 על מיכה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM הוא שיטת מיקרוסקופיית מסוגלת הדמיה חלבונים ומקרומולקולות ביולוגיות אחרות בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית באופן מלא. בהשוואה לקריסטלוגרפיה רנטגן וNMR, מגבלה אחת של AFM היא חוסר יכולתה כדי להשיג את אותה הרזולוציה, במיוחד ברזולוציה לרוחב. בעת השימוש בAFM לנתח מולקולה על כל משטח, ההשפעה של פני השטח והבדיקה על התמונה של המולקולה צריכה גם לקחת בחשבון כאשר הנתונים מנותחים. Deconvoluting של ההשפעה של הבדיקה על התמונה שנרכשה עשוי להסתיים עם תוכנה מתאימה. פיתוח מודלים תיאורטיים כדי להשוות לתוצאה ניסיונית יכול גם להוכיח להיות שימושי למדי.
במאמר זה, תמונות AFM של האורות אדומים קולטי אור בקטריאלי, RpBphP3 (P3), מוצגות (איור 3). בעוד התיאורים של ההרכבה מיקרוסקופ ותפעול התוכנה ספציפיים לדגם מכשיר המסוים מועסק, נציץונהלי הכנת מדגם חלבון הם כלליים ויכולים להיות מיושמים על כל ניסוי AFM.
כמה שלבים קריטיים של פרוטוקול זה חייבים להיות אחריו על מנת להשיג את כיסוי החלבון הרצוי על פני השטח נציץ. ראשית, פתרון החלבון המדולל חייב להיות בעדינות מעורב לפני שהוא מוחל על פני השטח נציץ (שלב 4.3). בשל המשקל המולקולרי הגבוה של P3, פתרון ההפקדה הוא די colloidal; לכן, P3 ישקע לתחתית של התחתית לאורך הזמן מה שהופך את הפתרון הלא הומוגנית. תרופות ומערבבים בעדינות בנושא זה. שנית, ברגע שהחלבון מוחל, המשטח יש לשטוף כדי להסיר כל מולקולות מאוגדות באופן רופף (שלב 4.5-4.6). אם P3 קשור באופן רופף נשאר על פני השטח, המולקולות תשוחרר גם לפתרון כאשר נוזל התא מלא בפתרון חיץ ו / או נאסף על ידי הבדיקה AFM במהלך הניסוי. שני אירועים אלה לעכב ניסוי הדמיה מוצלח. אםנוזל התא הופך מזוהם עם P3, זה חייב להיות מפורק ולנקות ביסודיות. אם הבדיקה AFM מרימה מולקולה, זה בדרך כלל יש להחליף או איכות תמונה הוא הקריב. לבסוף, השיטה של שטיפת מדגם החלבון היא קריטית לקבלת תמונות מצוינות. מיכה הוא משטח הלא סלקטיבי לP3; לכן, יש למצוא המולקולות להיות מכוון באופן אקראי. השיטה של שטיפה מתוארת בפרוטוקול היא אחת דרכים להימנע מארגון מחדש של המולקולות על פני השטח לכיוון אחד ויחיד. המפתח הוא תמיד לשמור על המדגם רטוב ולהימנע מהחזקת המשטח בזווית, פשוטו כמשמעו, ריסוס המשטח עם חיץ. אם המדגם הוא שטף על ידי טבילה, כשהוא אוחז אותו במקביל לאגן של צלחת פטרי, העיוות של P3 על פני השטח על ידי זרמי כוח של פתרון החיץ ממוזערת.
כל החלקים לתא הנוזל, בדיקה, סורק, והראש אופטי הם מאוד עדינים ויש לטפל בם בזהירות. Springs שמחזיק את הסורק וראש אופטי ביחד הם חזקים מאוד. זה הכרחי כדי לשמור את ידו על הסורק כאשר הרכבה או מעמיד פן, כל אחת מהחתיכות. לPF-QNM עם תוכנת ScanAsyst, כפי שתואר בפרוטוקול, זה חיוני כדי לכבות את שליטת תוכנה האוטומטית של Z-הגבול וגדר ערך זה לפחות 500 ננומטר אם גודל הסריקה המקורי הוא 1 מיקרומטר (שלב 3.16) . זה מגן על הסורק, אם פני השטח הפכו באופן בלתי צפוי מחוספס או הפך מזוהם. ברגע שתמונה אחת כבר נאספה והוא אישר כי אזור הדמיה הוא חלק, Z-המגבלה עשויה להיות מותאמת כלפי מטה באופן ידני כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהות יותר. זה חיוני כדי להתקין מחדש את Z-הגבול בחזרה ללפחות 500 ננומטר כאשר הסורק עבר לאזור חדש של פני השטח, או אם הקצה הוא חזר מכל סיבה.
בעוד מאמר זה התמקד בשימוש PF-QNM כדי להשיג תמונות טופוגרפיות באיכות גבוהה, השיטה עצמה יכולה לספקספרייה של מידע נוסף על החוזק והגמישות של מבני משטח מכאניים. תכונה זו יכולה להוביל לתובנות נוספות על הפונקציונליות פשוט על ידי בחירת הערוצים המתאימים במהלך הניסוי. 16,18 עם שינויים מתאימים לריכוז של פתרון ההפקדה ו / או המשטח, שיטה זו יכולה להיות כללית לשימוש PF-QNM לחקור מקרומולקולות ביולוגיות על ידי AFM נוזל התא. בעזרתו האוטומטית של תוכנה, תלמידים בקורסים למדע ברמה העליונה ללא ניסיון קודם עם AFM יכולים להשלים ניסוי AFM נוזל תאים הרבה יותר מהר מאשר עם AFM הקשה מצב המסורתי. תלמידים יכולים לחוות את היסודות של AFM ולקבל טעימה של המחקר בינתחומי מתאפשר על ידי טכניקה זו עוצמה בתוך טיפוסי 3 - אילוץ זמן 4 שעות סעיף מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
תכנית NSF-MRI (מל"ג: 1,229,103) הוא הודתה למימון הרכישה של מוצרי אלקטרוניקה חדשות שליטה, תוכנה, תאים נוזליים, ושאר ציוד הדרוש כדי להרכיב AFM / STM כפול. אנו מכירים במתקנים המשותפים באוניברסיטת שיקגו תכנית NSF-MRSEC (DMR-0,820,054) לקבלת סיוע עם מכשור AFM, הכשרה, והדמיה, ועל זמן מכשיר שהועמדו על ידי אמצעי רשת חומרי המחקר (DMR-0,820,054). אנחנו במיוחד מודים לד"ר Qiti גואו, ד"ר ג'סטין Jureller, ופרופ 'קה איי לי לברכה לתלמידים שלנו לפני המימון של הצעת NSF-MRI שהביאה את המכשור הדרוש לקמפוס שלנו. אנו מכירים במימון ממענק הכותרת III גזע (ID: P031C110157) הוענק לאוניברסיטת אילינוי צפון מזרח שסיפק מלגות קיץ מחקר לסטודנטים ואנשי סגל, כמו גם תמיכה באספקה מתכלה. לבסוף, אנו מכירים ברוקר-Nano, Inc לתמיכה אינסטרומנטלית המשיכה ורשות reproduce עלילה מציגה את המנגנון של PeakForce QNM ולהשתמש במילה ScanAsyst לתאר את התוכנה האוטומטית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K.
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B.
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A.
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
